检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。
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摘要
摘要
在哺乳动物细胞中实现基因表达的功能性失活，对于研究目的蛋白在各种信号通路中的作用至关重要1,2。然而，在某些情况下，若细胞长期无法耐受组成型基因表达下调，则需要采用条件性基因敲低策略3-5。本文描述了一种构建细胞系的实验方案，该细胞系可实现ACF染色质重塑因子亚基的条件性敲低。这些细胞系有助于确定ACF在腺病毒E4orf4蛋白诱导细胞死亡过程中的作用6。我们将编码针对ACF染色质重塑因子Acf1和SNF2h亚基的短发夹RNA（shRNA）序列克隆至一个含有强力霉素诱导型启动子的质粒中，该质粒同时还携带新霉素抗性基因。在G418存在条件下筛选并分离出具有新霉素抗性的细胞克隆。通过添加强力霉素诱导后，当Acf1或SNF2h的表达水平降低时，将编码E4orf4的质粒或空载体转染至细胞中。为验证shRNA构建体的特异性效应，通过共转染表达Acf1或SNF2h的质粒来恢复其蛋白水平至野生型（WT）水平，这些表达质粒通过引入同义突变而对shRNA产生抗性。通过DAPI染色实验检测E4orf4在不同样本中诱导细胞死亡的能力，该实验通过测定转染细胞群体中呈现凋亡形态细胞核的出现频率来进行评估7-9。
本方案可用于确定各种蛋白质在其组成型敲低可能导致细胞死亡的情况下，与其蛋白伴侣共同诱导细胞死亡过程中的功能贡献。
方案
1. 诱导型细胞系的构建
- 实验前，需确定能够杀死所有用于制备目标细胞系的细胞的最低浓度药物G418。为此，将所选细胞以70%融合度接种于多个重复培养皿中，使用实验中将采用的培养基，并加入浓度递增的G418（0–1,000 μg/ml）。每日观察细胞，以确定能有效杀死细胞的最低G418浓度。细胞死亡通常在3–7天内出现。
- 在构建细胞系之前，建议通过瞬时转染实验验证表达shRNA的质粒可在一定程度上降低目标基因的表达水平。该验证可在任何高效转染的细胞系中进行。
- 将T-REx-293细胞以约5×106个细胞/10 cm培养皿的密度接种于8 ml DMEM培养基中（含10%经Tet系统认证的FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和5 μg/ml杀稻瘟菌素）。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 次日转染前，更换为8 ml新鲜培养基。
- 使用10 μg编码Acf1或SNF2h shRNA的pSuperior.neo+GFP质粒（图1）进行转染，该质粒的shRNA由四环素诱导型H1启动子驱动，同时携带与GFP融合的新霉素抗性基因，由组成型PGK启动子驱动。将DNA加入500 μl 150 mM NaCl中。另取500 μl 150 mM NaCl，按每μg DNA加入2 μl jetPIE试剂。将jetPIE溶液加入D....
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讨论
特异性基因表达的敲低是研究某种蛋白质在调控通路中作用的重要方法。由于组成型敲低必需基因的表达会对细胞增殖产生负面影响，因此对这类基因的研究可能需要采用瞬时转染小干扰RNA（siRNA）或应用可诱导的稳定型敲低系统。本文所述的可建立具有药物诱导shRNA表达能力的稳定细胞系的方法，相较于瞬时转染（其在许多细胞系中转染效率较低）以及需反复制备病毒（有时还需额外短期筛选）的方法具有优势。一旦建立成功，这些细胞系无需进一步处理。此外，在我们的实验中，shRNA载体的瞬时转染在降低基因表达方面的效率明显低于在选定稳定细胞系中诱导shRNA表达的效果。然而，建议在每次实验中均需确认药物诱导的基因敲低效果仍然有效。使用稳定细胞系进行条件性基因敲低的一个潜在缺点是，细胞系在筛选过程中可能已获得其他遗传或表型改变，从而可能影响实验结果。为克服这一问题，可同时在两个平行的细胞系中进行实验，或通过引入表达shRNA抗性野生型（WT）蛋白的质粒来逆转敲低效应。若野生型蛋白能够消除shRNA的作用，则可排除克隆特异性效应的影响。
经典的、依赖半胱天冬酶（caspase）的细胞凋亡可通过多种方法检测，包括检.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到了以色列科学基金会（ISRAEL SCIENCE FOUNDATION，资助号 399/11）、德国-以色列项目合作框架下德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）以及拉帕波特医学科学研究所（Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高糖DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet系统认证胎牛血清（FBS） | Clontech | 631106 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | Gibco | 15140 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293细胞 | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| 杀稻瘟菌素（blasticidin） | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP质粒 | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| 强力霉素（doxycycline） | Sigma | D9891 | |
| 多聚甲醛（paraformaldehyde） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
参考文献
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-med....
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