用于脑组织慢性光遗传学刺激的光纤植入

摘要

光遗传学的发展如今提供了精确刺激特定基因定义的神经元和神经环路的手段，两者均可 体外 和 体内本文描述了用于长期光刺激脑组织的光纤装置的组装与植入方法。

摘要

阐明神经元连接模式一直是临床神经科学和基础神经科学面临的挑战。电生理学一直是分析突触连接模式的金标准，但成对的电生理记录既繁琐又在实验上存在局限性。光遗传学的发展引入了一种优雅的方法，可用于体外in vitro¹和体内in vivo^2,3刺激神经元和神经回路。通过利用特定细胞类型的启动子活性，驱动视蛋白在特定神经元群体中的表达，可实现对不同回路中基因定义的神经元亚型进行精确刺激^4-6。已有充分描述的神经元刺激方法，如电刺激和/或药理学操控，通常缺乏细胞类型特异性，具有侵入性，并可能损伤周围组织。这些局限性可能改变正常的突触功能和/或回路活动。此外，由于操作本身的性质，现有方法通常仅适用于急性或终末实验。光遗传学提供了一种相对无创且可靶向特定基因型神经元的刺激能力。目前涉及体内in vivo光遗传学的大多数研究使用通过植入式套管引导的光纤^6,7；然而，该方法的局限性包括反复插入光纤造成的脑组织损伤，以及光纤在套管内断裂的潜在风险。鉴于光遗传学领域的迅速发展，亟需一种更可靠的慢性刺激方法，以支持长期研究并最大限度减少附带组织损伤。本文以视频文章形式提供我们改进后的实验方案，作为对 Sparta et al.⁸中所述光纤植入物制备及其永久固定于麻醉小鼠颅骨的方法，以及连接植入物与光源的光纤耦合器组装方法的有效补充。该植入物通过光纤连接至固态激光器，利用小型、可拆卸的固定装置，实现对功能神经回路的高效慢性光刺激，并减少组织损伤⁹。光纤植入物的永久固定使得在清醒、自由活动的小鼠中开展稳定、长期的体内in vivo光遗传学研究成为可能，同时将组织损伤降至最低¹⁰。

方案

*所有材料及其相应的生产商和/或供应商均列于方案下方。

1. 植入物的组装

1. 通过将100 mg固化剂加入1 g树脂中，配制热固化光纤环氧树脂混合物。
2. 使用楔形碳化钨刻划笔对125 μm光纤（纤芯100 μm）进行刻划，测量并截取约35 mm长的光纤。将刻划笔垂直于光纤放置，并沿单一方向一次性完成刻划。完全切断光纤会损伤纤芯。
3. 将带有127 μm孔径的LC陶瓷插芯插入夹具中，凸面朝下。
4. 将光纤插入插芯中。光纤应顺畅滑入，并略微突出于插芯的凸端（图1a）。
5. 在插芯的平面端滴加一滴热固化光纤环氧树脂，并用热风枪加热至环氧树脂变黑。加热过程中环氧树脂应填充插芯内部，并在固化前完成流动。持续加热约1分钟后，环氧树脂应完成固化。
6. 清除插芯侧面残留的环氧树脂，以免影响与耦合器的连接。
7. 使用LC光纤抛光盘（FOPD）在抛光垫上的氧化铝抛光纸上对插芯的凸端进行抛光（图1b）。采用圆形旋转方式，依次使用四种不同粒径的抛光片进行抛光：5、3、1、0.3 μm。
8. 在平面端将光纤切割至适当长度，以确保其能够准确靶向目标区域。长度可通过立体定位图谱确定。
9. 通过下文所述的耦合器连接线将植入物连接至激光器，以测试其性能。将植入物的抛光端插入耦合器套管中，并与对侧插芯直接接触。植入物应能维持10 mW的光输出功率（在植入光纤末端测量）。不合格的植入物在光纤末端附近会出现焦点微弱的现象。
10. 将制备完成的植入物（图1c）存放于泡沫材料中，直至使用。

2. 光纤耦合器线缆的组装

1. 按上述方法制备热固性光纤环氧树脂混合物。
2. 使用楔形碳化钨刻划笔在220 μm光纤（纤芯200 μm）上刻痕，测量并截取适当长度。光纤长度应允许小鼠在笼内自由活动，但不能长到允许小鼠咬断光纤。
3. 将光纤插入一段略长于光纤长度的分叉管中。分叉管的内径应略大于光纤外径。
4. 剥离光纤一端约25 mm的涂覆层，并将其插入多模FC-MM插芯组件（内径230 μm）的金属端，直至无法继续插入。光纤应从插芯端面伸出（图2a）。
5. 在金属端使用氰基丙烯酸酯（超级胶）固定连接处。套上连接器护套，并使用FC FOPD对插芯端面进行抛光。采用圆形旋转方式，按以下顺序在四种粒径的抛光纸上依次抛光：5、3、1、0.3 μm（图2b）。
6. 剥离光纤另一端，并将该端凸面朝远端插入LC陶瓷插芯（内径230 μm）。在平面端滴加一滴环氧树脂，加热至固化。
7. 使用FC FOPD和上述方法，在氧化铝抛光片上抛光插芯的凸面端。
8. 将LC插芯套筒滑至插芯凸面端，直至套筒中点位置。
9. 将热缩管套在分叉管和套筒上，加热以固定并保护连接处（图2c）。
10. 通过将耦合器连接至激光光源，并使用分光光度计测量耦合器输出端的光强来测试耦合器性能。激光输出与耦合器实测输出之间的光损耗不应超过30%。

3. 手术植入

*这是一份仅包含提示的操作流程。仪器为无菌状态，但由于需频繁在仪器与设备间操作，手套无需保持无菌。

1. 使用30号针头，通过腹腔注射 Ketamine/Xylazine 混合物（剂量分别为100 mg/kg和10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
2. 用电推剪剃除头皮毛发，先用70%异丙醇擦拭头皮，再用Betasept擦拭巾（4%氯己定溶液）擦拭两分钟，重复一次。
3. 将小鼠固定于立体定位仪中，确保头部稳固且颅骨水平。在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止干燥及术后疼痛。通过吸入挥发性异氟烷（1–3%，根据小鼠生理状态以氧气稀释）维持麻醉，需持续通过夹尾反应监测麻醉深度。
4. 沿头皮正中线做切口，暴露从眼眶至人字缝的颅骨区域，必要时拨开结缔组织。
5. 使用Serafin止血钳牵开皮肤，保持颅骨操作通路开放（图3a）。
6. 用牙科探针在颅骨表面刻划出方格状纹路，用无菌生理盐水冲洗碎屑，彻底干燥。
7. 用棉签蘸取3%过氧化氢处理暴露的颅骨约2–3秒，以形成微孔结构，多次冲洗并彻底干燥。或者，也可按照Sparta et al.（2012）所述方法将锚钉旋入颅骨。
8. 再次用牙科探针在颅骨表面刻划方格状纹路，并用生理盐水冲洗碎屑，彻底干燥。
9. 使用旋转工具，在目标脑区上方（根据以bregma和lambda为基准校准的立体定位图谱确定）用无菌钻头（经高压灭菌）钻出一个小的环钻开颅孔（<1 mm直径）。操作时需小心，避免刺破硬脑膜或损伤组织。清除碎屑并彻底干燥。
10. 将光纤插芯（植入体）插入探针固定架，并连接至立体定位臂。
11. 通过立体定位臂将植入体准确定位于目标脑区正上方（图3b）。若需将光纤插入脑组织，应以约2 mm/min的缓慢速度推进。插芯应稳固地置于残留颅骨表面。
12. 配制牙科水泥混合物，其黏度应足够低以便均匀涂抹于颅骨表面。混合物的有效操作时间约为2–4分钟。
13. 使用无菌牙签将牙科水泥均匀、薄层地涂抹于颅骨及植入体下部。底层水泥应尽可能覆盖更大的颅骨表面积。避免水泥接触小鼠皮肤，否则会增加缝合难度并引起皮肤刺激。若水泥不慎接触皮肤，应待其部分干燥后整层剥离，避免完全固化。
14. 使其完全干燥。
15. 逐层均匀涂抹牙科水泥，在颅骨及植入体周围形成一个小隆起，每层均需完全干燥（图3c）。保留插芯凸端约3–5 mm区域不涂水泥，以确保连接时接触面光滑且无阻碍。
16. 使用无菌一次性丝线（6-0）和C22针，将头皮缝合覆盖于牙科水泥隆起及植入体周围。术后7天拆除缝线。可选：缝合后使用Vet Bond进行额外粘合，注意用量应尽量少，过量可能导致因搔抓引发的严重皮肤损伤。
17. 术后应立即皮下注射Ketoprofen（5 mg/kg）以减轻术后疼痛，24小时后重复一次。在缝合部位及植入体基部涂抹局部镇痛药（布比卡因）和抗生素（Neosporin）。
18. 将小鼠置于加热垫上的笼内，以促进麻醉恢复。术后恢复期间应将小鼠置于无垫料的无菌恢复笼中，以维持体温并防止窒息。待小鼠清醒后，可将其转移回原笼或新笼中。

正确组装光纤植入物和耦合器可使光源与目标区域内的光纤末端之间的光子损失最小化。经过良好抛光的光纤应能均匀地传输光线，形成一个同心圆（图2d）。通过精细的植入和缝合操作，植入物不会引起小鼠明显的刺激反应，可长期留置用于长期研究（图3d，>1个月，未发表观察结果），且光纤或透光量无明显退化。不当的植入或缝合可能导致组织刺激，引起小鼠抓挠头皮，暴露牙科水泥，或因持续抓挠导致陶瓷套管从牙科水泥中脱落或断裂。组装系统的示意图见图4。

图1. 可植入光纤的组装过程。（a）将光纤插入插芯中，使其略微突出于凸面端，箭头所示位置即为突出部分。（b）使用光纤抛光装置（FOPD）在粒度逐级细化的抛光纸上对插芯的凸面端进行抛光。（c）完成后的可植入光纤。点击此处查看大图。

图 2. 用于将光纤旋转接头固定到植入物上的光纤耦合器的组装过程。(a) 光纤穿过插芯组件。(b) 将插芯端插入光纤功率检测器（FOPD）中，并使用粒度逐渐变细的抛光纸进行抛光。(c) 将插芯套筒套在插芯上，并用热缩管固定。(d) 完成后的光纤耦合器应产生同心光束，且光子损耗最小。

图3. 光纤植入的手术操作。（a）暴露颅骨整个表面，并清除结缔组织。（b）使用立体定位臂固定光纤植入物的位置。（c）使用牙科水泥将光纤植入物固定在颅骨上。（d）>1个月后，植入物周围皮肤已愈合，无任何刺激迹象。

图4. 功能系统的示意图

讨论

光遗传学是一种强大的新技术，能够对特定神经元亚型实现前所未有的精确控制。该技术可用于以解剖学和时间上的高精度调控神经环路，同时避免了通过电极进行电刺激所导致的非细胞类型特异性及侵入性效应。植入光纤可实现对清醒且行为正常的实验小鼠在多个实验阶段进行稳定、长期的神经环路刺激，且对组织损伤极小。该系统最初由 Sparta et al.⁸ 开创，并经我们根据研究目的进行了改进，相较于传统的植入式套管，该系统进一步将光纤固定于目标脑区，以确保在长期研究中各次实验间靶向位置的一致性。这些植入装置可被调整以刺激大脑的不同区域。

该方法中的各个步骤均需要精确操作并注重细节。每个光纤耦合连接处都必须经过抛光，以确保光损耗最小。抛光后，应使用显微镜检查光纤端面，确认光纤纤芯无任何损伤。如果光源与测量输出之间的光损耗超过30%，则应对各部件重新抛光以实现最大光子通量，或直接弃用并重新制作该部件。若插芯无法顺利插入套筒，则可能是套筒内部存在碎屑阻碍了插芯的插入。在将耦合光纤连接或拆卸至植入物时，施加的力必须严格平行于植入物的轴线方向。由于哺乳动物组织对光具有较强的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LC卡套套筒	Precision Fiber Products (PFP)	SM-CS125S	1.25 mm内径
FC多模预组装连接器	PFP	MM-CON2004-2300	230 μm卡套
FC多模预组装连接器	PFP	MM-CON2004-2300	230 μm卡套
Miller FOPD-LC圆盘	PFP	M1-80754	适用于LC卡套
分叉管	PFP	FF9-250	外径900 μm，内径250 μm
多模LC棒状卡套 1.25 mm	PFP	MM-FER2007C-1270	内孔直径127 μm
多模LC棒状卡套 1.25 mm	PFP	MM-FER2007C-2300	内孔直径230 μm
可热固化的环氧树脂、固化剂和树脂	PFP	ET-353ND-16OZ
FC/PC和SC/PC连接器抛光盘	ThorLabs	D50-FC	适用于FC卡套
数字式光功率和能量计	ThorLabs	PM100D	分光光度计
抛光垫	ThorLabs	NRS913	9" x 13" 50邵氏硬度
氧化铝研磨（抛光）片：0.3、1、3、5 μm粒径	ThorLabs	LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
标准硬包层多模光纤	ThorLabs	BFL37-200	低OH含量，200 μm纤芯，数值孔径0.37
光纤剥线工具	ThorLabs	T10S13	包层/涂层：200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA石英光纤	Polymicro Technologies	FVP100110125	高-OH，紫外增强，数值孔径0.22
1x1光纤旋转接头	doric lenses	FRJ_FC-FC
单模光纤跳线	doric lenses	MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
热缩管，1/8英寸	Allied Electronics	689-0267
热风枪	Allied Electronics	972-6966	250 W；750-800 °F
棉签式涂抹器	Puritan Medical Products Company	806-WC
VetBond组织粘合剂	Fischer Scientific	19-027136
速凝义齿基托丙烯酸树脂	Yates Motloid	ColdPourPowder+Liq
BONN微型虹膜剪刀	Integra Miltex	18-1392	3-1/2"(8.9cm)，直型，15 mm刀片
约翰·霍普金斯动脉瘤夹	Integra Miltex	7-290	1-1/2"(3.8 cm)，弯型
MEGA-Torque电动实验室电机	Vector	EL-S
Panther球形钻头 #1	Clarkson Laboratory	77.1006
紫蓝色激光系统	CrystaLaser	CK473-050-O	波长：473 nm
激光电源	CrystaLaser	CL-2005
Dumont #2椎板切除镊	Fine Science Tools	11223-20
探针	Fine Science Tools	10140-02
5"直型止血钳	Excelta	35-PH
带配重底座的台钳	Altex Electronics	PAN381