基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

摘要

本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。

摘要

神经元与胶质细胞之间的正常相互作用对中枢神经系统（CNS）的生理功能至关重要。这种双向通信由神经元与胶质细胞之间特定的信号通路精密介导^1,2。鉴定并表征这些信号通路，对于理解神经元-胶质细胞相互作用如何塑造中枢神经系统的生理功能具有重要意义。以往，神经元与胶质细胞共培养体系被广泛用于测试和表征神经元与胶质细胞之间的信号通路。然而，从这些培养体系及其他体内工具所获得的研究结果表明，神经元与胶质细胞之间的相互信号传递通常发生在神经元的特定区室中（例如，轴突、树突或胞体）³。因此，建立一种能够分离神经元区室、并可特异性研究胶质细胞与神经元轴突/树突之间相互作用的新型培养系统显得尤为重要。此外，传统的混合培养体系无法区分神经元与胶质细胞之间的可溶性因子信号与直接膜接触信号。同时，传统共培养体系中大量神经元和胶质细胞的存在，也缺乏观察单根轴突与单个胶质细胞之间相互作用所需的分辨率。

在本研究中，我们描述了一种利用微流体培养平台（MCP）构建的新型轴突与胶质细胞共培养系统。在此共培养系统中，神经元和胶质细胞分别培养于两个通过多个中央通道相连的独立腔室中。在该微流体培养平台上，只有神经元的突起（尤其是轴突）能够通过中央通道进入胶质细胞侧。结合高效的荧光蛋白标记技术，该系统可直接观察轴突/树突与胶质细胞之间相互作用的信号通路，例如轴突介导的胶质细胞转录调控、胶质细胞介导的神经元末端受体运输以及胶质细胞介导的轴突生长。此外，通道的狭窄直径显著阻止了富含神经元的培养基流入胶质细胞腔室，从而有助于探究轴突/树突与胶质细胞表面之间的直接膜蛋白相互作用。

方案

1. 微流控培养室（MCP）的组装

1. MCP（图1）是设计用于不同类型细胞分隔培养的开放式腔室⁴。它通常具有两个通过中央通道（直径3 μm）相连的培养区。将MCP与玻璃底培养皿组装在一起，是进行培养及后续成像分析的必要步骤。
2. 首先，将多聚鸟氨酸（Polyornithine，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）溶于四硼酸钠（sodium tetraborate，Sigma-Aldrich，10 mM，pH 8.5）中，涂布于无菌的玻璃底培养皿表面，并在37 °C下孵育过夜。
3. 次日，用ddH₂O将已涂布的玻璃底培养皿清洗三次，并在无菌通风橱中干燥。随后，将层粘连蛋白（laminin，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）涂布于培养皿表面，并在紫外光下照射干燥1小时。涂布完成的培养皿可立即使用，或保存于-20 °C备用。这些涂层对于共培养体系中神经元和星形胶质细胞的贴壁生长至关重要。
4. 为组装培养平台，需将微流控培养装置放置于已涂布的玻璃底培养皿上，使其底部的中央连接通道对准，形成紧密密封。从细胞接种区域向MCP两侧加入常规的神经元或星形胶质细胞培养基（图1），并在37 °C孵育2–4小时，以确保MCP与玻璃底培养皿之间无泄漏。我们在接种细胞前已使用培养基进行过泄漏测试。MCP与玻璃底培养皿的组装应于使用前新鲜制备。

2. 神经元培养的制备及在组装的 MCP 中诱导神经元轴突

1. 皮层神经元细胞培养物由胚胎14-16天的小鼠脑组织新鲜制备。神经元培养基由Neurobasal培养基、2% B27神经元培养添加剂、通过添加1%的100倍浓缩GlutaMAX获得的2 mM谷氨酰胺，以及1%青霉素-链霉素组成。在解剖显微镜下分离小鼠脑组织后，去除大脑皮层表面的软脑膜。随后用刀片将组织切碎成小块，以增加暴露于胰蛋白酶的表面积。组织块在37 °C水浴中用胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，0.05%胰蛋白酶）消化10分钟，然后用火焰抛光的巴斯德移液管轻柔吹打使细胞分散。将分散后的细胞通过70 μm细胞筛过滤，以获得澄清的神经元细胞悬液。
2. 将新鲜制备的神经元（2-3 × 10⁶/ml，150 μl）接种于组装好的MCP右侧的细胞接种区（图1），使神经元能够附着于细胞滞留区（图1）。使用补充了5%胎牛血清（Hyclone）的神经元接种培养基，将新鲜制备的神经元接种至常规神经元培养基中。由于只有附着在细胞滞留区的神经元才能通过中央通道向MCP的另一侧生长轴突，因此在细胞接种区接种高密度神经元至关重要，以确保足够数量的神经元附着于细胞滞留区。高密度神经元轴突的代表性图像见图2A。
3. 次日，将神经元接种培养基更换为常规神经元培养基。换液时需小心地从培养室的细胞接种区吸除培养基，但不得从MCP组装体的细胞滞留区吸液，以避免在细胞滞留区及中央连接通道中产生气泡。气泡会严重抑制轴突的生长及其进入MCP中央通道的过程。同一天，还需在培养室的另一侧（左侧）加入胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，10-20 ng/ml），以促进神经元侧轴突的生长⁵，并使其穿过MCP组装体的中央通道（图2A）。即使未添加GDNF，也可观察到神经元侧出现一定量的自发性神经突起生长，并穿过MCP组装体的中央通道。通常在接种后2-3天可观察到轴突进入中央通道，一旦进入，通常在一天内即可到达对侧。轴突在进入对侧后通常可保持完整至少一周。

3. 向MCP中添加培养的星形胶质细胞以建立区室化共培养系统

原代星形胶质细胞培养物从小鼠出生后1至3天（P1-3）的幼鼠脑组织中分离获得。脑组织解离步骤与上述神经元细胞分离步骤类似。星形胶质细胞首先接种于预先包被多聚鸟氨酸（Polyornithine，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）的10 cm培养皿中。星形胶质细胞培养基（DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素）在接下来的两天内每天更换，以去除碎片；之后每三天更换一次培养基。

1. 星形胶质细胞在培养7天后达到约90%融合，并形成单层。当轴突即将进入或刚刚进入组装好的MCP左侧时，将融合的星形胶质细胞用胰酶消化，并将150 μl重悬的星形胶质细胞（1×10⁶/ml）重新接种至MCP左侧的细胞接种区域。星形胶质细胞通常在神经元接种后4–5天进行接种。在将星形胶质细胞重新接种至MCP左侧之前，需先去除GDNF。重新接种的星形胶质细胞附着于细胞滞留区域，GFAP免疫染色结果如图1所示。如先前研究所示^4,6，在MCP中，室两侧之间的培养基流动极小（通过荧光染料测定）。
2. 星形胶质细胞在培养7天后达到约90%融合，并形成单层。当轴突即将进入或刚刚进入组装好的MCP左侧时，将融合的星形胶质细胞用胰酶消化，并将150 μl重悬的星形胶质细胞（1×10⁶/ml）重新接种至MCP左侧的细胞接种区域。星形胶质细胞通常在神经元接种后4–5天进行接种。在将星形胶质细胞重新接种至MCP左侧之前，需先去除GDNF。重新接种的星形胶质细胞附着于细胞滞留区域，GFAP免疫染色结果如图1所示。如先前研究所示^4,6，在MCP中，室两侧之间的培养基流动极小（通过荧光染料测定）。
3. 重新接种星形胶质细胞后，进入组装好的MCP左侧的轴突可通过直接的轴突接触或释放可溶性因子的方式与星形胶质细胞直接相互作用。通过GLT1（星形胶质细胞质膜谷氨酸转运体）和神经元βIII-微管蛋白的免疫染色，可观察轴突与星形胶质细胞之间的相互作用，结果如图2D–F所示。

结果

星形胶质细胞中轴突诱导的GLT1启动子激活的延时成像分析

分隔式神经元与星形胶质细胞共培养系统可使神经元的突起（尤其是轴突）选择性地与星形胶质细胞相互作用。在微流控培养装置（MCP）中成功建立轴突与星形胶质细胞（或其他胶质细胞）共培养后，可研究多种类型的轴突-胶质细胞相互作用，例如：轴突诱导的星形胶质细胞基因启动子激活、星形胶质细胞诱导的轴突导向、轴突诱导的星形胶质细胞Ca²⁺反应，以及轴突诱导的少突胶质细胞髓鞘合成。上述所有应用均得益于可用于胶质细胞的高效荧光报告系统或加载至这些细胞中的荧光染料。

在此，我们利用细菌人工染色体（BAC）GLT1 eGFP 转基因小鼠及这种区室化共培养系统，描述了轴突诱导的星形胶质细胞谷氨酸转运体1（GLT1）启动子的转录激活。在BAC GLT1 eGFP转基因小鼠中，eGFP荧光报告基因在GLT1基因组启动子的调控下过表达。⁷eGFP 报告基因的表达与内源性 GLT1 启动子激活、蛋白表达及功能活性相关⁷ 从而允许对单个星形胶质细胞...

讨论

基于微流控芯片（MCP）的神经元与星形胶质细胞共培养系统，可通过仅允许轴突穿过中央通道并与星形胶质细胞相互作用，从而解析神经元到星形胶质细胞之间详细的信号通路。该共培养系统可方便地结合传统的神经元和星形胶质细胞培养步骤建立。我们还描述了该共培养系统的一个实际应用，即利用基于eGFP的报告基因系统，展示星形胶质细胞中轴突依赖性的GLT1启动子激活。

基于微流控芯片（MCP）的神经元与星形胶质细胞共培养系统相较于传统共培养方法具有多项优势：1）可在高分辨率显微镜下实时观察并明确识别单根轴突与星形胶质细胞之间的形态学相互作用；2）提供高度可控的独立微环境，便于实施药理学干预以研究细胞特异性效应；3）可分析仅在受轴突接触调控的星形胶质细胞中被诱导或上调的启动子激活及蛋白表达。原代小胶质细胞的培养步骤¹⁰ 和少突胶质细胞¹¹ 已得到充分验证，该MCP共培养系统也可应用于神经元与小胶质细胞、神经元与少突胶质细胞的共培养。同时，我们认识到，该共培养系统适用于单细胞水平的高灵敏度图像分析，可与传统的大量细胞分析方法（如RNA或蛋白质分析）形成互补。此外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	Hyclone	SH30070.03	用于神经元接种的神经元培养基
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F4135	用于星形胶质细胞培养基
胶质细胞源性神经营养因子	R&D Systems	212-GD	在室的神经元侧加入10-20 ng/ml
高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基	Sigma-Aldrich	11995
70 mm 细胞筛	BD Falcon	352350
无菌玻璃底培养皿	MatTek Corporation
微流控培养平台	Xona Microfluidics LLC	SND150
培养板中的6个孔	Cellstar	657 160
<强>神经元培养基 <李>Neurobasal 培养基 <李>2% B27 神经基础培养基添加剂 <李>通过加入1% 100倍浓缩的GlutaMAX，添加至终浓度为2 mM谷氨酸 <李>1% 青霉素-链霉素
<强>用于细胞接种的神经元培养基 <李>Neurobasal 培养基 <李>2% B27 神经基础培养基添加剂 <李>通过加入1% 100倍浓缩的GlutaMAX，添加至终浓度为2 mM谷氨酸 <李>1% 青霉素-链霉素 <李>5% 胎牛血清 SH30070.03
<强>星形胶质细胞培养基 <李>高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基 <李>10% 胎牛血清 F4135 1% 青霉素-链霉素
<强>表1. 基于微流控培养平台的神经元轴突与胶质细胞共培养系统所用材料