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方法文章

长期嗅觉适应的分子读出 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/4443

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2012年12月22日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

本文内容

摘要

本文描述了秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）长期嗅觉适应的一种分子读出方法。蛋白激酶G（EGL-4）对于主要感觉神经元对AWC中稳定的适应反应是必需的。在长时间气味暴露期间，EGL-4会从细胞质易位至AWC神经元的细胞核内。

摘要

在持续刺激下，大多数感觉神经元会通过降低对信号的敏感性来适应其反应。这种适应反应有助于调节注意力，同时保护细胞免受过度刺激。嗅觉回路中的适应现象 秀丽隐杆线虫 首次由 Colbert 和 Bargmann 描述1,2在此，作者定义了嗅觉适应范式的参数，并利用这些参数设计了一项遗传筛选实验，以分离出在适应由双侧翼细胞C型（AWC）感觉神经元感知的挥发性气味能力方面存在缺陷的突变体。当野生型 秀丽隐杆线虫 动物暴露于一种由AWC感知的吸引性气味3 30分钟后，它们会对气味产生适应性反应，随后在约1小时的趋化行为实验中忽略该适应性气味。当野生型 秀丽隐杆线虫 动物暴露于一种由AWC感知的吸引性气味约1小时后，在随后的趋化行为实验中会对该适应性气味忽略长达约3小时。这两种阶段的嗅觉适应现象在 秀丽隐杆线虫 被描述为短期嗅觉适应（由30分钟气味暴露诱导）和长期嗅觉适应（由60分钟气味暴露诱导）。后续来自L'Etoile的研究 等人，4 揭示了一种名为EGL-4的蛋白激酶G（PKG），该蛋白在AWC神经元中对短期和长期嗅觉适应均是必需的。EGL-4蛋白含有一段核定位序列，该序列对AWC神经元中的长期嗅觉适应反应至关重要，但在短期嗅觉适应反应中则非必需。4通过将EGL-4与绿色荧光蛋白标记，可在长时间气味暴露期间可视化EGL-4在AWC中的定位。利用这种功能完整的GFP标记EGL-4（GFP::EGL-4）分子，我们已能够建立AWC中长期嗅觉适应的分子读出方法5利用这种嗅觉适应的分子读出方法，我们能够开展正向和反向遗传筛选，以鉴定在 AWC 神经元中表现出 GFP::EGL-4 亚细胞定位模式缺陷的突变动物6,7本文描述了以下内容：1）表达GFP::EGL-4的动物构建；2）用于长期气味诱导核转位检测的动物培养方案；以及3）长期气味诱导的核转位事件及其恢复（再敏感化）过程的评分方法。

方案

1. 构建表达GFP标记EGL-4的动物

  1. 在 odr-3 基因启动子下克隆翻译融合蛋白 GFP::EGL-4（使用起始密码子上游 2678 bp 的序列）：(p)odr-3::GFP::EGL-4。odr-3 启动子驱动在纤毛神经元对 AWA、AWB、AWC 中的表达，并在 ASH 中微弱表达。
  2. 将质粒 (p)odr-3::GFP::EGL-4 以 50 ng/μl 的浓度，与共注射标记物一起注射到野生型（N2）动物中，采用标准的生殖系转化技术8：(p)ofm-1::GFP9（25 ng/μl）和 (p)odr-1::dsRed10（25 ng/μl）。odr-1 启动子驱动在 AWC 和 AWB 纤毛神经元对中的表达，ofm-1 启动子驱动在体腔细胞中的表达。
  3. 对表达第 1.2 步所述染色体外阵列的转基因动物进行紫外线（UV）/三甲基补骨脂素（TMP）整合实验方案11。
  4. 通过漂白法同步动物12，并在含有 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）平板上培养至 L4 阶段。用 M9 缓冲液冲洗 L4 动物以去除 NGM 平板上的 OP50 E. coli 细菌。
  5. 去除 M9 缓冲液，向 1.5 ml 微离心管中的虫体沉淀加入 50–100 μl 浓度为 30 μg/ml 的 TMP 工作液。用铝箔包裹 1.5 ml 微离心管以避光，并在铝箔包裹的管中轻轻旋转孵育 15 分钟。将含有 TMP/线虫的溶液转移至一个未接种的大 NGM 平板上。
  6. 使用 Stratalinker 2400 仪器，将 NGM 平板上的线虫暴露于 350 μJ(X100) 的紫外线照射下。然后将线虫转移至含 OP50 的 NGM 平板，并在黑暗中孵育 5 小时。
  7. 挑选 50 只转基因线虫，分配至约 10 个接种过的平板（每板 2–5 只）。将 P0 代线虫每 24 小时转移至新平板，持续 3 天。
  8. 从每个 F1 平板中挑选 250 只克隆 F1 动物（每板 1 只），并从每个 F1 平板克隆出 2–4 只 F2 动物。通过解剖荧光显微镜观察 (p)ofm-1::GFP 的表达模式，检查 F3 代动物，筛选出具有 100% 遗传率的品系。
  9. 将最终整合的品系与野生型 N2 动物进行 5 次回交。我们将最终整合的品系命名为 pyIs500，将 GFP 标记的 EGL-4 分子称为 GFP::EGL-4。

2. 核转位实验用动物的培养与维持

  1. 培养 pyIs500 在25 °C下，将动物饲养于接种了OP50的标准10 cm NGM平板上（NGM配方见下文） E. coli 细菌13 (图1).
  2. 第1天，挑选四到五只L4 pyIs500 将培养在25 °C下的平板中的动物转移至五个独立的10 cm OP50平板 大肠杆菌 接种平板，并在 25 °C 下培养（每板接种 4–5 条 L4 期动物）。
  3. 第4天，清洗成年群体 pyIs500 使用S-基础缓冲液（配方见下文）从大型NGM平板上洗脱线虫。请使用一次性玻璃移液管转移线虫，因为它们会黏附在塑料移液头的内壁上。

3. 长期气味诱导的核转位实验

  1. 用 S-Basal 缓冲液清洗 pyIs500 线虫 3 次，以去除细菌。清洗过程中不要进行离心，而是让线虫在静置的 1.5 ml 微量离心管中依靠重力自然沉降。必须确保彻底清除所有细菌，并保证 NGM 平板无污染，因为残留的细菌会对转位实验结果产生不利影响。此外，我们发现对 1.5 ml 微量离心管进行高压灭菌后，管内壁会产生“粘性”现象，导致线虫附着在管壁上，因此应使用未经高压灭菌的 1.5 ml 微量离心管。
  2. 在线虫沉降期间，配制适应溶液。取 100 ml S-Basal 缓冲液加入 100 ml 量筒中。将待用的气味物质加入 S-Basal 缓冲液中，并用封口膜密封量筒口。若进行苯甲醛适应处理，则向 100 ml S-Basal 中加入 7.5 μl 苯甲醛；若进行丁酮适应处理，则向 100 ml S-Basal 中加入 11 μl 2-丁酮。轻轻颠倒量筒（切勿振荡）30 次，使 S-Basal 与气味物质形成均匀乳液。
  3. 最后一次 S-Basal 清洗后，让线虫自然沉降并吸除全部液体。将其中一支管标记为“+ve”或“adapt”（适应组），另一支管标记为“-ve”或“unadapt”（未适应对照组）。向适应组微量离心管（+ve）中加入 1 ml 适应溶液，向未适应对照组微量离心管（-ve）中加入 1 ml S-Basal 缓冲液。每管中的线虫数量应尽量控制在 100 至 200 条之间。经过一定练习后，可通过肉眼大致估算沉淀中线虫的数量。
  4. 为每支微量离心管安装 1.5 ml 管盖保护帽（防止管盖弹开），并将管子置于旋转仪上孵育 80 分钟。我们发现，气味暴露时间在 60 分钟至 80 分钟之间均可产生相似的结果（均可诱导长期适应反应）。然而，在我们的实验条件下，80 分钟的暴露时间结果更为稳定。因此，所有长期适应实验均标准化为采用 80 分钟的气味暴露时间（图 2）。
  5. 80 分钟后，用 S-Basal 缓冲液清洗线虫 3 次。每次清洗之间均依靠重力使线虫自然沉降。

4. 短期气味诱导的核转位检测

  1. 对于短期气味适应，采用与长期气味诱导转位实验相同的方案（步骤 3.1-3.4），但将pyIs500动物在适应气味中孵育的时间由80分钟改为30分钟。下文所述的气味诱导核转位实验的定量分析方法（步骤5）适用于长期和短期暴露。

5. 气味诱导的核转位事件评分

  1. 通过将琼脂糖溶解于dH2O中，制备含有5 mM叠氮化钠（NaN3）的2%琼脂糖垫。在载玻片上滴加一滴含NaN3的熔融琼脂糖，立即盖上另一张载玻片以压平琼脂糖液滴。静置30秒后，轻轻分开两张载玻片，使其中一张载玻片上留下厚度约为1 mm的平整琼脂糖垫。
  2. 在S-Basal溶液最后一次洗涤后，让线虫在1.5 ml离心管中沉降，并吸除所有液体。随后将线虫逐滴滴加到若干载玻片的琼脂糖垫上。每张载玻片上的线虫数量应控制在50至100条之间。每张载玻片上线虫过多会增加评分难度，并常在蓝光激发后产生散射荧光。可用小块Kim-wipe纸从琼脂糖垫上吸除多余液体。将一块0.5 mm厚的盖玻片置于琼脂糖垫上，静置2分钟，使NaN3充分麻醉并固定线虫。注意：评分完成后可将线虫从载玻片上回收。若将线虫转移至接种了大肠杆菌的NGM平板上的M9缓冲液液滴中，约1小时后可从NaN3麻醉状态中恢复。
  3. 此时，每位实验人员必须设计一套标记系统，以区分实验组（+ve）载玻片与对照组（-ve）载玻片，并将载玻片交由另一名不知分组信息的人员进行盲法评分，以排除实验者偏倚。
  4. 使用配备10X、40X和63X物镜及GFP/RFP滤光片的正置荧光显微镜，对每张载玻片上的50至100条线虫进行观察评分。首先，在10X物镜下使用明场照明定位线虫；随后关闭明场光源，切换至RFP滤光片以定位AWC神经元。(p)odr-1::dsRed在AWB和AWC神经元中表达，AWC神经元的细胞体呈明显的椭圆形，而AWB神经元的细胞体较小且呈圆形（图2）。
  5. 定位AWC细胞体后，切换至GFP滤光片，记录GFP:EGL-4的定位模式为细胞核内或细胞质内。使用计数器可使实验人员在评分过程中无需移开视线。注意：步骤5.1–5.5需在至少三个独立实验日重复进行，以获得具有统计学意义的数据（图1–2）。

6. 长期气味适应恢复过程中监测GFP标记的EGL-4

  1. 在步骤3.5之后，将携带pyIs500的动物群体分成多个等份，在时间点零（即暴露80分钟后）以及多个后续时间点，分别评分AWC神经元中GFP::EGL-4在细胞核与细胞质中的分布情况（图3）。
  2. 使用一次性玻璃移液管将对照组（-ve）和实验组（+ve）动物转移至NGM平板上。
  3. 让动物恢复不同时间段后，参照步骤5.1至5.5的方法，在每个时间点重新观察GFP::EGL-4在AWC中的定位情况。

7. 材料

NGM 平板：每 1 L 加入 1 L ddH2O 中：21 g Bacto-琼脂；3 g 氯化钠（NaCl）；2.5 g Bacto-蛋白胨。高压灭菌培养基。灭菌后，将琼脂冷却至温度降至 54 °C。加入以下溶液：25 ml 1 M 磷酸钾缓冲液；1 ml 1 M 硫酸镁（MgSO4）；1 ml 1 M 氯化钙（CaCl2）；1 ml 胆固醇乙醇溶液（5 mg/ml 储存液）。

1 M 磷酸氢二钾 K2HPO4 174.2 g/mol： 配制 500 ml：在 400 ml ddH2O 中溶解 87.1 g 磷酸氢二钾 K2HPO4，用 ddH2O 定容至 500 ml。使用 500 ml 无菌过滤装置过滤除菌。

1 M 单碱基 KH2PO4 136.1 g/mol： 配制 1 L 溶液：取 800 ml ddH2O，溶解 136.1 g 单碱基 KH2PO4，用 ddH2O 定容至 1 L。使用 500 ml 无菌过滤装置过滤除菌。

1 M 磷酸钾（K3PO4）缓冲液 pH 6.0：配制 1 L：在 1 L 无菌滤器装置中加入 868 ml 的 1 M 一碱磷酸二氢钾（KH2PO4）。待溶液过滤完毕后，加入 132 ml 的 1 M 二碱磷酸氢二钾（K2HPO4）。待所有液体完成过滤。移除滤器装置，调节 pH 至 6.0。室温保存。

S-基础培养基：配制1 L：加入50 ml 1 M K3PO4缓冲液（pH约6.0）和20 ml 5 M NaClaq，用ddH2O定容至1 L。对溶液进行高压灭菌。

M9：配制 1 L：3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO4，H2O。用 ddH2O 定容至 1 L。经高压灭菌处理。

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结果

在长时间气味暴露前后，GFP::EGL-4在AWC神经元中的定位模式示例见图2。在长时间暴露于气味之前，GFP::EGL-4定位于AWC的细胞质中（图2B）；经过80分钟的气味暴露后，GFP::EGL-4则定位于AWC的细胞核中（图2D）。在行为水平上，AWC中GFP::EGL-4位于细胞质的动物会被气味点源所吸引（图2C展示了未适应动物趋化实验的代表性结果——注意趋化指数3接近1）。而AWC中GFP::EGL-4位于细胞核的动物则不会被适应性气味的点源所吸引（图2E展示了已适应动物趋化实验的代表性结果——注意趋化指数接近于零）。为了从气味诱导的核转位实验中获得具有统计学意义的数据，实验应至少重复3次，并在不同日期进行。关于趋化实验的详细描述，可参考JoVE文章249014。

一旦EGL-4进入AWC神经元的细胞核，便会引发AWC生理状态的稳定且持久的改...

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讨论

本文所述的气味诱导GFP标记EGL-4分子进入细胞核的现象，为秀丽隐杆线虫（C. elegans）嗅觉适应提供了一种可靠的分子检测指标。气味诱导的核转位检测方法操作简便，仅需数天准备时间。我们为该检测构建的pyIs500转基因线虫，不仅表达标记AWC神经元的荧光标记物，同时还表达GFP标记的EGL-4蛋白。因此，我们认为即使缺乏或仅有极少此类神经元操作经验的研究人员，也能在快速掌握（可能仅需观察数十只线虫）后，准确识别目标细胞，并判断EGL-4位于细胞核或细胞质。读者可参考JoVE第835号文章，该文详细描述了在C. elegans中进行GFP分析的方法15。

为确保生成的数据具有最高质量，我们建议遵循以下准则：1）所有评分均应采用盲法进行；2）含有任何污染痕迹（真菌或细菌）的培养平板均不可使用；3）在培养过程中经历饥饿的线虫绝不能使用；4）适应性混合液必须在实验当天新鲜配制。

所有感觉系统都表现出神经元可塑性的实例。信号向细胞核...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢 Scott Hamilton 以及 O'Halloran 实验室成员对本文稿的仔细审阅。同时，我们也感谢我们的匿名审稿人提出的出色建议和富有见地的评论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌琼脂DifcoDF0140-07-4NGM 平板
氯化钠Fisher ChemicalS671-10NGM 平板
细菌蛋白胨DifcoDF0118-07-2NGM 平板
磷酸氢二钾Fisher ChemicalS375-500S-Basal 缓冲液和 NGM 平板
磷酸二氢钾Fisher ChemicalP285-500S-Basal 缓冲液和 NGM 平板
Kimwipes - 小型Kimberly-ClarkLS2770
乙醇 100%Gold Shield Chemical Co.43196-115趋化性实验中用于稀释气味物质
氯化钙Sigma-AldrichC8106-500GNGM 平板
硫酸镁MP Biomedicals150136-500GNGM 平板
叠氮化钠 99%Fisher ScientificICN10289180麻醉剂
琼脂糖 - 超纯Invitrogen16500-500琼脂糖垫
苯甲醛Sigma-AldrichB1334-100GAWC 气味物
丁酮，ACS 级Sigma-Aldrich360473-500MLAWC 气味物
微量离心管 - 1.5 ml 彩色DenvilleLS8147
一次性巴斯德移液管 玻璃 5-3/4"Fisher Scientific13-678-20B
StratalinkerStratageneStratalinker 2400紫外线交联
真空过滤瓶 - 500 mlNalgene09-740-25B

参考文献

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