一种用于啮齿类动物行为听觉测量的低成本装置

摘要

本文描述了一种快速且低成本的行为学方法，用于测定听觉参数，如听阈、听力损伤或幻觉感知（主观性耳鸣）。该方法利用声学惊吓反应的前脉冲抑制，可借助可编程的模数/数模转换器和压电传感器，在个人计算机上轻松实现。

摘要

在听觉动物研究中，精确掌握实验所涉及动物受试者的基本听觉参数至关重要。这些参数可能包括听觉通路的生理反应特征，例如通过脑干听觉诱发电位（BERA）进行检测。然而，这些方法仅能对与生理参数相对应的听觉感知进行间接且不确定的推断。要评估听觉的感知水平，必须采用行为学方法。在动物模型中使用行为学方法描述感知时，一个潜在的问题是大多数此类方法在对受试动物进行行为测试之前，都需要某种形式的学习范式，例如动物需要学会在听到声音时按压杠杆。由于这些学习范式本身会改变感知过程^1,2，因此它们必然会影响通过这些方法获得的任何关于感知的结果，故需谨慎解读。例外情况是利用反射性反应的实验范式，因为在这些范式中，感知测试前无需进行学习训练。其中一种反射性反应是声学惊跳反射（ASR），在未经训练的动物中，突然的高强度声音可高度可重复地诱发该反射。而这种ASR又会受到先于其出现的声音的影响，影响程度取决于该前置刺激的可感知性：远高于听阈的声音会完全抑制ASR的幅度；接近听阈的声音则仅轻微抑制ASR。这一现象被称为前脉冲抑制（PPI）^3,4，ASR的PPI程度随前脉冲的可感知性逐渐变化。因此，ASR的PPI非常适合用于测定未经训练、未经历学习范式的动物的行为听阈图，用于评估听力损伤，甚至检测这些动物中可能存在的主观耳鸣感知。本文中，我们展示了该方法在一种啮齿类动物模型（参见亦参考文献⁵）——蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）中的应用。该物种是研究正常人类听觉范围内的惊跳反射的知名模式物种（例如⁶）。

方案

1. 设备组装与软件编程

1. 在个人计算机中安装D/A卡例如：NI PCI 6229，美国国家仪器公司）并将其连接至接线盒（例如：BNC-2110，National Instruments），两者均应至少支持一个输入通道和一个输出通道，每个通道的采样率至少为 44.1 kHz。
2. 通过BNC电缆将接线盒的输出端连接至声音放大器（例如：AMP75 宽带功率放大器，Thomas Wulf）
3. 安装一个红外网络摄像头（例如：Grand IP Camera Pro（GrandTec Electronics）用于动物在黑暗环境中的监控。
4. 安装集成开发环境（例如：Matlab）根据给定的流程图编写程序 图1运行于 Matlab 2007b 的版本可向通讯作者免费获取。
5. 在隔音室内，将扬声器安装在桌面上。将扬声器连接至声音放大器。
6. 安装压电传感器（例如 力传感器 FSG15N1A（Honeywell）置于绝缘板上，连接电源，并通过 BNC 电缆将其输出端连接至接线盒输入端；将传感器信号接地。
7. 使用丙烯酸玻璃管制作一个测量室，其尺寸需根据待测啮齿类动物（如沙鼠）的大小进行调整 例如：长15 cm，内径4.3 cm，外径4.8 cm）。在管前端固定一个网孔宽度为0.5 mm的金属筛网，并安装带锁扣机构的缓冲门例如，挂钩）固定到后部。可以使用热熔胶进行固定，对于门，仅将铰链和挂钩的扣环固定在管子上。
8. 在绝缘传感器板上安装与测量管尺寸匹配的泡沫塑料支脚。支脚应支撑测量管的前端和后端，并将测量管抬升至传感器水平位置。确保压电传感器与测量腔之间保持轻微接触。
9. 将传感器板固定，使测量室居中对准扬声器前方，并在其旁边放置一个用于声音控制的麦克风（例如 B&K 型 2669 / B&K型4190连接至测量放大器B&K型2610，全部：Brüel & Kjær）置于动物头部水平位置，以避免干扰管道。
10. 请注意，您的听力测量数据质量取决于声音系统的质量。无论何种情况，都应在首次实验前使用麦克风和测量放大器确定系统的频率传递函数，并在软件中加入校正该频率传递函数的程序，以使扬声器的频谱输出保持平坦。
11. 将网络摄像头与实验装置对齐，以便监测动物行为。

2. 听力阈值（听力图）的行为学测定

1. 从饲养笼中取出动物，将其头部朝前放入管中；关闭门。
2. 将管子放置在泡沫支脚和传感器上。关闭所有光源并关上隔室门。该隔室本身无空调系统，其温度、湿度及其他环境参数与周围实验室保持一致。由于通风设备会产生噪音，因此不建议使用通风换气，但隔室容积足以在数小时内维持动物所需的氧气供应。等待15分钟，使动物适应实验装置。适应期对动物有益，可使其以自身节奏平静下来并熟悉管子。另一方面，多次实验过程中观察到动物在适应期的行为无明显差异，这表明实验前无需额外进行专门的适应训练来让动物熟悉管子和隔室环境。
3. 启动程序并设定刺激参数（另见参考文献⁵）：刺激由不同频率的纯音组成。惊跳刺激必须以足够高的声压级呈现，以可重复地诱发惊跳反应。在本实验室中，我们采用105 dB SPL的强度（刺激持续时间为6 ms，包含2 ms的余弦平方上升和下降斜坡）来诱发蒙古沙鼠的惊跳反应。在惊跳刺激前呈现的测试刺激，则在待测范围内以不同频率和强度呈现，通常从听阈以下至远高于听阈的水平，并覆盖该物种整个可听频率范围。每次试验中，惊跳刺激与测试刺激的频率和持续时间相匹配，两者之间的刺激间间隔设为100 ms。每种测试刺激的频率与强度组合至少重复15次，刺激间间隔随机设定为10 ± 2.5秒（参见图2A，左侧）。后续测试刺激可按随机或非随机顺序呈现。若采用非随机方式（例如，对所有测试频率固定同一测试刺激水平），不同刺激组之间应留出5分钟恢复时间。需注意，所测定的绝对听阈会受刺激随机化方式的影响，但可能发生的听阈相对偏移则不受影响（例如，声损伤后的情况，参见参考文献⁵）。
4. 在分析数据前，从数据集中剔除无效试验（例如，动物在惊跳刺激前发生移动的试验；参见图2B）。
5. 在惊跳刺激后最初的50 ms时间窗内，计算每次单个试验的反应幅度（反应波形中第一个峰值到第一个谷值之间的峰峰值）和反应潜伏期（从刺激开始到反应起始的时间）。
6. 将某一频率下所有有效单次试验按预刺激强度排序后的完整反应幅度数据集，拟合为Boltzmann函数⁷。该Boltzmann函数的50%点即表示该刺激频率下的听阈。

3. 声音创伤与听力损伤的量化

1. 使用盐酸氯胺酮（Ketamin-ratiopharm，Ratiopharm）：96 mg/kg；盐酸赛拉嗪（Rompun 2%，Bayer）：4 mg/kg；硫酸阿托品（Atropinsulfat，B. Braun Melsungen AG）：1 mg/kg；以及生理氯化钠溶液（Berlin-Chemie AG，Berlin），按9:1:2:8的比例配制氯胺酮-赛拉嗪麻醉剂。
2. 以3 ml/kg剂量皮下注射麻醉剂。等待动物进入深度麻醉状态（约5分钟，通过反射检查，例如，使用足底回缩反射）。在测量期间为维持麻醉，使用注射泵以3 ml/kg/hr的速率持续输注麻醉液。使用适当设备监测生命体征（例如，通过摄像头监测呼吸），并将动物置于加热垫上以保持体温。
3. 诱导声学创伤，例如使用高强度纯音：例如，2 kHz、115 dB SPL，持续75分钟。
4. 创伤结束后停止注射泵，将动物置于安静环境中的复苏笼内，并放置于加热垫上使其苏醒。在苏醒过程中定期检查生命体征是否稳定。仅当动物完全清醒后，将其放回饲养笼中。让动物在饲养笼中恢复麻醉影响（至少2天）并充分休息。
5. 重复步骤2.1至2.6。通过计算各频率下听力损失的百分比，比较声创伤前后的听力阈值。所有实验结束后，对动物实施安乐死。

4. 声学幻觉感知测试（主观性耳鸣）

1. 在声创伤前后进行这些测量。
2. 如果动物尚未放置在装置中，请按照 2.1 至 2.2 步骤操作。
3. 可采用多种刺激范式来检测啮齿类动物的主观耳鸣。这些方法的共同原理是检测动物对背景噪声中短暂静音间隙的感知显著性。如果动物能够感知该间隙，则可将其作为测试刺激，以减弱惊吓反应，其原理类似于第2节所述方法。如果动物患有耳鸣（通常在声创伤后出现），耳鸣感知会填充静音间隙，从而降低该间隙的显著性。因此，与健康对照组相比，耳鸣动物的惊吓抑制效应会减弱（前脉冲抑制降低，参见 ⁸）。该感知通过两种略有不同的方案进行测试。
4. 在本文介绍的第一种主观性耳鸣范式中（图2A，居中，参见 ⁹使用以下参数进行刺激：惊跳声音强度为105 dB SPL，频率范围为1至16 kHz，以1个八度为步长；刺激持续时间为6 ms，包含2 ms的余弦平方上升和下降斜坡。实验期间呈现50 dB SPL的白噪声背景，该背景中可包含或不包含一个在惊跳刺激前100 ms出现的15 ms间隙；每种频率和间隙条件至少呈现15次试验。若采用非随机化方案，不同刺激组之间应留出5分钟恢复时间。使用不同的惊跳刺激频率可粗略估计感知到的耳鸣频率。
5. 作为第二种主观性耳鸣范式（图2A，右侧）可采用以下刺激参数：惊跳声音强度为105 dB SPL，双脉冲点击刺激，每个点击持续时间为0.1 ms，点击间间隔0.1 ms，第二个点击相对于第一个点击方向反转。呈现50 dB SPL的带通滤波噪声背景，高斯滤波器带宽为0.5个八度，中心频率以八度为步长，范围从1 kHz至16 kHz。该噪声可呈现或不呈现15 ms的间隙，间隙位于惊跳刺激前100 ms处；每种频率和间隙条件至少呈现15次试验。若采用非随机化方案，不同刺激组之间应留出5分钟恢复时间。使用不同中心频率的带通背景噪声可粗略估计感知到的耳鸣频率。
6. 按照步骤2.4至2.5操作；针对每种测试频率和每种创伤条件，使用参考数据集对所有获取的数据进行归一化处理。 即在声学创伤前后，以纯音惊跳刺激的反应幅度作为参考（参见2.3），该参考值为无任何预刺激条件下的反应幅度。频率由纯音频率或带通滤波噪声的中心频率确定。计算每个参考条件下的平均反应值，并将每个计算得到的反应幅度除以其对应的参考值进行标准化。
7. 通过将间隙条件下的归一化反应幅度除以各测试频率下无间隙条件归一化反应幅度的平均值来计算PPI。
8. 计算每次测试频率下创伤后PPI的百分比变化。

动物的惊吓反应易于产生和分析。图2B展示了一个动物在无预刺激条件下，接受15次105 dB SPL纯音刺激后的典型结果概览。大多数试验为有效试验，无效试验也易于识别（以红色方框标记的试验）。仅基于有效试验计算反应幅度和潜伏期。

典型的动物行为阈值变化如图3A所示。图中展示了使用第2节所述方法获得的一个代表性动物在2 kHz声创伤前（蓝色）和创伤后（红色）的听力图（黄色区域为创伤频率范围）。在2 kHz处可明显观察到听力损失。与主观耳鸣感知相关的结果见图3B，其中以相同动物为例，展示了在创伤频率上下各一个八度音程进行刺激时的归一化反应幅度（见4.5节描述）。通过比较创伤前后存在间隙与无间隙刺激所引发的反应（创伤前为蓝色，创伤后为红色），可判断是否存在潜在的耳鸣感知。在创伤频率以下，反应模式未发生改变；而在创伤频率以上，创伤后间隙效应消失，提示在此频率处存在异常感知。

图 1. 流程图，显示用于获取行为阈值和主观耳鸣数据的程序。请注意，此仅为程序代码的简化版本。缩写：GUI — 图形用户界面；ISI — 刺激间间隔。

图 2. 听觉惊跳反应（ASR）刺激方案。A 所采用的三种不同刺激方案示意图。左图：在惊跳声刺激（红色）之前无任何纯音测试刺激（绿色）的ASR前脉冲抑制（PPI）测量；反应期以蓝色表示。中图：在白噪声背景下，以不同频率的纯音作为惊跳刺激的间隙/噪声范式。右图：在具有不同中心频率的带通滤波背景噪声上，以点击声作为惊跳刺激的间隙/噪声范式。B 采用阈值范式在1 kHz刺激频率下记录的15次试验的典型听觉惊跳反应示例。其中三次试验因动物在刺激开始前已发生移动而被判定为无效（红色方框）。

图 3. 一只动物中惊跳反射（ASR）的典型实验结果。A 在 2 kHz 声音创伤前（蓝色）和创伤后（红色）的行为阈值（黄色区域）。阈值是通过使用Boltzmann函数拐点作为阈值，从PPI调制ASR方案的反应中计算得出。注意，在 2 kHz 处的听力损失超过 66%，而在远离创伤频率的区域，听力阈值反而常出现改善。 B 使用间隙/噪声点击ASR方案（4.5）在 1 kHz 和 4 kHz 中心频率刺激期间的归一化反应振幅（空心圆：单次试验，实心圆：均值，须线：标准差）。数据按创伤前后在噪声中是否存在间隙的试验进行分类。仅在 4 kHz 时，创伤后间隙效应消失，表明在此频率附近存在主观性耳鸣感知。

讨论

我们介绍一种基于声学惊吓反应前脉冲抑制的啮齿类动物听力测量装置，该装置成本低廉且易于搭建，可用于测定行为听阈（即听力图）。 ¹⁰以及主观性耳鸣等听觉幻觉感知 ¹¹尤其是后者的测量已成为多篇近期报告的关注重点 ^8,12,13,14 并且可被视为研究该疾病神经机制所需电生理学研究的一项先决条件。利用该方法，可以区分在声创伤后是否产生主观耳鸣感知的动物，并对这些个体进行进一步研究。 例如，结合初级听觉皮层的电生理记录。

声创伤后惊跳反射数据的关键分析步骤是将数据归一化至在无先前测试刺激条件下可引发的最大惊跳幅度：这尤其有助于区分由听力损失引起的惊跳反应减弱与耳鸣动物的前脉冲抑制（PPI）降低。声创伤的影响会随时间发生变化，动物对其有部分恢复，但大约50%的听力损失是永久性的。与上述文献中仅测试但未用于校准听阈的研究不同，我们尝试通过使用参考值对每个反应幅度进行归一化，以尽量减少各频率听阈差异以及声创伤本身的影响。此外，我们采用两种不同的实验方案来评估可能的耳鸣感知，其中第一种方案（4.4）更适用于创伤后...