E4orf4诱导的细胞死亡的击倒效果的基因表达和测量条件击倒细胞系的制备

Summary

ACF染色质重塑因子E4orf4诱导的细胞死亡的贡献进行了测量。该协议包括在多西环素治疗诱导有条件击倒的ACF的亚基ACF1和SNF2h的细胞克隆的选择，使用的DAPI检测测量E4orf4-诱导的细胞死亡的诱导的细胞系。

Abstract

的研究是非常重要的贡献感兴趣的各种途径的^1,2的蛋白质在哺乳动物细胞中的基因表达的功能失活。然而，有条件击倒的基因的表达是必需的情况下，当没有被细胞的耐受性，构击倒了很长一段的时间^3-5。在这里，我们描述了一个协议，准备允许有条件的ACF染色质重塑因子亚基敲除的细胞株。这些细胞株诱导的细胞死亡的ACF的贡献便于确定由腺病毒E4orf4蛋白^6。编码为ACF1和SNF2h亚基的ACF染色质重塑因子的短发夹RNA的序列进行克隆到一个多西环素诱导型启动子中还含有新霉素抗性基因的基因的质粒的旁边。选择的新霉素抗性细胞克隆在G418的存在下，和隔离。将所得的细胞系诱导的强力霉素治疗，而一旦​​ACF1或SNF2h表达水平降低，细胞转染的质粒编码E4orf4或空载体。确认具体的shRNA结构的影响，ACF1或SNF2h蛋白水平恢复到WT水平的转染与表达质粒ACF1或SNF2h呈现抵抗的shRNA引入沉默突变。通过DAPI染色的测定，其中的频率测定细胞核与细胞凋亡在转染的细胞群体的形貌的外观^7-9 E4orf4的能力，诱导细胞死亡的各种样品中测定。

这里所描述的协议，可用于测定各种蛋白质的功能贡献的情况下诱导细胞死亡的蛋白质的合作伙伴，构击倒时，可能是电池致命的。

Protocol

1。产生的诱导性细胞系

1. 实验之前，人们需要找到所有用于制备所需的细胞系的细胞死亡的药物G418的最小浓度。为此目的，板中给出的细胞在培养基中，将用于在实验过程中，添加的G418的浓度增加（0-1,000微克每毫升）在70％汇合的几个重复板。监控每天来确定的最低G418浓度，有效地杀死细胞的细胞。细胞死亡是内观察3-7天。
2. 在此之前产生的它建议以验证表达的shRNA的质粒瞬时转染实验，可以在一定程度上减少所研究的基因的表达的细胞株。这可以在任何可有效地转染的细胞系，完成。
3. 板T-REX-293细胞在每10cm的板的密度为约5×10 ^6个细胞在8毫升的DMEM培养基（含有10％四环素学年茎核准FBS，2mM L-谷氨酰胺，100单位每ml青霉素和0.1毫克每毫升链霉素，5微克每毫升含杀稻瘟素）。孵育过夜的板在37℃下，5％CO _2。
4. 翌日，改变介质8毫升新鲜培养基转染前。
5. 转染的细胞，用10微克pSuperior.neo + GFP质粒（ 图1）的编码ACF1或SNF2h短发夹驱动四环素诱导型H1启动子，以及稠合到GFP和由一个构PGK启动子驱动的新霉素抗性基因。添加的DNA到500μl的150 mM NaCl。加入另一等分的500微升的150 mM NaCl，2微升每微克DNA jetPIE试剂。的涡流添加的jetPIE的解决的DNA，拌匀。在室温下孵育15分钟。轻....

Discussion

敲除特定基因的表达，是一个重要的贡献的一种蛋白质调控途径的调查方法。由于构击倒必需基因的表达产生负面影响细胞的增殖，他们的研究可能需要稳定的条件击倒系统的siRNA或应用程序无论是短暂的介绍。生成的稳定的细胞系的能力对于药物引起的这里描述的shRNA表达，提供了一个优势，在许多细胞系中，这可能不是高效的瞬时转染，并在使用的病毒，需要重复制备，并有时一个额外的短长期的选择。一旦生成，细胞株，不需要额外的准备。此外，在我们的手中，瞬时转染的shRNA结构相比，在选定的shRNA表达细胞株的诱导效率较低撞倒基因表达。这是建议编然而，以确定在每个实验中，药物引起的击倒仍然很有效率。使用稳定的细胞系基因表达的条件击倒一个潜在的缺点是，他们可能获得额外的变化，在选择过程中，可能会影响实验结果。然而，为了克服这个问题，人们可以进行实验在两个平行的细胞系或表达短发夹耐WT蛋白的质粒通过引入扭转击倒效果。如果WT蛋白消除的shRNA的效果，那么无性系的效果可以被排除。

古典，caspase依赖的细胞凋亡，可检测多种方法，包括检测caspase激活，膜联蛋白-V染色，染色隧道的一个子G1的细胞群，检测.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
高糖DMEM	Gibco公司	41965
春节体系认证FBS	Clontech公司	631106
L-谷氨酰胺	Gibco公司	25030
笔链球菌	Gibco公司	15140
0.25％胰蛋白酶-EDTA	Gibco公司	25200
T-REX-293细胞	Invitrogen公司	R710-07
G418	西格玛	A1720
杀稻瘟	Invit罗根	R210-01
pSuperior.neo + GFP质粒	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus转染	101-40
多西环素	西格玛	D9891
多聚甲醛	电子显微镜科学	15710
4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）	西格玛	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01