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方法文章

用于脑组织慢性光遗传学刺激的光纤植入

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DOI：

10.3791/50004

⸱

2012年10月29日

 , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine (BCM), 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine (BCM), 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital

本文内容

摘要

光遗传学的发展如今提供了精确刺激特定基因定义的神经元和神经环路的手段，两者均可 体外 和 体内本文描述了用于长期光刺激脑组织的光纤装置的组装与植入方法。

摘要

阐明神经元连接模式一直是临床神经科学和基础神经科学面临的挑战。电生理学一直是分析突触连接模式的金标准，但成对的电生理记录既繁琐又在实验上存在局限性。光遗传学的发展引入了一种优雅的方法，可用于体外in vitro1和体内in vivo2,3刺激神经元和神经回路。通过利用特定细胞类型的启动子活性，驱动视蛋白在特定神经元群体中的表达，可实现对不同回路中基因定义的神经元亚型进行精确刺激4-6。已有充分描述的神经元刺激方法，如电刺激和/或药理学操控，通常缺乏细胞类型特异性，具有侵入性，并可能损伤周围组织。这些局限性可能改变正常的突触功能和/或回路活动。此外，由于操作本身的性质，现有方法通常仅适用于急性或终末实验。光遗传学提供了一种相对无创且可靶向特定基因型神经元的刺激能力。目前涉及体内in vivo光遗传学的大多数研究使用通过植入式套管引导的光纤6,7；然而，该方法的局限性包括反复插入光纤造成的脑组织损伤，以及光纤在套管内断裂的潜在风险。鉴于光遗传学领域的迅速发展，亟需一种更可靠的慢性刺激方法，以支持长期研究并最大限度减少附带组织损伤。本文以视频文章形式提供我们改进后的实验方案，作为对 Sparta et al.8中所述光纤植入物制备及其永久固定于麻醉小鼠颅骨的方法，以及连接植入物与光源的光纤耦合器组装方法的有效补充。该植入物通过光纤连接至固态激光器，利用小型、可拆卸的固定装置，实现对功能神经回路的高效慢性光刺激，并减少组织损伤9。光纤植入物的永久固定使得在清醒、自由活动的小鼠中开展稳定、长期的体内in vivo光遗传学研究成为可能，同时将组织损伤降至最低10。

方案

*所有材料及其相应的生产商和/或供应商均列于方案下方。

1. 植入物的组装

  1. 通过将100 mg固化剂加入1 g树脂中，配制热固化光纤环氧树脂混合物。
  2. 使用楔形碳化钨刻划笔在光纤上刻划，测量并截取约35 mm长、带100 μm纤芯的125 μm光纤。将刻划笔垂直于光纤放置，并沿单一方向一次性完成刻划。完全切断光纤会损坏光纤纤芯。
  3. 将带有127 μm孔径的LC陶瓷插芯插入夹具中，凸面朝下。
  4. 将光纤插入插芯中。光纤应能顺畅滑入，并略微从插芯的凸端伸出（图1a）。
  5. 在插芯的平面端滴加一滴热固化光纤环氧树脂，并用热风枪加热至环氧树脂变黑。加热过程中环氧树脂应填充整个插芯，并在约1分钟持续加热后完成固化。
  6. 清除插芯侧面残留的环氧树脂，以免影响与耦合器的连接。
  7. 使用LC光纤抛光盘（FOPD）在抛光垫上的氧化铝抛光纸上对插芯的凸端进行抛光（图1b）。以圆形轨迹进行抛光，依次使用四种不同粒径的抛光纸：5、3、1、0.3 μm。
  8. 在平面端将光纤截至适当长度，使其能够准确指向目标区域。长度可通过立体定位图谱确定。
  9. 通过下文所述的耦合器连接线将植入物连接至激光器，以测试其性能。将植入物的抛光端插入耦合器的套管中，并与对面的插芯直接接触。植入物应在光纤尖端处维持10 mW的光输出（在尖端测量）。劣质植入物在光纤尖端附近会出现焦点微弱的现象。
  10. 将完成的植入物（图1c）存放于泡沫材料中，直至使用。

2. 光纤耦合器跳线的组装

  1. 按上述方法配制热固性光纤环氧树脂混合物。
  2. 使用楔形碳化钨刻划笔在220 μm光纤（芯径200 μm）上刻痕，测量并截取适当长度。光纤长度应允许小鼠在笼内自由活动，但不能长到让小鼠咬到光纤。
  3. 将光纤插入一段略长于光纤长度的分路护套管中。护套管的内径应略大于光纤外径。
  4. 剥离光纤一端约25 mm的涂覆层，并将其插入多模FC MM插芯组件的金属端（孔径230 μm），直至顶住。光纤应从插芯末端露出（图2a）。
  5. 在金属端用氰基丙烯酸酯（超级胶水）固定连接处。套上连接器护套，并使用FC FOPD对插芯端面进行抛光。采用圆形旋转方式，按以下顺序在四种粒径的抛光纸上依次抛光：5、3、1、0.3 μm（图2b）。
  6. 剥离光纤另一端的涂覆层，并将其插入LC陶瓷插芯（内径230 μm）中，使凸面朝远端。在平面端滴加一滴环氧树脂，加热至固化。
  7. 按照上述方法，使用FC FOPD和氧化铝抛光片对插芯的凸面端进行抛光。
  8. 将LC插芯套筒滑过插芯的凸面端，直至套筒中点位置。
  9. 将热缩管套在分路护套管和套筒上，加热以固定并保护连接部位（图2c）。
  10. 通过将耦合器连接至激光光源，并使用分光光度计测量耦合器输出端的光强来测试耦合器性能。激光输出与耦合器测量输出之间的光损耗不应超过30%。

3. 外科植入

*此为仅含操作提示的流程。器械已灭菌，但由于需频繁在器械与设备间操作，手套无需保持无菌。

  1. 使用30号针头，通过腹腔注射 Ketamine/Xylazine 混合物（剂量分别为100 mg/kg和10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
  2. 使用电推剪剃除小鼠头皮毛发，先用70%异丙醇擦拭头皮，再用Betasept擦拭巾（4%氯己定溶液）擦拭两分钟，重复一次。
  3. 将小鼠固定于立体定位仪中，确保头部稳固且颅骨水平。在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止干燥及术后疼痛。通过吸入挥发性异氟烷（1–3%，以氧气稀释，具体浓度根据小鼠生理状态调整，并通过尾夹反应持续监测）维持麻醉状态。
  4. 沿头皮正中线做切口，暴露从眼眶至人字缝的颅骨区域，必要时拨开结缔组织。
  5. 使用Serafin止血钳牵开皮肤，保持对颅骨的暴露（图3a）。
  6. 用牙科探针在颅骨表面刻划出方格状纹路。用无菌生理盐水冲洗碎屑，并彻底干燥。
  7. 用棉签将3%过氧化氢涂抹于暴露的颅骨表面，持续约2–3秒，以形成微孔。多次冲洗并彻底干燥。或者，也可按照Sparta et al.（2012）所述方法，将锚钉旋入颅骨。
  8. 再次用牙科探针在颅骨表面刻划方格状纹路，并用生理盐水冲洗碎屑，彻底干燥。
  9. 使用旋转工具，在目标脑区上方（根据前囟和人字缝校准的立体定位图谱确定）用无菌钻头（经高压灭菌）进行小范围环钻开颅（直径<1 mm）。操作时注意避免损伤硬脑膜或周围组织。清除碎屑并彻底干燥。
  10. 将光纤插芯（植入物）插入探针固定器，并连接至立体定位臂。
  11. 利用立体定位臂将植入物准确定位于目标脑区正上方（图3b）。若需将光纤插入脑组织，应以约2 mm/min的缓慢速度推进。插芯应稳固地置于残留的颅骨表面。
  12. 配制牙科水泥混合物，其黏度应足够低，以便于在颅骨上均匀涂抹。混合物的有效操作时间约为2–4分钟。
  13. 使用无菌牙签将一层薄而均匀的牙科水泥涂抹于颅骨表面及植入物下部。底层水泥应尽可能覆盖更大的颅骨面积。注意避免水泥接触小鼠皮肤，否则会增加缝合难度并引起动物不适。若水泥不慎接触皮肤，应待其部分干燥后，在完全固化前整层剥离。
  14. 使其完全干燥。
  15. 逐层均匀涂抹牙科水泥，在颅骨及植入物周围形成一个小隆起，每涂一层均需待其完全干燥（图3c）。保留插芯凸端约3–5 mm不涂水泥，以确保后续连接时接触面光滑、无阻碍。
  16. 使用无菌一次性丝线缝合线（6-0）和C22针，将头皮缝合覆盖于水泥隆起及植入物周围。术后7天拆除缝线。可选：缝合后使用Vet Bond进行额外加固，但务必少量使用，过量可能导致动物抓挠引发严重皮肤损伤。
  17. 术后立即皮下注射Ketoprofen（5 mg/kg）以减轻术后疼痛，24小时后重复给药一次。在缝合部位及植入物基部涂抹局部镇痛药（布比卡因）和抗生素（Neosporin）。
  18. 术后将小鼠置于加热垫上的笼子中，以促进麻醉恢复。将小鼠转移至无菌的术后恢复笼中。恢复笼内不应放置垫料，以维持体温并防止窒息。待小鼠清醒后，可将其移回原笼或更换新笼。

光纤植入物与耦合器的正确组装可使光源与目标区域光纤末端之间的光子损失最小化。抛光良好的光纤应传输出均匀且同心的圆形光斑（图2d）。通过精细的植入和缝合操作，植入物不会引起小鼠明显的刺激反应，并可在长期研究中保持稳定（图3d，>1个月，未发表观察结果），且光纤性能或光传输量无明显下降。植入或缝合不当可能引起刺激，导致小鼠抓挠头皮，暴露牙科水泥，或因持续抓挠造成陶瓷套管从牙科水泥中脱落或断裂。组装系统的示意图见于图4。

光纤制备过程；包括套管切割、抛光盘使用和环氧树脂固化。
图 1. 可植入式光纤的组装。（a）将光纤插入套管中，使其略微突出于凸端，箭头所示。（b）使用光纤抛光装置（FOPD）在逐级更细的抛光纸上抛光套管的凸端。（c）完成的可植入式光纤。点击此处查看大图。

带连接器护套、插芯抛光、LC套筒和同心光的光纤制备。
图 2. 用于将光纤旋转接头固定至植入物的光纤耦合器组装过程。(a) 光纤穿过插芯组件。(b) 将插芯端插入光纤功率检测器（FOPD），并使用粒度逐渐增细的抛光纸进行抛光。(c) 将插芯套筒套在插芯上，并用热缩管固定。(d) 完成的光纤耦合器应产生同心光，且光子损耗最小。

用于活体脑成像研究的小鼠颅窗手术装置；显示逐步操作流程。
图3. 光纤植入物的外科植入。（a）暴露颅骨整个表面，并清除结缔组织。（b）使用立体定位臂将光纤植入物固定在预定位置。（c）使用牙科水泥将光纤植入物固定于颅骨上。（d）植入后 >1 个月，皮肤已围绕植入物愈合，无任何刺激迹象。

用于神经刺激的啮齿类动物固态激光器与光纤植入式光遗传学装置示意图
图 4. 功能系统的示意图

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讨论

光遗传学是一种强大的新技术，能够对特定神经元亚型实现前所未有的精确控制。该技术可用于以解剖学和时间上的高精度调控神经环路，同时避免了通过电极进行电刺激所导致的非细胞类型特异性及侵入性效应。植入光纤可实现对清醒且行为正常的实验小鼠在多个实验阶段进行稳定、长期的神经环路刺激，且对组织损伤极小。该系统最初由 Sparta et al.8 开创，并经我们根据研究目的进行了改进，相较于传统的植入式套管，该系统进一步将光纤固定于目标脑区，以确保在长期研究中各次实验间靶向位置的一致性。这些植入装置可被调整以刺激大脑的不同区域。

该方法中的各个步骤均需要精确操作并注重细节。每个光纤耦合连接处都必须经过抛光，以确保光损耗最小。抛光后，应使用显微镜检查光纤端面，确认光纤纤芯无任何损伤。如果光源与测量输出之间的光损耗超过30%，则应对各部件重新抛光以实现最大光子通量，或直接弃用并重新制作该部件。若插芯无法顺利插入套筒，则可能是套筒内部存在碎屑阻碍了插芯的插入。在将耦合光纤连接或拆卸至植入物时，施加的力必须严格平行于植入物的轴线方向。由于哺乳动物组织对光具有较强的...

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致谢

我们要感谢Sparta et al., 2012首次描述了该技术，我们实验室已将其轻松地加以改进并应用于实际研究中。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LC卡套套筒Precision Fiber Products (PFP)SM-CS125S1.25 mm内径
FC多模预组装连接器PFPMM-CON2004-2300230 μm卡套
FC多模预组装连接器PFPMM-CON2004-2300230 μm卡套
Miller FOPD-LC圆盘PFPM1-80754适用于LC卡套
分叉管PFPFF9-250外径900 μm，内径250 μm
多模LC棒状卡套 1.25 mmPFPMM-FER2007C-1270内孔直径127 μm
多模LC棒状卡套 1.25 mmPFPMM-FER2007C-2300内孔直径230 μm
可热固化的环氧树脂、固化剂和树脂PFPET-353ND-16OZ
FC/PC和SC/PC连接器抛光盘ThorLabsD50-FC适用于FC卡套
数字式光功率和能量计ThorLabsPM100D分光光度计
抛光垫ThorLabsNRS9139" x 13" 50邵氏硬度
氧化铝研磨（抛光）片：0.3、1、3、5 μm粒径ThorLabsLFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
标准硬包层多模光纤ThorLabsBFL37-200低OH含量，200 μm纤芯，数值孔径0.37
光纤剥线工具ThorLabsT10S13包层/涂层：200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA石英光纤Polymicro TechnologiesFVP100110125高-OH，紫外增强，数值孔径0.22
1x1光纤旋转接头doric lensesFRJ_FC-FC
单模光纤跳线doric lensesMFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
热缩管，1/8英寸Allied Electronics689-0267
热风枪Allied Electronics972-6966250 W；750-800 °F
棉签式涂抹器Puritan Medical Products Company806-WC
VetBond组织粘合剂Fischer Scientific19-027136
速凝义齿基托丙烯酸树脂Yates MotloidColdPourPowder+Liq
BONN微型虹膜剪刀Integra Miltex18-13923-1/2"(8.9cm)，直型，15 mm刀片
约翰·霍普金斯动脉瘤夹Integra Miltex7-2901-1/2"(3.8 cm)，弯型
MEGA-Torque电动实验室电机VectorEL-S
Panther球形钻头 #1Clarkson Laboratory77.1006
紫蓝色激光系统CrystaLaserCK473-050-O波长：473 nm
激光电源CrystaLaserCL-2005
Dumont #2椎板切除镊Fine Science Tools11223-20
探针Fine Science Tools10140-02
5"直型止血钳Excelta35-PH
带配重底座的台钳Altex ElectronicsPAN381

参考文献

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
  3. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
  4. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
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  8. Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
  9. Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
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