基于全固态离子选择性电极的多分析物生物芯片在生理学研究中的应用

摘要

由导电聚合物（CP）换能器构建的全固态离子选择性电极（ASSISEs）在液体介质中可提供数月的功能寿命。本文介绍了在芯片实验室格式中制备和校准ASSISEs的过程。实验表明，该ASSISE在复杂生物介质中长期储存后，仍能保持接近能斯特响应的斜率特性。

摘要

在环境、生物医学、农业、生物学以及航天飞行研究中，芯片实验室（lab-on-a-chip, LOC）应用需要一种能够在复杂的生物介质中长期储存的离子选择性电极（ion-selective electrode, ISE）^1-4。全固态离子选择性电极（all-solid-state ion-selective electrode, ASSISE）在上述应用中尤其具有吸引力。理想的电极应具备以下优点：易于构建、维护成本低，并具备微型化潜力，从而支持批量加工。本研究构建了一种用于定量检测 H⁺、Ca²⁺ 和 CO₃^2- 离子的微加工 ASSISE。该电极由贵金属电极层（即 Pt）、转导层和离子选择性膜（ISM）层组成。其中，转导层的作用是将离子选择性膜的浓度依赖性化学势转化为可测量的电信号。

发现ASSISE的寿命取决于导电层/膜界面电位的维持^5-7。为了延长ASSISE的工作寿命，从而在界面层保持稳定的电位，我们采用导电聚合物（CP）聚（3,4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT）^7-9替代氯化银/银（Ag/AgCl）作为换能层。我们将ASSISE构建成芯片实验室格式，并将其称为多分析物生物芯片（MAB）（图1）。

在测试溶液中的校准结果表明，微生物杂交传感器（MAB）能够监测 pH（工作范围 pH 4–9）、CO₃^2-（检测范围 0.01 mM – 1 mM）和 Ca²⁺（对数线性范围 0.01 mM 至 1 mM）。MAB 的 pH 传感器在藻类培养基中储存近一个月后，仍表现出接近能斯特响应的斜率。碳酸根生物芯片的电位响应曲线与传统离子选择性电极相似。生理学测量被用于监测模式系统——小球藻（Chlorella vulgaris）的生物活性。

微阵列生物传感器在体积、多功能性和多重分析物检测能力方面具有优势，因此适用于地球或太空中的许多受限环境监测场景。

生物芯片设计与实验方法

该生物芯片尺寸为10 × 11 mm，包含9个被指定为工作电极（WE）的ASSISE单元和5个Ag/AgCl参比电极（RE）。每个工作电极（WE）直径为240 μm，与直径为480 μm的参比电极（RE）间距均为1.4 mm。这些电极连接至尺寸为0.5 mm × 0.5 mm的电学接触焊盘。示意图见图2。

采用循环伏安法（CV）和恒电流沉积方法，在Bioanalytical Systems Inc.（BASI）C3电解池装置上进行PEDOT薄膜的电化学聚合（图3）。PEDOT薄膜的对离子根据目标分析离子的种类进行选择。对于H⁺和CO₃^2-，采用以聚苯乙烯磺酸根为对离子的PEDOT（PEDOT/PSS）；而对于Ca²⁺，则使用以硫酸根为对离子的PEDOT（硫酸根以CaSO₄形式加入溶液中）。通过在氧化还原活性溶液（即 2 mM 铁氰化钾（K₃Fe(CN)₆））中进行CV测试，分析PEDOT修饰的工作电极（WE）的电化学性能。根据CV曲线，采用Randles-Sevcik分析法计算有效表面积¹⁰。在MAB工作电极（WEs）上，通过以1,500 rpm转速旋涂，制备厚度约为2 μm的离子选择性膜（ISM）。

微藻生物传感器（MAB）置于充满150 μl藻类培养基的微流控流动池室中；其接触电极与BASI系统电连接（图4）。在环境光照和黑暗条件下监测Chlorella vulgaris的光合作用活性。

方案

1. 用于 H⁺ 和 CO₃^2- 离子的聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸钠) (PEDOT:PSS) 电聚合溶液的制备

1. 将 70 mg 聚（苯乙烯磺酸钠）(Na⁺PSS^-) 加入 10 ml 去离子水（DI 水）中，涡旋振荡至完全分散（约 10 秒）。
2. 向步骤 1.1 的溶液中加入 10.7 μl 3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT），涡旋振荡至溶液完全混合。

2. 用于 Ca²⁺ 离子的聚(3,4-乙烯二氧噻吩):硫酸钙（PEDOT:CaSO₄）电聚合溶液的制备

1. 将136 mg硫酸钙（CaSO₄）加入10 ml去离子水中，涡旋混匀；溶液不会完全分散，呈乳白色。
2. 向步骤2.1中的溶液中加入10.7 μl EDOT，涡旋至完全混合。

3. 基于PEDOT的导电聚合物的电聚合

1. 使用Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3细胞支架（图3）和EC epsilon恒电位仪/恒电流仪构建用于电聚合的电化学池。将EDOT:PSS电聚合溶液置于电化学池中，....

结果

PEDOT:PSS 的循环伏安图（CV）结果示例及其相应的阴极峰电流（i_p）与扫描速率（v_1/2）的关系分别如图5a和图5b所示。PEDOT:CaSO₄ 在不同扫描速率下的循环伏安图及其阴极峰电流未予展示。通过 Randles-Sevcik 分析¹⁰，测得无离子选择性膜的固态接触 PEDOT:PSS 和 PEDOT:CaSO₄ 的有效表面积分别为 4.4 × 10^-11 cm² 和 5.8 × 10^-11 cm²。由于本研究所用电极尺寸约为本课题组先前报道电极尺寸的 1/130，因此这些数值相较于以往报道的电极较小¹¹。需注意，MAB 电极的有效表面积可通过纳米材料修饰表面而得到提升¹¹。

在藻类培养基中储存20天后，基于PEDOT:PSS聚.......

讨论

MAB 生物芯片由 ASSISE 构成，该结构是在铂电极上，以基于 PEDOT 的共轭聚合物（CP）转导层为基底，其上构建离子选择性膜（ISM）而形成的。该组合结构可将目标离子浓度转化为可测量的电信号。稳定的电极电位由 CP 层和 ISM 层共同决定。这两个层还决定了 MAB 的工作寿命以及所测电信号的质量（噪声、漂移）。

PEDOT 因其离子和电子特性（在其氧化形式下）而成为一种特别有吸引力的转导层。PEDOT 具有高氧化还原电容，可最大限度地减少导电电极的极化效应；我们测得其相对于 Ag/AgCl 的稳定氧化还原电位为 153 mV ± 6。这一特性对于使用固态内接触的离子选择性电极（ISE）的电位稳定性至关重要¹²。PEDOT:PSS 共轭聚合物被用作小的一价阳离子（例如 H⁺）和二价阴离子（例如 CO₃^2-）的转导材料。碳酸根选择性电极的非线性斜率曲线源于其对 pH 的依赖性。在微藻测量中，必须同时对 H⁺ 和 CO_3<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,4-乙烯二氧噻吩	Sigma-Aldrich	483028
聚（苯乙烯磺酸钠）	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon 恒电流仪/恒电位仪	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
饱和 Ag/AgCl 参比电极	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
铂网	Alfa Aesar	10283
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P-8131
硝酸钾	J.T. Baker	3190-01
碳酸氢钠	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S-7127
氯化钙	J.T. Baker	1311-01
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
硫酸钙	Sigma-Aldrich	237132
C3 电极支架	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
流动池芯片夹具			定制，由美国宇航局艾姆斯研究中心提供
流动池电学连接装置			定制，由美国宇航局艾姆斯研究中心提供
表2. 特定试剂与设备。