用于检测胚胎发育过程中细胞命运决定的卵裂球外植实验

摘要

单个胚胎细胞的命运可能受到继承分子和/或邻近细胞信号的影响。利用卵裂期非洲爪蟾胚胎的命运图谱，可以鉴定出单个卵裂球并进行分离培养，以评估继承分子与细胞间相互作用各自的贡献。

摘要

通过谱系追踪胚胎中所有细胞构建的命运图谱，揭示了胚胎中每个细胞分别产生哪些组织。尽管命运图谱在识别器官前体细胞以及阐明正常胚胎中后裔细胞如何通过特定发育路径定植于该器官方面非常有用，但它们并不能展示前体细胞的全部发育潜能，也无法揭示其命运决定的机制。为了检验细胞命运是否确定，需要将细胞在完整胚胎中的正常后裔谱系（即命运图谱）与其在实验干预后的后裔谱系进行比较。问题是：细胞的命运是否固定（已确定），不受周围细胞环境的影响？还是受到邻近细胞所提供的外部因素的调控？利用Xenopus胚胎的完整命运图谱，我们描述了如何识别、分离并培养一种称为卵裂球的早期卵裂阶段前体细胞。该方法可用于评估这些早期细胞是否已在完整胚胎的正常环境中确定了其发育命运，是否需要与邻近细胞相互作用才能维持该命运，或在暴露于其他类型信号时是否可被诱导表达不同的命运。

引言

Xenopus laevis 胚胎被广泛用于研究胚胎细胞如何获得其特定命运的机制，因为它们的卵足够大，便于进行显微外科操作。此外，这些胚胎在体外发育，无需补充培养基中的营养物质，因为每个细胞都含有丰富的卵黄颗粒，可提供内在的能量储备。研究细胞命运决定机制的一个重要优势是已建立了从2细胞期到32细胞期卵裂阶段分裂球的完整命运图谱^{1, 2, 3, 4, 5, 6}。这些图谱通过将可检测的分子显微注射到单个可识别的分裂球中，并在后续发育过程中追踪标记后代所分布的组织而构建而成。之所以能够获得一致的命运图谱，是因为在许多胚胎中可以可靠地识别胚胎的主要轴向。首先，在所有野生型胚胎中，动物极半球具有色素，而植物极半球则无色素。其次，受精时精子的进入会导致动物极色素向未来的腹侧收缩；因此，在许多胚胎中，可通过色素分布差异区分背侧与腹侧。第三，第一次卵裂沟通常与大多数胚胎的正中矢状面大致重合，因而可用于识别胚胎的左右两侧。命运图谱的建立还依赖于一个事实：自然受精的卵通常以规律的模式进行卵裂，使得大量胚胎中的各个分裂球均可被识别。尽管不同批次及同一批次内的卵在色素分布和卵裂模式上存在一定的变异性，但采用本文所述的筛选方法，可使具有特定命运的细胞被识别的准确率约为90%。

在胚胎发生过程中，细胞命运可通过多种机制决定。内在因素，例如差异性遗传的细胞质mRNA或蛋白质，参与早期图式形成的多个方面。例如，特定的母源mRNA决定了哪些细胞将形成生殖系、发育为内胚层或参与背侧体轴的形成（详见文献⁷综述）。由邻近细胞局部提供或由胚胎信号中心远距离提供的外在因素，则负责诱导特定组织类型的形成，并几乎参与所有器官系统的图式建立。信号中心的例子包括原肠胚中的组织者/脊索结节，它可诱导神经外胚层并调控中胚层的图式形成；以及肢芽中的极化活动区，它负责建立前后轴的图式。尽管命运图谱能够识别不同器官的前体细胞，并揭示其后代在正常胚胎中的发育路径，但无法区分这些细胞命运受内在因素还是外在因素的影响。此外，命运图谱也无法揭示细胞的全部发育潜能，因为其后代是在胚胎复杂的信号环境中分化的。有两种实验方法可用于检验细胞命运是由内在因素决定，还是随后受到外在因素的影响：1）将细胞移植到胚胎中的新位置；或2）将细胞从胚胎中取出，随后在无外源信号的条件下进行培养。

两种实验方法均已可行 非洲爪蟾 因为细胞足够大，可进行人工分离。例如，已有大量研究通过从胚胎中移除单个细胞（以改变细胞间的相互作用），或将细胞移植到宿主胚胎的新位置以检测其命运是否改变（详见综述于 ^{7, 8, 9}）。此外，由于胚胎细胞具有内在特性，因此可将来自胚胎不同区域的少量细胞以组织块形式移植到培养体系中，以在无外源因子干扰的情况下阐明组织间的诱导性相互作用。 非洲爪蟾 胚胎含有细胞内营养储存物——卵黄小板，因此可以在不添加营养物质或生长因子的确定盐溶液培养基中培养数天。我们利用这一方法证明，由于继承了母源性mRNA，背侧动物极裂球具有自主产生神经组织和背侧中胚层组织的能力。 ^{10, 11}，以及其他研究者表明，32细胞期胚胎细胞的中胚层特化依赖于内在和外在信息 ¹²以组织块形式培养细胞的一个优势在于，可以在培养基中添加特定的信号因子，以确定哪些细胞间通讯通路可能影响组织块中细胞的命运 ^{12, 13, 14}此外，可在培养前向卵裂球注射 mRNA 以过表达某个基因，或注射反义寡核苷酸以抑制内源性 mRNA 的翻译。这些获得功能和缺失功能分析可鉴定出哪些分子是自主表达细胞命运所必需的。为了分析外植体的命运，可通过标准的基因表达检测来鉴定特定细胞类型例如, 原位 杂交、RT-PCR）和免疫细胞化学检测。该方案提供了一种简单而有效的方法，用于区分调控胚胎细胞发育为特定组织的内在机制与外在机制。

方案

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

1. 使用氧化铝研磨膜打磨四把镊子的尖端。操作时需在解剖显微镜下进行，以监控尖端大小。其中一对镊子作为备用，以防在操作过程中尖端损坏。将全部四把镊子高压灭菌后，存放于无菌容器中。
2. 分别配制 500 ml 的 0.1X 和 1.0X 培养基（可选用 Marc's Modified Ringers [MMR] 或 Modified Barth's Saline [MBS]；配方见¹⁵）。过滤除菌。我们常规使用 MBS（1X = 88 mM NaCl；1 mM KCl，0.7 mM CaCl₂，1 mM MgSO₄，5 mM HEPES [pH 7.8]，2.5 mM NaHCO₃）。培养基可在 14–18 °C 下保存数月。
3. 在培养基中配制 2% 琼脂糖溶液（将 2 g 电泳级琼脂糖溶于 100 ml 1X 培养基中，使用螺旋盖玻璃瓶）。高压灭菌以溶解琼脂糖。该溶液可在 4 °C 下保存数月，下次使用时微波加热使其融化即可。
4. 在琼脂糖仍为液态时，向每个无菌 24 孔培养板的孔底部倒入约 0.5 ml。这可防止外植块粘附在塑料表面。
5. 在琼脂糖仍为液态时，向两到三个 60 mm 培养皿底部各倒入约 2–3 ml，轻轻旋转使底部均匀覆盖。这些培养皿将用作解剖皿，琼脂糖可防止去除膜后的胚胎粘附于塑料表面。
6. 待琼脂糖冷却凝固后，将一根 6 英寸巴斯德移液管的尖端在火焰上加热至熔化成球状，轻轻触碰培养板各孔中的琼脂糖表面。这样可形成浅凹，用于放置外植块。
7. 向培养板的每个孔中加入 1X 无菌培养基。
8. 待琼脂糖冷却凝固后，向解剖皿中加入稀释的培养基（0.1X MMR 或 0.1X MBS），以利于卵裂球的分离。

2. 胚胎选择

1. 根据标准方案获取受精卵并去除胶状膜¹⁵。将卵转移至100 mm培养皿中的0.5X培养液中。
2. 当胚胎发育至2细胞期时，将第一次卵裂沟平分动物极浅色素区域的胚胎（图1）挑选出来，放入另一个培养皿中。这些胚胎将作为外植体的供体。在整个操作过程中，将剩余的2细胞期胚胎保留在另一个培养皿中，并与供体胚胎并列放置，作为外植体的同胞对照，用于判断发育时期。

3. 外植体的制备

1. 将5-10个胚胎置于解剖皿中，但每次仅操作一个胚胎。
2. 将第一个胚胎放置在合适位置，以便观察其透明的卵黄膜；卵黄膜与胚胎动物极表面之间有一清晰的间隙（即卵周隙）。用非优势手（若惯用右手，则为左手）持尖头镊子，夹住卵周隙上方的卵黄膜。用另一只手持尖头镊子，夹住靠近第一把镊子尖端处的膜，然后轻轻向相反方向拉动，以剥离卵黄膜。初始夹取位置应远离待解剖的细胞，以避免在去除卵黄膜过程中损伤目标细胞。当观察到胚胎变扁平时，表明卵黄膜已被成功去除。
3. 用非主导手的镊子夹住一个邻近的细胞，将其作为“手柄”，以便不直接接触需要分离的细胞。用另一只手的镊子轻轻将其他邻近细胞从目标卵裂球上拉开。如果目标是命运相同的中线细胞，可成对一起移除。最后，将作为“手柄”的细胞解剖分离。
4. 用无菌的玻璃巴斯德移液管吸取卵裂球（或一对卵裂球），避免产生气泡和过度抽吸。可将移液管进行火焰抛光以去除可能损伤细胞的锋利边缘，但我们通常不进行此操作。将巴斯德移液管的管尖置于外植体培养皿孔中培养液液面以下，轻柔地排出卵裂球，使其依靠重力滑入浅凹处。来自多个胚胎的相同卵裂球可合并至同一个外植体中。
5. 逐一重复此步骤处理解剖皿中剩余的胚胎。处理约10个胚胎后，解剖皿中将充满细胞碎片。此时应更换为新的解剖皿。
6. 所有解剖操作完成后，检查外植体是否位于浅凹处。若未就位，可用经70%乙醇灭菌并晾干的毛环轻轻将其推入凹处。
7. 在最后一次解剖约一小时后，使用无菌玻璃巴斯德移液管清除愈合外植体周围的碎片。
8. 将外植体培养板与含有同胞对照胚胎的培养皿一同置于14–20 °C下培养。同胞胚胎可用于指示卵裂球外植体的发育阶段。

4. 收集外植体用于分析

1. 当同胞样本达到所需的发育阶段时，收获外植体。即使部分细胞发生解体，这些外植体仍能保持良好的存活状态。因此，如果培养孔中出现浑浊的团块，应用毛细环或镊子仔细探查，以确定其中是否埋藏有健康的外植体。
2. 用玻璃巴斯德吸管吸取少量培养液中的外植体，并轻轻将其排入适用于后续检测的固定液或裂解缓冲液中。

结果

该检测方法准确评估细胞发育潜能的能力，依赖于根据命运图谱^{1, 2, 3, 4, 5, 6}精确分离出正确的卵裂球。因此，必须选择在2细胞期具有正确色素分布模式的胚胎作为起始材料，如图1所示，并且这些胚胎后续需表现出规律的卵裂模式，如图2所示。若在胚胎达到所需卵裂阶段时对其进行观察，并将出现不规则卵裂的胚胎剔除，则可显著提高操作的准确性。如图2所示，规律的卵裂模式通常仅出现在胚胎的一侧。只要供体细胞来源于“规律”一侧，此类胚胎即可用作供体。由于随着细胞分裂的进行，具有规律卵裂模式的胚胎数量逐渐减少，建议筛选的胚胎数量应为实际计划解剖数量的约五倍。自然受精的卵通常比体外受精（in vitro fertilized）的卵具有更规律的卵裂模式。尽管同一批次的卵在卵裂模式上存在较大差异，但通常仍可预期至少有10–20%的胚胎适用于此类操作。

卵裂球可以单独培养，也可以以小群体形式培养。当卵裂球首次被分离时（图3A），并转...

讨论

成功培养单个卵裂球最关键的步骤包括：1）准确定位目标卵裂球；2）维持无菌且健康的培养环境；3）在细胞周期的正确时相进行细胞分离；4）掌握必要的手工操作技巧，以防止在解剖和转移至培养孔过程中造成损伤。

为了操控特定的卵裂球，必须能够识别主要的轴线。在 非洲爪蟾 胚胎的背侧可通过三种方法识别：（1）用活体染料标记精子进入点 ^{18, 19}；（2）倾斜 体外 受精卵并标记一侧 ^{18, 19}；或（3）在2细胞期选择胚胎，此时第一次卵裂沟平分动物极中色素较浅的区域 ^{20, 21}我们采用第三种方法，在约90%的情况下可准确识别自然受精的16细胞胚胎中的卵裂球 ^{20, 21}受精时，动物极的色素开始向腹侧的精子进入点收缩，导致多数胚胎的背侧动物极区域色素减少图1）。这种浅色素区域在不同窝卵之间甚至同一窝卵内均存在显著差异。 非洲爪蟾 卵。如果第一次卵裂沟将这一较浅区域均等地分配到两个子细胞之间，则该较浅区域可作为背侧的指示标志...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氧化铝研磨膜	Thomas Scientific	#6775E-38	粗粒度（12 μm），用于镊子尖端的较大修整
氧化铝研磨膜	Thomas Scientific	#6775E-46	中粒度（3 μm），用于镊子尖端的精细修磨
氧化铝研磨膜	Thomas Scientific	#6775E-54	细粒度（0.3 μm），用于镊子尖端的抛光
镊子：Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	此类镊子具有精细尖端，初次购买时无需修磨。耐腐蚀，可高压灭菌。
庆大霉素溶液	Sigma	G1397	于使用当日加入培养基中