光遗传学的发展如今提供了精确刺激特定基因定义的神经元和神经环路的手段，两者均可 体外 和 体内本文描述了用于长期光刺激脑组织的光纤装置的组装与植入方法。
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本文内容
摘要
摘要
阐明神经元连接模式一直是临床神经科学和基础神经科学面临的挑战。电生理学一直是分析突触连接模式的金标准，但成对的电生理记录既繁琐又在实验上存在局限性。光遗传学的发展引入了一种优雅的方法，可用于体外in vitro1和体内in vivo2,3刺激神经元和神经回路。通过利用特定细胞类型的启动子活性，驱动视蛋白在特定神经元群体中的表达，可实现对不同回路中基因定义的神经元亚型进行精确刺激4-6。已有充分描述的神经元刺激方法，如电刺激和/或药理学操控，通常缺乏细胞类型特异性，具有侵入性，并可能损伤周围组织。这些局限性可能改变正常的突触功能和/或回路活动。此外，由于操作本身的性质，现有方法通常仅适用于急性或终末实验。光遗传学提供了一种相对无创且可靶向特定基因型神经元的刺激能力。目前涉及体内in vivo光遗传学的大多数研究使用通过植入式套管引导的光纤6,7；然而，该方法的局限性包括反复插入光纤造成的脑组织损伤，以及光纤在套管内断裂的潜在风险。鉴于光遗传学领域的迅速发展，亟需一种更可靠的慢性刺激方法，以支持长期研究并最大限度减少附带组织损伤。本文以视频文章形式提供我们改进后的实验方案，作为对 Sparta et al.8中所述光纤植入物制备及其永久固定于麻醉小鼠颅骨的方法，以及连接植入物与光源的光纤耦合器组装方法的有效补充。该植入物通过光纤连接至固态激光器，利用小型、可拆卸的固定装置，实现对功能神经回路的高效慢性光刺激，并减少组织损伤9。光纤植入物的永久固定使得在清醒、自由活动的小鼠中开展稳定、长期的体内in vivo光遗传学研究成为可能，同时将组织损伤降至最低10。
方案
*所有材料及其相应的生产商和/或供应商均列于方案下方。
1. 植入物的组装
- 通过将100 mg固化剂加入1 g树脂中，配制热固化光纤环氧树脂混合物。
- 使用楔形碳化钨刻划笔在光纤上刻划，测量并截取约35 mm长、带100 μm纤芯的125 μm光纤。将刻划笔垂直于光纤放置，并沿单一方向一次性完成刻划。完全切断光纤会损坏光纤纤芯。
- 将带有127 μm孔径的LC陶瓷插芯插入夹具中，凸面朝下。
- 将光纤插入插芯中。光纤应能顺畅滑入，并略微从插芯的凸端伸出（图1a）。
- 在插芯的平面端滴加一滴热固化光纤环氧树脂，并用热风枪加热至环氧树脂变黑。加热过程中环氧树脂应填充整个插芯，并在约1分钟持续加热后完成固化。
- 清除插芯侧面残留的环氧树脂，以免影响与耦合器的连接。
- 使用LC光纤抛光盘（FOPD）在抛光垫上的氧化铝抛光纸上对插芯的凸端进行抛光（图1b）。以圆形轨迹进行抛光，依次使用四种不同粒径的抛光纸：5、3、1、0.3 μm。
- 在平面端将光纤截至适当长度，使其能够准确指向目标区域。长度可通过立体定位图谱确定。
- 通过下文所述的耦合器连接线将植入物连接至激光器，以测试其性能。将植入物的抛光端插入耦合器的套管中，并与对面的插芯直接接触。植入物应在光纤尖....
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讨论
光遗传学是一种强大的新技术，能够对特定神经元亚型实现前所未有的精确控制。该技术可用于以解剖学和时间上的高精度调控神经环路，同时避免了通过电极进行电刺激所导致的非细胞类型特异性及侵入性效应。植入光纤可实现对清醒且行为正常的实验小鼠在多个实验阶段进行稳定、长期的神经环路刺激，且对组织损伤极小。该系统最初由 Sparta et al.8 开创，并经我们根据研究目的进行了改进，相较于传统的植入式套管，该系统进一步将光纤固定于目标脑区，以确保在长期研究中各次实验间靶向位置的一致性。这些植入装置可被调整以刺激大脑的不同区域。
该方法中的各个步骤均需要精确操作并注重细节。每个光纤耦合连接处都必须经过抛光，以确保光损耗最小。抛光后，应使用显微镜检查光纤端面，确认光纤纤芯无任何损伤。如果光源与测量输出之间的光损耗超过30%，则应对各部件重新抛光以实现最大光子通量，或直接弃用并重新制作该部件。若插芯无法顺利插入套筒，则可能是套筒内部存在碎屑阻碍了插芯的插入。在将耦合光纤连接或拆卸至植入物时，施加的力必须严格平行于植入物的轴线方向。由于哺乳动物组织对光具有较强的.......
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致谢
我们要感谢Sparta et al., 2012首次描述了该技术，我们实验室已将其轻松地加以改进并应用于实际研究中。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LC卡套套筒 | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm内径 |
| FC多模预组装连接器 | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm卡套 |
| FC多模预组装连接器 | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm卡套 |
| Miller FOPD-LC圆盘 | PFP | M1-80754 | 适用于LC卡套 |
| 分叉管 | PFP | FF9-250 | 外径900 μm，内径250 μm |
| 多模LC棒状卡套 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 内孔直径127 μm |
| 多模LC棒状卡套 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 内孔直径230 μm |
| 可热固化的环氧树脂、固化剂和树脂 | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC和SC/PC连接器抛光盘 | ThorLabs | D50-FC | 适用于FC卡套 |
| 数字式光功率和能量计 | ThorLabs | PM100D | 分光光度计 |
| 抛光垫 | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50邵氏硬度 |
| 氧化铝研磨（抛光）片：0.3、1、3、5 μm粒径 | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| 标准硬包层多模光纤 | ThorLabs | BFL37-200 | 低OH含量，200 μm纤芯，数值孔径0.37 |
| 光纤剥线工具 | ThorLabs | T10S13 | 包层/涂层：200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA石英光纤 | Polymicro Technologies | FVP100110125 | 高-OH，紫外增强，数值孔径0.22 |
| 1x1光纤旋转接头 | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| 单模光纤跳线 | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| 热缩管，1/8英寸 | Allied Electronics | 689-0267 | |
| 热风枪 | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W；750-800 °F |
| 棉签式涂抹器 | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond组织粘合剂 | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| 速凝义齿基托丙烯酸树脂 | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN微型虹膜剪刀 | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm)，直型，15 mm刀片 |
| 约翰·霍普金斯动脉瘤夹 | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm)，弯型 |
| MEGA-Torque电动实验室电机 | Vector | EL-S | |
| Panther球形钻头 #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| 紫蓝色激光系统 | CrystaLaser | CK473-050-O | 波长：473 nm |
| 激光电源 | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2椎板切除镊 | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 探针 | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"直型止血钳 | Excelta | 35-PH | |
| 带配重底座的台钳 | Altex Electronics | PAN381 |
参考文献
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural ....
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重印与许可
