Här beskriver vi en unik strategi för att skapa biokompatibla, skiktade matriser med kontinuerliga gränssnitt mellan olika skikt för tissue engineering. En sådan ställning kan ge en perfekt anpassningsbar miljö för att modulera cellbeteende av olika biologiska, kemiska eller mekaniska signaler
Komplexa vävnadsodlingsplattor matriser, i vilka typer och koncentrationer av biologiska stimuli (t.ex. tillväxtfaktorer, inhibitorer, eller små molekyler) eller matris struktur (t.ex. komposition, koncentration, eller styvheten hos matrisen) varierar över rymden, skulle möjliggöra en rad undersökningar om hur dessa variabler påverkar celldifferentiering, migration och andra fenomen. Den stora utmaningen i att skapa skiktade matriser bibehåller den strukturella integriteten hos skiktet gränssnitt utan diffusion av enskilda komponenter från varje skikt 1. Aktuella metoder för att uppnå detta inkluderar photopatterning 2-3, litografi 4, sekventiell functionalization5, frystorkning 6, mikrofluidik 7, eller centrifugering 8, av vilka många kräver sofistikerade instrument och tekniska färdigheter. Andra förlitar sig på sekventiell fastsättning av enskilda skikt, vilket kan leda till delaminering av skikten 9 </sup>.
DGMP övervinner dessa frågor med hjälp av en inert densitet modifierare som jodixanol att skapa lager av varierande densitet 10. Eftersom densiteten modifieringsmedel kan blandas med prepolymeren eller bioaktiv molekyl, tillåter dGMP varje byggnadsställning skikt som skall anpassas. Helt enkelt variera koncentrationen av densiteten modifieringsmedlet förhindrar blandning av intilliggande skikt medan de förblir vattenhaltig. Efterföljande enda steg polymerisation ger upphov till en strukturellt kontinuerlig flerskiktad byggnadsställning, i vilken varje skikt har distinkt kemiska och mekaniska egenskaper. Densiteten modifieraren kan lätt tas bort med tillräckligt sköljning utan störning av de enskilda skikten eller deras komponenter. Denna teknik är därför väl lämpad för att skapa hydrogeler av olika storlekar, former och material.
Ett protokoll för framställning av en 2D-polyetylenglykol (PEG)-gel, i vilken alternerande skikt innefattar RGDS-350, beskrivs nedan. Vi använder PEG Because det är biokompatibelt och inert. RGDS, en celladhesion peptid 11, används för att demonstrera rumslig begränsning av en biologisk kö, och konjugering av en fluorofor (Alexa Fluor 350) ger oss möjlighet att visuellt särskilja olika skikt. Detta förfarande kan anpassas för andra material (t.ex. kollagen, hyaluronan, etc.) och kan förlängas för att tillverka 3D geler med vissa modifieringar 10.
DGMP är en enkel strategi för att förbereda flerskiktade geler som inte förlitar sig på dyra instrument. Detta protokoll kan anpassas för att skapa byggnadsställningar med andra biokompatibla material, såsom kollagen och hyaluronsyra. Bioaktiva små molekyler, t ex cell-vidhäftningsbefrämjande RGDS peptid, kan bundna till polymermatrisen för att förhindra blandning av signaler mellan skikten. Proteiner kan inkapslas i distinkta skikt utan behov av kemisk konjugering som de, beroende på matrisen maskstorlek, är mindre benägna att diffundera genom hydrogeler 10. Här har vi använt jodixanol (Nycoprep), en inert densitet modifieringsmedel, som tidigare har använts för viabla celler applikationer. Andra densitet modifieringsmedel såsom sackaros och dextros kan också användas. Genom att variera inställningstid (t s), kan en finjustera gränssnitten mellan två lager för att producera jämna eller skarpa övergångar som behövs (längre inställningstid ger mjukare övergångar) <sup> 10. Till exempel kan mjukare övergångar mellan dGMP gelskikt användas för att generera en kontinuerlig gradient av en biologisk kö för att studera cellprocesser såsom kemotaxi.
Effekten av densitet modifieringsmedel på gel styvhet visas i fig 5 för en 15% aPEGda gel, en mer fullständig karakterisering av styvhet och porositet såsom en funktion av PEGda och iodixanol koncentrationer närvarande utvärderas. Medan PEGda koncentrationen i detta exempel är relativt hög, observerade vi en 60% större elasticitetsmodul i geler med 30% jodixanol jämfört med geler utan. Förändringen i gel styvhet kan justeras för genom att modulera makromeren koncentrationen eller tvärbindningsdensitet.
Vi har också tillämpat dGMP teknik för att skapa 3D flerskiktade geler med polyakrylamid och prekursorer PEG 10. Variation av koncentrationen eller graden av tvärbindning av prepolymeren medger strukturell variation iställningar, som kan användas för att undersöka cell beteende såsom polariserade tillväxt och migration i 3D.
Sammanfattningsvis är dGMP en anpassningsbar teknik som kan tillämpas för att tillverka 2D-och 3D byggnadsställningar från olika biokompatibla material för ett brett spektrum av biomedicinska och grundforskning applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för stöd från NIH direktörens Nya Innovatör Awards (1DP2 OD006499-01 till AA och 1DP2 OD006460-01 till AJE) och King Abdulaziz City för vetenskap och teknik (UC San Diego Center of Excellence i nanomedicin). Vi vill tacka Ms Jessica Moore för hennes kritiska synpunkter på manuskriptet.
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |