微血管和内皮功能的无创评估

摘要

甲襞微循环显微镜检查是一种无创、相对经济的方法，可用于直接观察微循环。前臂血流技术可提供公认的无创性内皮功能评估指标。

摘要

作者们采用甲襞微循环显微镜和前臂血流技术，研究微血管功能障碍在心血管疾病发病机制中的作用。甲襞微循环显微镜是一种无创、相对经济的方法，可直接观察微循环。毛细血管募集率（%）通过以下方式计算：用反应性充血后毛细血管密度（反应性充血后毛细血管密度减去基础毛细血管密度）的增加值，除以最大毛细血管密度（在被动静脉阻塞期间观察到的密度）。灌注毛细血管百分比（%）表示所有存在的毛细血管中实际有血液灌注（功能活跃）的比例，其计算方法为：将反应性充血后毛细血管密度除以最大毛细血管密度。毛细血管募集率和灌注毛细血管百分比均反映功能性毛细血管的数量。前臂血流（FBF）技术提供了公认的无创性内皮功能评估指标：血管舒张程度的估计值通过计算 FBF_max/FBF_base 比值获得，即将四个 FBF_max 值的平均值除以四个 FBF_base 值的平均值。最大血管舒张时的前臂血管阻力（FVR_max）等于平均动脉压（MAP）除以 FBF_max。甲襞微循环显微镜和前臂血流技术均易于被患者接受，且可快速掌握。

通过本文所述方法获得的微血管和内皮功能指标，未来可能在临床患者心血管风险降低策略中具有应用价值。我们已发表的研究报告表明，在高血压的早期阶段（包括高血压前期），即可出现微血管和内皮功能障碍。因此，微血管和内皮功能的检测指标最终可能有助于早期识别、风险分层以及预防终末期血管病变及其潜在的致命后果。

方案

病例介绍（如适用则为必填项）：不适用；这仍是一项实验性研究操作，尚未用于临床。

诊断、评估与方案（如适用，必填）：不适用；此仍为实验性研究步骤，尚未用于临床。

步骤（必需）：此部分应包含相关操作的逐步描述，需符合以下指南。

1. 毛细血管显微镜（图1）

1. 我们的甲襞微循环成像技术改编自Serne及其同事¹。该操作的排除标准为结缔组织血管病，因为结缔组织血管病会导致已知的毛细血管改变²。
2. 在至少10小时的过夜禁食及20分钟静坐休息后，于上午7至11点之间，在安静、温度受控的房间（维持在21.5–22.5 °C）内，对受试者进行为期30分钟的微血管测量。受试者保持坐姿，左手置于心脏水平。
3. 使用体视显微镜（Olympus；美国宾夕法尼亚州Center Valley）观察第三指背侧皮肤的甲襞毛细血管，该显微镜连接一台400万像素SPOT Insight黑白数码相机（型号IN-1400：Diagnostic Instruments；美国密歇根州Sterling Heights）和一台笔记本电脑（Dell Latitude D600：Dell；美国德克萨斯州Austin）。为限制移动，左臂和前臂用折叠的毯子松松覆盖，并放置在显微镜基座上的另一折叠毯子上。
4. 甲床照明采用250 W卤素光纤灯（KL 2500LCD：Schott-Fostec；美国纽约州Elmsford）；对于皮肤色素较深的个体，额外使用一个150 W光纤卤素光源（B&B Microscopes, Ltd.，美国宾夕法尼亚州Warrendale）进行补光。
5. 为观察毛细血管，使用3.2倍物镜（Olympus 3.2/0.07），系统总放大倍数为38.4倍。
6. 利用相机配套的SPOT成像软件，通过相同的标准化SPOT软件功能（增强亮部与暗部层次）提高毛细血管照片的明暗对比度，以最大程度地增强所有受试者中毛细血管的可见性。
7. 为量化毛细血管密度，在三个阶段——静息基线状态、缺血后反应性充血期和静脉阻塞期——每3–5秒拍摄一次数字显微照片。（a）在静息基线状态下，持续拍摄三分钟内的显微照片，以检测静息时灌注的毛细血管。（b）在缺血后反应性充血期间，拍摄显微照片以量化功能灌注的毛细血管（基线加储备毛细血管），具体如下：首先，在左上臂使用阻断袖带加压至收缩压以上40 mm Hg，持续10分钟。随后在动脉阻断释放后的第一分钟内拍摄显微照片，以观察所有功能灌注的毛细血管。反应性充血后毛细血管密度降低提示功能性毛细血管募集受损，即功能性稀疏。（c）在静脉阻塞期间拍摄显微照片以量化最大毛细血管密度，该密度包括灌注的（有活跃红细胞（RBC）运动）和非灌注的（充满静止不动的红细胞）毛细血管³，具体如下：在完成缺血后反应性充血试验并休息10分钟后，将臂袖带加压至60 mm Hg，持续60秒，被动迫使血液进入所有通畅的毛细血管，并在此期间拍摄显微照片。由于最大毛细血管密度包含所有结构上存在的毛细血管，其密度降低表明结构性稀疏。
8. 毛细血管密度定义为每平方毫米甲襞皮肤中的毛细血管数量，计算方法为取四张最清晰聚焦且运动伪影最少的图像中四次测量的平均值。在我们的研究中，毛细血管计数（毛细血管/mm²）的典型值为：基线期55–80，缺血后65–90，静脉阻塞期90–105。毛细血管募集百分比通常在5%–25%之间（平均约10–15%），灌注毛细血管百分比在70%–95%之间（平均约80–90%），高血压患者数值低于正常血压者。该计数方法的可重复性已通过三位观察者对10名不同受试者的照片进行独立人工评估得到验证（图2）。观察者对受试者的身份和血压情况设盲。经过培训后，后续独立计数显示出高度一致性。平均观察者间和观察者内差异约为2–3个毛细血管/mm²，组内相关系数均大于0.90。毛细血管成像测量的短期变异程度与观察者间和观察者内差异相近（约2个毛细血管/mm²），但2–3年间的长期变异则大一个数量级（约15个毛细血管/mm²），表明纵向变化可明显区别于观察者变异。两种毛细血管功能指标的可靠性也较高（毛细血管募集百分比的组内相关系数为0.84，灌注毛细血管百分比为0.82）。
9. 
   
   目前研究人员已采用基于计算机的方法，使用Image-Pro Plus成像软件（版本6.2，Media Cybernetics, Inc.，美国马里兰州Bethesda：图3）量化毛细血管密度。在10名受试者中，软件自动计数与人工计数在基线、缺血后和静脉淤血状态下的Pearson相关系数分别为0.78、0.78和0.71（所有p < 0.05），表明两种方法具有一致性。基于计算机的计数可靠性略低于人工计数，但仍较高（基线期组内相关系数为0.91，缺血后为0.86，静脉阻塞期为0.84）。我们还有未发表的数据表明，自动计数结果与包括高血压在内的多种心血管危险因素相关，目前正准备发表。
10. 表1总结了毛细血管密度的测量与计算方法。毛细血管募集百分比通过将缺血后反应性充血引起的毛细血管密度增加量（缺血后反应性充血毛细血管密度减去基线毛细血管密度）除以最大毛细血管密度（被动静脉阻塞期间观察到的密度）来评估。灌注毛细血管百分比表示所有存在的毛细血管中处于灌注状态（功能活跃）的比例，计算方法为将缺血后反应性充血毛细血管密度除以最大毛细血管密度。毛细血管募集百分比和灌注毛细血管百分比均反映功能性毛细血管的数量。这些指标数值越低，提示功能性毛细血管稀疏。

2. 内皮功能评估

1. 根据Sivertsson的方法⁴，采用前臂血流的无创容积描记法，在缺血后反应性充血前后评估内皮功能，该方法利用反应性充血这一依赖内皮的刺激来诱导血管舒张。
2. 受试者在仰卧休息10分钟后取坐位，将一根注汞橡胶应变计拉伸至超过其静息长度10%后，环绕固定于肘窝下方5 cm处的前臂。
3. 应变计连接至容积描记仪（EC-4：DE Hokanson, Inc；Bellevue, WA），后者再连接至多普勒记录仪（CW-1；DE Hokanson, Inc；Bellevue, WA）。
4. 在上臂安置阻断袖带，并使用连接至可调节静脉输液架的吊带将手臂舒适地悬吊至心脏水平。在对侧手臂上放置Dinamap ProCare 100自动血压袖带（GE Healthcare, Piscataway, NJ），测量收缩压、舒张压和心率。
5. 在手腕处使用小儿袖带充气至200 mm Hg以阻断手部血流。上臂袖带先充气至50 mm Hg，随后放气1.5秒，再于每次前臂血流测量前迅速重新充气，通过环绕前臂的应变计扩张来获取血流数据。
6. 测量静息状态下的基础前臂血流量（FBF_base）以及缺血后反应性充血诱导的血管最大舒张时的前臂血流量（FBF_max）。基础血流量测量时，在30秒内连续获取四条FBF曲线（FBF_base）。
7. 随后将阻断袖带充气至高于收缩压40 mm Hg，持续10分钟。在动脉阻断解除后（即缺血后反应性充血期间），于血流恢复后的前30秒内连续获取四条FBF曲线（FBF_max）。
8. 通过将四次FBF_max值的平均数除以四次FBF_base值的平均数，计算FBF_max/FBF_base比值，作为血管舒张能力的估计指标⁵。最大血管舒张时的前臂血管阻力（FVR_max）计算公式为平均动脉压（MAP）除以FBF_max。反应性充血期间的FBF_max与经动脉内输注乙酰胆碱（一种依赖内皮的血管舒张剂）达到最大舒张时的前臂血流量直接相关⁶。因此，FBF_max及FBF_max/FBF_base比值被公认为评估内皮功能的无创指标^6-8。此外，FBF_max和FVR_max均可反映阻力血管的结构改变（如管壁/管腔比值增加）⁹。

结果

通过比较正常血压与高血压个体的微血管形态，其差异显而易见 图4 和 5. 图4 显示正常血压个体中排列整齐的直小血管典型网络结构。相比之下， 图5 显示出萎缩、盘绕的毛细血管排列更为紊乱的模式。

作者们长期关注微血管功能障碍在心血管疾病发病机制中的作用。在他们的首个NIH/NHLBI资助项目中，成功组建了一个包含200名个体的队列，涵盖血压正常、高血压前期和高血压受试者，并对微血管功能障碍（包括毛细血管稀疏和内皮功能指标）开展了一系列研究。该队列个体年龄范围为18至55岁，女性占60%，非裔美国人占46%，高血压前期者占61%（n=122）。我们已发表的该队列研究结果表明，微血管功能障碍在高血压早期阶段（高血压前期和1期高血压）即已存在（详细结果此前已有报道^{10, 11}）。尽管为横断面研究，我们的发现提示，高血压相关的血管病理过程在血压轻度升高时即已启动，表明微血管功能障碍可能早于慢性持续性高血压的发生。

讨论

甲褶微循环显微镜检查（毛细血管显微镜检查）是一种非标准化的毛细血管结构评估方法。然而，目前尚无用于直接评估毛细血管结构的标准方法。此外，毛细血管显微镜检查已在大量且不断增长的已发表研究中被广泛用于直接评估毛细血管密度^{12, 13, 10, 11, 14-18}。此外，我们已通过将毛细血管显微镜检查结果与前臂血流量（一种公认的血管功能评估指标）^{10, 11}以及尿白蛋白排泄率（UAE，一种公认的血管损伤评估指标）进行相关性分析，验证了该技术的有效性（未发表工作，论文正在准备中）。尽管原始方法采用视频摄影进行连续观察，但我们简化的操作方法则如操作步骤部分所述，在数分钟内多次采集静态数字图像。

尽管理论上讲，使用静态图像计数毛细血管而无动态录像作为参考时，可能会低估或遗漏毛细血管峰值密度，但我们采用在袖带释放后反应性充血高峰期间连续快速拍摄1分钟内的静态图像，并特别计数其中前四张图像，以获得最大化的缺血后毛细血管计数。此外，已有报道表明，通过在上臂施加数分钟的超收缩压水平的长时间缺血，健康受试者的充血反应至少可持续3至4分钟，而使用指套进行1分钟阻...