检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。
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摘要
摘要
在哺乳动物细胞中实现基因表达的功能性失活，对于研究目的蛋白在各种信号通路中的作用至关重要1,2。然而，在某些情况下，若细胞长期无法耐受组成型基因表达下调，则需要采用条件性基因敲低策略3-5。本文描述了一种构建细胞系的实验方案，该细胞系可实现ACF染色质重塑因子亚基的条件性敲低。这些细胞系有助于确定ACF在腺病毒E4orf4蛋白诱导细胞死亡过程中的作用6。我们将编码针对ACF染色质重塑因子Acf1和SNF2h亚基的短发夹RNA（shRNA）序列克隆至一个含有强力霉素诱导型启动子的质粒中，该质粒同时还携带新霉素抗性基因。在G418存在条件下筛选并分离出具有新霉素抗性的细胞克隆。通过添加强力霉素诱导后，当Acf1或SNF2h的表达水平降低时，将编码E4orf4的质粒或空载体转染至细胞中。为验证shRNA构建体的特异性效应，通过共转染表达Acf1或SNF2h的质粒来恢复其蛋白水平至野生型（WT）水平，这些表达质粒通过引入同义突变而对shRNA产生抗性。通过DAPI染色实验检测E4orf4在不同样本中诱导细胞死亡的能力，该实验通过测定转染细胞群体中呈现凋亡形态细胞核的出现频率来进行评估7-9。
本方案可用于确定各种蛋白质在其组成型敲低可能导致细胞死亡的情况下，与其蛋白伴侣共同诱导细胞死亡过程中的功能贡献。
方案
1. 诱导型细胞系的构建
- 实验前，需确定能够杀死所有用于制备目标细胞系的细胞的最低浓度药物G418。为此，将所选细胞以70%融合度接种于多个重复培养皿中，使用实验中将采用的培养基，并加入浓度递增的G418（0–1,000 μg/ml）。每日观察细胞，以确定能有效杀死细胞的最低G418浓度。细胞死亡通常在3–7天内出现。
- 在构建细胞系之前，建议通过瞬时转染实验验证表达shRNA的质粒可在一定程度上降低目标基因的表达水平。该验证可在任何高效转染的细胞系中进行。
- 将T-REx-293细胞以约5×106个细胞/10 cm培养皿的密度接种于8 ml DMEM培养基中（含10%经Tet系统认证的FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和5 μg/ml杀稻瘟菌素）。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 次日转染前，更换为8 ml新鲜培养基。
- 使用10 μg编码Acf1或SNF2h shRNA的pSuperior.neo+GFP质粒（图1）进行转染，该质粒的shRNA由四环素诱导型H1启动子驱动，同时携带与GFP融合的新霉素抗性基因，由组成型PGK启动子驱动。将DNA加入500 μl 150 mM NaCl中。另取500 μl 150 mM NaCl，按每μg DNA加入2 μl jetPIE试剂。将jetPIE溶液加入DNA中，充分涡旋混匀。室温孵育15分钟。将DNA复合物轻柔滴加至含有70–80%融合度细胞的10 cm培养皿中。将培养皿放回培养箱。
- 次日，更换为筛选培养基（即上述DMEM培养基，额外添加500 μg/ml G418）。
- 接下来两周内持续观察细胞，并每3–4天更换一次新鲜筛选培养基，直至出现肉眼可见的克隆。
- 在分离克隆前，预先在24孔板中加入筛选培养基。
- 肉眼识别克隆，并用彩色标记笔在培养皿底部标记其位置。在显微镜下确认各克隆之间分离良好。
- 在无菌操作台中，吸除培养皿中的培养基，用预温的PBS轻轻冲洗，彻底吸净残留液体。向培养皿中的一个克隆加入3 μl 0.25%胰蛋白酶/EDTA。反复吹打直至细胞脱落，然后将其转移至24孔板中的一个孔。对培养皿中其他多个克隆重复此操作。
- 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养至孔内细胞长满。随后将每个原始克隆来源的细胞分种至三个不同的12孔板中的各一个孔，并过夜培养。
- 次日，向其中一个12孔板更换含1 μg/ml多西环素的培养基（多西环素母液用双蒸水配制，浓度为1–5 mg/ml）；向对照板更换不含多西环素的培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续孵育72小时。
- 从每个细胞克隆的处理组和未处理组各取一个孔收集细胞，用于制备蛋白提取物并进行Western blot分析，以评估Acf1或SNF2h的敲低效率。使用抗Acf1或抗SNF2h抗体，以及作为上样对照的抗α-微管蛋白（alpha-Tubulin）抗体。将第三个未处理孔中的细胞用于扩增那些在加入多西环素后目标蛋白水平降低至少50%的细胞克隆。将这些细胞分装后以90% FBS、10% DMSO冻存，以备后续使用。
2. 诱导基因敲低与转染
- 在10 cm培养皿中，将细胞接种于选择性培养基中。向其中一半培养皿加入浓度为1 μg/mL的多西环素，并在37°C、5% CO2条件下培养48–72小时（参见图4）。
- 培养48–72小时后，用胰蛋白酶消化各组细胞，计数后将每组1.5×106个细胞接种至6 cm培养皿中，培养基成分相同，根据需要加入或多西环素。在37°C、5% CO2条件下过夜培养。实验设计时应确保第2.1步中的每组培养皿可为12个6 cm培养皿提供细胞，包括每个时间点DAPI检测的两个重复样本，以及每个样本用于Western blot分析的一个培养皿（参见图4）。
- 次日，使用以下质粒组合对6 cm培养皿中的细胞进行转染：1 μg空质粒或编码E4orf4的等量质粒，联合4 μg表达Acf1-GFP或SNF2h-GFP的载体（该载体通过引入同义突变使其对细胞克隆中的shRNA产生抗性），或3 μg相应的空载体与1 μg表达GFP的质粒（图4）。按照前述方法使用jetPIE试剂（每5 μg DNA使用10 μl）配制转染混合物。每个样本需为三个培养皿配制转染混合物。
- 将DNA与jetPIE试剂在室温下孵育15分钟后，轻轻将每种转染混合物中的DNA复合物等量加入三个6 cm培养皿中，在37°C、5% CO2条件下过夜孵育。
3. 转染细胞中的 DAPI 检测
- 第二天，从每个样本的一块培养板中提取蛋白质，进行 Western 印迹分析，以确认 Acf1 或 SNF2h 已被有效敲低，并且不同样本中 E4orf4 的表达水平相等。
- 吸除用于 DAPI 染色实验的培养板中的培养基，用 PBS 轻柔洗涤一次，然后加入 1 ml 用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛溶液覆盖细胞。多聚甲醛溶液的配制及细胞处理操作均应在化学通风橱中进行。室温下静置孵育 15 分钟，不摇动。
- 吸除多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤三次，每次在室温下轻轻摇动 5 分钟。加入预冷至 -20 °C 的 80% 乙醇，于 -20 °C 孵育至少 1 小时。只要密封良好以防止乙醇挥发和样本干燥，培养板可在 -20 °C 的乙醇中保存数天。
- 吸除乙醇，用 PBS 洗涤细胞两次，再用 PBS-BT（含 0.5% BSA 和 0.05% Tween-20 的 PBS）洗涤一次，每次在室温下轻轻摇动 5 分钟。
- 为防止非特异性抗体结合，将细胞在含 10% 山羊血清的 1 ml PBS-BT 缓冲液中室温摇动孵育 20 分钟进行封闭。随后用 PBS-BT 洗涤两次，每次 5 分钟。
- 将细胞与一抗（本实验中为 E4orf4 特异性抗体）在 1 ml PBS-BT 中室温摇动孵育 1 小时。然后用 PBS-BT 洗涤两次，再用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。
- 在避光条件下，将细胞与适当的荧光标记二抗及终浓度为 0.5 μg/ml 的 DAPI 溶于 1 ml PBS-0.1% BSA 中，室温摇动孵育 40 分钟。随后用 PBS 洗涤 5 分钟，吸净液体并倒置培养板 1 小时至过夜，确保完全干燥。然后使用 Fluoromount-G 封片剂将盖玻片封固于细胞上。将培养板置于 4 °C 避光保存，直至进行凋亡细胞核计数。
- 请同事将各培养板重新编号，以便对不同样本中的凋亡细胞核进行盲法计数。
- 在正置荧光显微镜下以 400X（空气镜）或 630X（油镜）放大倍数观察细胞。识别各样本中表达特定蛋白的转染细胞，并统计转染细胞群体中经 DAPI 染色显示的染色质凝聚或断裂的细胞核数量。观察多个视野，总计数不少于 200 个转染细胞。
- 计算转染细胞群体中具有凋亡形态的细胞核所占百分比。重复实验 2–3 次，每次设复孔，以评估各组样本间差异的统计学显著性。
4. 代表性结果
获得成功实现基因表达条件性敲低的克隆的效率因所涉及的基因而异。在我们的实验中，针对Acf1检测了12个克隆，其中7个获得成功；针对SNF2h检测了18个克隆，其中6个获得成功。图2展示了筛选出的细胞克隆的代表性培养皿图像（图2A）以及单个克隆的图像（图2B）。图3展示了一张代表性蛋白印迹图，该图所用蛋白样品来自在有或无多西环素条件下培养72小时的不同克隆细胞。印迹膜使用抗SNF2h抗体和抗alpha-Tubulin抗体进行染色，后者作为上样对照。其中两个克隆（编号4和5）在多西环素诱导后表现出SNF2h蛋白水平的显著降低。需要注意的是，尽管用于构建细胞系的pSuperior.neo+GFP质粒（图1）编码一个neo-GFP融合蛋白，但在稳定细胞系中绿色荧光非常微弱，因此在这些细胞中瞬时转染的其他GFP融合蛋白的表达可明显高于背景荧光水平。
在细胞克隆中进行实验以检测Acf1或SNF2h敲低对E4orf4诱导的细胞死亡影响的示意图如图4所示。通过多西环素处理实现基因表达敲低所需的时间可能因目标蛋白的稳定性不同而有所差异。对于Acf1和SNF2h，需要72小时的处理才能在蛋白水平上实现有效的敲低。
图5 显示了表达 E4orf4 和 GFP 的细胞发生死亡的示例，其特征表现为 DAPI 染色的细胞核出现浓缩或碎裂的形态。图6 展示了一项代表性实验的结果，表明由多西环素诱导的 Acf1 沉默导致 E4orf4 诱导的细胞死亡增加（图6A）。这种增加并非由 E4orf4 水平升高所致（图6B）。此外，在多西环素诱导的细胞中恢复 Acf1 表达后，E4orf4 的毒性增加被减弱，恢复至未诱导细胞中观察到的水平（图6）。
图 1. pSuperior.neo+GFP 质粒的图谱。该图谱显示了由四环素诱导型 H1 启动子驱动的 shRNA 表达，以及由 PGK 启动子驱动的 neo-GFP 融合蛋白表达。该图谱改编自 OligoEngine 公司的 pSuperior 使用手册。
图 2. 新霉素抗性菌落的鉴定。 图中显示了含有菌落的平板（A）和单个菌落（B）的图像。这些菌落是通过在含新霉素的选择性培养基中培养细胞 14 天后获得的。
图 3. 所选克隆中基因敲低效率的检测。 在含有新霉素的培养基中筛选出的多个克隆细胞被接种至两个重复孔中。每个样本的一个孔用多西环素诱导（+），另一个孔不作处理（-）。诱导72小时后提取蛋白，并进行SDS-PAGE电泳分离。Western印迹依次使用抗SNF2h抗体和抗α-微管蛋白抗体（作为上样对照）进行染色，结果显示了诱导组与对照组细胞中SNF2h的表达水平。
图 4. 典型基因敲低-DAPI 检测实验的设计方案。图中展示了实验的连续步骤，包括使用多西环素处理以实现 Acf1 或 SNF2h 的基因敲低，转染以恢复 Acf1 或 SNF2h 的表达或引入空载体，并将 E4orf4 或相应的空载体导入细胞，以及对结果进行分析。经多西环素处理的培养板以红色标示（Dox），对照组培养板以蓝色标示。 点击此处查看高清大图。
图 5. 使用 DAPI 检测 E4orf4 诱导的细胞死亡。 接受了 图 4 中所述各种处理的细胞被固定，并用 E4orf4 特异性抗体和 DAPI 染色，以显示转染细胞的细胞核。本图来自表达 E4orf4 和对照 GFP 蛋白的样本。（A）GFP。（B）E4orf4。（C）DAPI。（D）合并图像。白色箭头标记了表达 GFP 和 E4orf4 且细胞核呈现凋亡形态的转染细胞。红色箭头标记了形状不规则但不被计为凋亡细胞核的细胞核。星号标记了处于有丝分裂期或刚完成分裂的细胞核。
图 6. Acf1 沉默增强 E4orf4 诱导的细胞死亡。（A）使用四环素诱导型启动子表达 Acf1-shRNA 的 T-REx-293 衍生细胞系在添加多西环素（+Dox）或不添加（-Dox）的条件下进行诱导。三天后，细胞转染表达 E4orf4（+E4orf4）或空载体（-E4orf4）的质粒，同时共转染空载体或表达 GFP 标签 Acf1 的质粒；该 Acf1 因引入沉默突变而对 shRNA 具有抗性。转染 24 小时后固定细胞，并用 E4orf4 抗体和 DAPI 染色。通过上述 DAPI 检测法测量细胞死亡的诱导情况，并确定具有浓缩或断裂细胞核的转染细胞百分比。结果显示一个具三个重复的代表性实验，误差线代表标准差。（B）来自平行培养板的细胞被收集用于 Western 印迹分析。印迹膜使用 E4orf4、GFP 和 Acf1 抗体进行染色。内源性 Acf1 和 Acf1-GFP 在两个独立图面板中显示。
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讨论
特异性基因表达的敲低是研究某种蛋白质在调控通路中作用的重要方法。由于组成型敲低必需基因的表达会对细胞增殖产生负面影响，因此对这类基因的研究可能需要采用瞬时转染小干扰RNA（siRNA）或应用可诱导的稳定型敲低系统。本文所述的可建立具有药物诱导shRNA表达能力的稳定细胞系的方法，相较于瞬时转染（其在许多细胞系中转染效率较低）以及需反复制备病毒（有时还需额外短期筛选）的方法具有优势。一旦建立成功，这些细胞系无需进一步处理。此外，在我们的实验中，shRNA载体的瞬时转染在降低基因表达方面的效率明显低于在选定稳定细胞系中诱导shRNA表达的效果。然而，建议在每次实验中均需确认药物诱导的基因敲低效果仍然有效。使用稳定细胞系进行条件性基因敲低的一个潜在缺点是，细胞系在筛选过程中可能已获得其他遗传或表型改变，从而可能影响实验结果。为克服这一问题，可同时在两个平行的细胞系中进行实验，或通过引入表达shRNA抗性野生型（WT）蛋白的质粒来逆转敲低效应。若野生型蛋白能够消除shRNA的作用，则可排除克隆特异性效应的影响。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到了以色列科学基金会（ISRAEL SCIENCE FOUNDATION，资助号 399/11）、德国-以色列项目合作框架下德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）以及拉帕波特医学科学研究所（Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高糖DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet系统认证胎牛血清（FBS） | Clontech | 631106 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | Gibco | 15140 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293细胞 | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| 杀稻瘟菌素（blasticidin） | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP质粒 | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| 强力霉素（doxycycline） | Sigma | D9891 | |
| 多聚甲醛（paraformaldehyde） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
参考文献
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