本文描述了秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）长期嗅觉适应的一种分子读出方法。蛋白激酶G（EGL-4）对于主要感觉神经元对AWC中稳定的适应反应是必需的。在长时间气味暴露期间，EGL-4会从细胞质易位至AWC神经元的细胞核内。
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本文内容
摘要
摘要
在持续刺激下，大多数感觉神经元会通过降低对信号的敏感性来适应其反应。这种适应反应有助于调节注意力，同时保护细胞免受过度刺激。嗅觉回路中的适应现象 秀丽隐杆线虫 首次由 Colbert 和 Bargmann 描述1,2在此，作者定义了嗅觉适应范式的参数，并利用这些参数设计了一项遗传筛选实验，以分离出在适应由双侧翼细胞C型（AWC）感觉神经元感知的挥发性气味能力方面存在缺陷的突变体。当野生型 秀丽隐杆线虫 动物暴露于一种由AWC感知的吸引性气味3 30分钟后，它们会对气味产生适应性反应，随后在约1小时的趋化行为实验中忽略该适应性气味。当野生型 秀丽隐杆线虫 动物暴露于一种由AWC感知的吸引性气味约1小时后，在随后的趋化行为实验中会对该适应性气味忽略长达约3小时。这两种阶段的嗅觉适应现象在 秀丽隐杆线虫 被描述为短期嗅觉适应（由30分钟气味暴露诱导）和长期嗅觉适应（由60分钟气味暴露诱导）。后续来自L'Etoile的研究 等人，4 揭示了一种名为EGL-4的蛋白激酶G（PKG），该蛋白在AWC神经元中对短期和长期嗅觉适应均是必需的。EGL-4蛋白含有一段核定位序列，该序列对AWC神经元中的长期嗅觉适应反应至关重要，但在短期嗅觉适应反应中则非必需。4通过将EGL-4与绿色荧光蛋白标记，可在长时间气味暴露期间可视化EGL-4在AWC中的定位。利用这种功能完整的GFP标记EGL-4（GFP::EGL-4）分子，我们已能够建立AWC中长期嗅觉适应的分子读出方法5利用这种嗅觉适应的分子读出方法，我们能够开展正向和反向遗传筛选，以鉴定在 AWC 神经元中表现出 GFP::EGL-4 亚细胞定位模式缺陷的突变动物6,7本文描述了以下内容：1）表达GFP::EGL-4的动物构建；2）用于长期气味诱导核转位检测的动物培养方案；以及3）长期气味诱导的核转位事件及其恢复（再敏感化）过程的评分方法。
方案
1. 构建表达GFP标记EGL-4的动物
- 在 odr-3 基因启动子下克隆翻译融合蛋白 GFP::EGL-4（使用起始密码子上游 2678 bp 的序列）：(p)odr-3::GFP::EGL-4。odr-3 启动子驱动在纤毛神经元对 AWA、AWB、AWC 中的表达，并在 ASH 中微弱表达。
- 将质粒 (p)odr-3::GFP::EGL-4 以 50 ng/μl 的浓度，与共注射标记物一起注射到野生型（N2）动物中，采用标准的生殖系转化技术8：(p)ofm-1::GFP9（25 ng/μl）和 (p)odr-1::dsRed10（25 ng/μl）。odr-1 启动子驱动在 AWC 和 AWB 纤毛神经元对中的表达，ofm-1 启动子驱动在体腔细胞中的表达。
- 对表达第 1.2 步所述染色体外阵列的转基因动物进行紫外线（UV）/三甲基补骨脂素（TMP）整合实验方案11。
- 通过漂白法同步动物12，并在含有 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）平板上培养至 L4 阶段。用 M9 缓冲液冲洗 L4 动物以去除 NGM 平板上的 OP50 E. ....
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结果
在长时间气味暴露前后，GFP::EGL-4在AWC神经元中的定位模式示例见图2。在长时间暴露于气味之前，GFP::EGL-4定位于AWC的细胞质中（图2B）；经过80分钟的气味暴露后，GFP::EGL-4则定位于AWC的细胞核中（图2D）。在行为水平上，AWC中GFP::EGL-4位于细胞质的动物会被气味点源所吸引（图2C展示了未适应动物趋化实验的代表性结果——注意趋化指数3接近1）。而AWC中GFP::EGL-4位于细胞核的动物则不会被适应性气味的点源所吸引（图2E展示了已适应动物趋化实验的代表性结果——注意趋化指数接近于零）。为了从气味诱导的核转位实验中获得具有统计学意义的数据，实验应至少重复3次，并在不同日期进行。关于趋化实验的详细描述，可参考JoVE文章249014。
一旦EGL-4进入AWC神经元的细胞核，便会引发AWC生理状态的稳定且持久的改.......
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讨论
本文所述的气味诱导GFP标记EGL-4分子进入细胞核的现象，为秀丽隐杆线虫（C. elegans）嗅觉适应提供了一种可靠的分子检测指标。气味诱导的核转位检测方法操作简便，仅需数天准备时间。我们为该检测构建的pyIs500转基因线虫，不仅表达标记AWC神经元的荧光标记物，同时还表达GFP标记的EGL-4蛋白。因此，我们认为即使缺乏或仅有极少此类神经元操作经验的研究人员，也能在快速掌握（可能仅需观察数十只线虫）后，准确识别目标细胞，并判断EGL-4位于细胞核或细胞质。读者可参考JoVE第835号文章，该文详细描述了在C. elegans中进行GFP分析的方法15。
为确保生成的数据具有最高质量，我们建议遵循以下准则：1）所有评分均应采用盲法进行；2）含有任何污染痕迹（真菌或细菌）的培养平板均不可使用；3）在培养过程中经历饥饿的线虫绝不能使用；4）适应性混合液必须在实验当天新鲜配制。
所有感觉系统都表现出神经元可塑性的实例。信号向细胞核.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Scott Hamilton 以及 O'Halloran 实验室成员对本文稿的仔细审阅。同时，我们也感谢我们的匿名审稿人提出的出色建议和富有见地的评论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂 | Difco | DF0140-07-4 | NGM 平板 |
| 氯化钠 | Fisher Chemical | S671-10 | NGM 平板 |
| 细菌蛋白胨 | Difco | DF0118-07-2 | NGM 平板 |
| 磷酸氢二钾 | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal 缓冲液和 NGM 平板 |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal 缓冲液和 NGM 平板 |
| Kimwipes - 小型 | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| 乙醇 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | 趋化性实验中用于稀释气味物质 |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM 平板 |
| 硫酸镁 | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM 平板 |
| 叠氮化钠 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | 麻醉剂 |
| 琼脂糖 - 超纯 | Invitrogen | 16500-500 | 琼脂糖垫 |
| 苯甲醛 | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC 气味物 |
| 丁酮，ACS 级 | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC 气味物 |
| 微量离心管 - 1.5 ml 彩色 | Denville | LS8147 | |
| 一次性巴斯德移液管 玻璃 5-3/4" | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | 紫外线交联 |
| 真空过滤瓶 - 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
参考文献
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimin....
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