本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
神经元与胶质细胞之间的正常相互作用对中枢神经系统（CNS）的生理功能至关重要。这种双向通信由神经元与胶质细胞之间特定的信号通路精密介导1,2。鉴定并表征这些信号通路，对于理解神经元-胶质细胞相互作用如何塑造中枢神经系统的生理功能具有重要意义。以往，神经元与胶质细胞共培养体系被广泛用于测试和表征神经元与胶质细胞之间的信号通路。然而，从这些培养体系及其他体内工具所获得的研究结果表明，神经元与胶质细胞之间的相互信号传递通常发生在神经元的特定区室中（例如，轴突、树突或胞体）3。因此，建立一种能够分离神经元区室、并可特异性研究胶质细胞与神经元轴突/树突之间相互作用的新型培养系统显得尤为重要。此外，传统的混合培养体系无法区分神经元与胶质细胞之间的可溶性因子信号与直接膜接触信号。同时，传统共培养体系中大量神经元和胶质细胞的存在，也缺乏观察单根轴突与单个胶质细胞之间相互作用所需的分辨率。
在本研究中，我们描述了一种利用微流体培养平台（MCP）构建的新型轴突与胶质细胞共培养系统。在此共培养系统中，神经元和胶质细胞分别培养于两个通过多个中央通道相连的独立腔室中。在该微流体培养平台上，只有神经元的突起（尤其是轴突）能够通过中央通道进入胶质细胞侧。结合高效的荧光蛋白标记技术，该系统可直接观察轴突/树突与胶质细胞之间相互作用的信号通路，例如轴突介导的胶质细胞转录调控、胶质细胞介导的神经元末端受体运输以及胶质细胞介导的轴突生长。此外，通道的狭窄直径显著阻止了富含神经元的培养基流入胶质细胞腔室，从而有助于探究轴突/树突与胶质细胞表面之间的直接膜蛋白相互作用。
方案
1. 微流控培养室（MCP）的组装
- MCP（图1）是设计用于不同类型细胞分隔培养的开放式腔室4。它通常具有两个通过中央通道（直径3 μm）相连的培养区。将MCP与玻璃底培养皿组装在一起，是进行培养及后续成像分析的必要步骤。
- 首先，将多聚鸟氨酸（Polyornithine，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）溶于四硼酸钠（sodium tetraborate，Sigma-Aldrich，10 mM，pH 8.5）中，涂布于无菌的玻璃底培养皿表面，并在37 °C下孵育过夜。
- 次日，用ddH2O将已涂布的玻璃底培养皿清洗三次，并在无菌通风橱中干燥。随后，将层粘连蛋白（laminin，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）涂布于培养皿表面，并在紫外光下照射干燥1小时。涂布完成的培养皿可立即使用，或保存于-20 °C备用。这些涂层对于共培养体系中神经元和星形胶质细胞的贴壁生长至关重要。
- 为组装培养平台，需将微流控培养装置放置于已涂布的玻璃底培养皿上，使其底部的中央连接通道对准，形成紧密密封。从细胞接种区域向MCP两侧加入常规的神经元或星形胶质细胞培养基（图1），并在37 °C孵育2–4小时，以确保MCP与玻璃底培养皿之间无泄漏。我们在接种细胞前已使用培养基进行过泄漏测试。MCP与玻璃底培养皿的组装应于使用前新鲜制备。
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结果
星形胶质细胞中轴突诱导的GLT1启动子活化的时间推移成像分析
分隔式神经元与星形胶质细胞共培养系统可使神经元突起（尤其是轴突）选择性地与星形胶质细胞相互作用。在组装好的微流控装置（MCP）中成功建立轴突与星形胶质细胞（或其他胶质细胞）的共培养后，可研究多种类型的轴突-胶质细胞相互作用，例如：轴突诱导的星形胶质细胞基因启动子激活、星形胶质细胞诱导的轴突导向、轴突诱导的星形胶质细胞Ca2+反应，以及轴突诱导的少突胶质细胞髓鞘合成。上述所有应用均得益于可用于胶质细胞的高效荧光报告系统或加载至这些细胞的荧光染料。
在此，我们利用细菌人工染色体（BAC）GLT1 eGFP 转基因小鼠及这种区室化共培养系统，描述了轴突诱导的星形胶质细胞谷氨酸转运体1（GLT1）启动子的转录激活。在BAC GLT1 eGFP转基因小鼠中，eGFP荧光报告基因在GLT1基因组启动子的调控下过表达。7eGFP 报告基因的表达与内源性 GLT1 启动子激活、蛋白表达及功能活性相关7 从而允许对单个星形胶.......
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讨论
基于微流控芯片（MCP）的神经元与星形胶质细胞共培养系统，可通过仅允许轴突穿过中央通道并与星形胶质细胞相互作用，从而解析神经元到星形胶质细胞之间详细的信号通路。该共培养系统可方便地结合传统的神经元和星形胶质细胞培养步骤建立。我们还描述了该共培养系统的一个实际应用，即利用基于eGFP的报告基因系统，展示星形胶质细胞中轴突依赖性的GLT1启动子激活。
基于微流控芯片（MCP）的神经元与星形胶质细胞共培养系统相较于传统共培养方法具有多项优势：1）可在高分辨率显微镜下实时观察并明确识别单根轴突与星形胶质细胞之间的形态学相互作用；2）提供高度可控的独立微环境，便于实施药理学干预以研究细胞特异性效应；3）可分析仅在受轴突接触调控的星形胶质细胞中被诱导或上调的启动子激活及蛋白表达。原代小胶质细胞的培养步骤10 和少突胶质细胞11 已得到充分验证，该MCP共培养系统也可应用于神经元与小胶质细胞、神经元与少突胶质细胞的共培养。同时，我们认识到，该共培养系统适用于单细胞水平的高灵敏度图像分析，可与传统的大量细胞分析方法（如RNA或蛋白质分析）形成互补。此外.......
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致谢
我们感谢 Jeffrey Rothstein 博士提供 BAC GLT1 eGFP 小鼠和 GLT1 抗体；感谢塔夫茨神经科学研究中心（NIH P30 NS047243；项目负责人：Rob Jackson）提供宝贵的核心设施；感谢塔夫茨大学神经科学系新教员招聘基金（NIH P30 5P30NS069254-02；项目负责人：Phil Haydon）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30070.03 | 用于神经元接种的神经元培养基 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F4135 | 用于星形胶质细胞培养基 |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | R&D Systems | 212-GD | 在室的神经元侧加入10-20 ng/ml |
| 高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基 | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm 细胞筛 | BD Falcon | 352350 | |
| 无菌玻璃底培养皿 | MatTek Corporation | ||
| 微流控培养平台 | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 培养板中的6个孔 | Cellstar | 657 160 | |
<强>神经元培养基
| |||
| <强>用于细胞接种的神经元培养基
| |||
| <强>星形胶质细胞培养基
| |||
| <强>表1. 基于微流控培养平台的神经元轴突与胶质细胞共培养系统所用材料 |
参考文献
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20
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