In ovo 鸡胚腹侧中脑中 microRNA 的表达

摘要

异位表达是阐明微小RNA在脑发育中作用的一种技术。然而，利用该方法靶向特定区域时存在 在卵内 电穿孔具有挑战性。在此，我们展示了一种高效选择性电穿孔腹侧和背侧中脑区域的方法。

摘要

非编码RNA在调控基因表达中发挥着重要作用。in ovo靶向电穿孔技术可实现对异位表达microRNA的时空精确控制。然而，腹侧脑区（如腹侧中脑）较难通过常规方法进行操作。本文展示了一种利用铂金细电极将miRNA高效电穿孔至腹侧中脑的有效方法。该技术为中脑特定区域的转染提供了可靠手段，是开展in vivo研究的有力工具。

引言

小非编码RNA被确认为基因表达调控中的新参与者，为基因组编程/基因调控增添了新的复杂性。不同种类的非编码RNA在神经细胞中具有重要功能，包括小非编码RNA^1-4。例如，微小RNA（miR或miRNA）在发育中的大脑中表现出特异且动态变化的表达谱⁵。对鸡胚进行靶向的in ovo电穿孔，可在发育过程中实现基因表达与沉默的时间和空间特异性调控。

本视频展示了利用in ovo电穿孔技术在鸡胚中脑特定区域进行miR异位表达的各个步骤^6-10。为了确保这些小非编码RNA在细胞中具有持久的作用效果，将miR的DNA序列克隆到单顺反子或双顺反子载体中。进行in ovo电穿孔时，通过在蛋壳上开一个小窗口暴露胚胎，将含有miR的载体注射至中脑神经管内。为了转染中脑的特定区域，将小型正极（阳极）和负极（阴极）铂电极置于特定位置。对于腹侧中脑的转染，施加电流前，将阳极置于左侧腹侧中脑下方，阴极置于右侧中脑上方。蛋壳上的开口用胶带封闭，胚胎根据分析所需时间进行孵育。该方法最初由Muramatsu et al.⁶描述，并由Momose et al.⁸改进，以实现特定区域的转染。

示意图概览。

1. 通过在蛋壳上切开一个小窗口，暴露卵内的胚胎。
2. 使用微毛细管将溶解的载体注入中脑。
3. 两个电极——置于胚胎的两侧、下方或上方并相互平行——产生脉冲电场。
4. 电场暂时在细胞膜上形成孔隙，促使带负电荷的DNA（或RNA）被阳极吸引而进入细胞^11,12。

方案

1. 要求 在卵内 电穿孔

1. 准备载体构建： miR正义链和反义链引物根据Ambion的说明设计，退火后连接至经ApaI/EcoRI酶切的pSilencer U6.1载体。成功转化后，选取其中一个阳性克隆进行扩增培养，并使用Qiagen质粒大提试剂盒通过碱裂解法提取pSilencer质粒。
2. 电极： 电极可直接购买或自行制备¹³我们使用自制的铂丝电极（直径 Φ = 0.2、0.25 或 0.5 mm），或在某些情况下使用更细的钨丝电极（直径 Φ = 0.1 mm）⁸ 根据我们想要进行电穿孔的区域而定。为避免组织灼伤，通常遵循的原则是，电极距离组织越近，电极越细。对于中脑的大范围电穿孔，我们使用直径为0.5 mm的铂丝，将其焊接到黄铜/不锈钢制成的管状轴上，并固定于电极夹持器中，电极间距为3–5 mm（图1）。为了对特定区域进行电穿孔，我们使用直径为0.25 mm的铂丝作为阳极，直径为0.2 mm的铂丝或0.1 mm的钨丝作为阴极，电极间距约为1 mm或更小。
3. 溶液： 准备好以下溶液：
   1. 高压灭菌的鸡林格液，pH 7.5（9.0 g NaCl，0.42 g KCl，0.24 g CaCl₂，溶于1 L蒸馏水中）。
   2. PBS（8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH₂PO₄，1.44 g Na₂HPO₄，溶于800 mL去离子水中，用HCl调节pH至7.4，定容至1 L）₂PO4, 1.44 g Na₂HPO₄，溶于1升蒸馏H₂O
   3. 快绿：10 mg/ml 蒸馏水配制的储存液₂O
   4. 慢干墨水（含较少虫胶，因此对胚胎的毒性较低）。注意：使用如 Canto-Soler 和 Adler 所述，在光纤灯上安装蓝色二向色滤光片¹⁴ 增强对比度，并可消除注射墨水的需要。

图1. 电极及电极支架的示意图。（A，B，C） 铂丝焊接在不锈钢管状轴的一侧。在管状轴的另一侧钻有一个孔，以便插入针式插头。（A） 红色和蓝色电线连接至针式插头。在另一端，电线连接至与电穿孔仪电插座兼容的香蕉插头。（A，C） 铂丝被弯曲成90°角。在弯曲处上方的轴上涂有一层指甲油以实现绝缘。

2. 实验前直接准备步骤 在卵内 电穿孔

1. 准备以下材料：
   1. 将墨水用鸡林格液按1:6稀释，加入抗生素-抗真菌素溶液（Gibco的100倍浓缩液）至终浓度为1:100。
   2. 制备载体溶液：将特定DNA溶于H₂O中，浓度为1-2 μg/μl，并加入快绿（Fast Green）至1:20。
   3. 用70%乙醇对镊子、剪刀、钨针和电极进行灭菌处理。
   4. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管（长度与外径比：100 mm x 0.9 mm）拉制用于核酸注射的微电极。我们使用WPI（柏林）的简易拉针仪PUL-1，参数设置见表1。
   5. 按照表2所示设置电穿孔仪的参数。

参数	数值
加热	350
拉力	100
速度	50
延迟	200

表1. PUL-1的设置参数

参数	数值
频率	50 Hz
延迟	20 - 50 msec*
脉宽	20 msec
电压	8-25 V *
脉冲次数	3 - 5 次
*根据电极直径和距离而定。调整任一参数时，请考虑此因素。

表2. 脉冲刺激器的设置参数

2. 准备鸡胚用于电穿孔：
   1. 将受精的鸡卵以长轴朝上的方式在37 °C、65%湿度条件下孵育39小时，以获得处于Hamburger & Hamilton (HH) 9-11期的胚胎¹⁵。胚胎位于鸡蛋的最顶端，因此应使用铅笔标记该位置。
   2. 用70%乙醇对鸡蛋进行消毒。
   3. 在鸡蛋较宽的一端穿刺，此处应为气室所在位置。
   4. 吸出1–2 ml蛋清，以使胚胎与蛋壳分离。
   5. 用透明胶带封住蛋壳，防止碎片落入胚胎区域。使用剪刀沿铅笔标记处剪出一个小窗口。
   6. 向明区下方注入少量墨水，以清晰显示胚胎轮廓。
   7. 用 sharpened tungsten needle 切开卵黄膜，以更方便地接触胚胎，便于后续核酸注射和电穿孔操作。

3. 电穿孔与孵育

1. 在胚胎上滴加几滴温热的任氏液。这有助于降低胚胎温度，防止过热、电极粘连组织，并在两个电极之间提供导电介质。
2. 将载体溶液注射至中脑水平的神经管腔内。如果您的DNA表达载体不含报告基因（例如 EGFP），请在DNA溶液中加入浓度稍低的报告基因载体（1 μg/μl miR表达载体与0.9 μg/μl报告基因载体）。这将确保后续能够识别转染的细胞⁸。我们使用所谓的pCAX载体，由C. Krull惠赠¹³。
3. 为实现中脑的广泛转染，将电极置于胚胎左右两侧，对应中脑高度。电极间距应约为3–5 mm。对于HH 10期胚胎，其他参数设置为15 V、20 msec脉冲宽度和50 msec间隔时间。轻微调整两个电极在中脑背腹轴（DV轴）上的位置，可确保沿背腹轴方向实现更广泛的细胞转染。
4. 进行腹侧转染时，加入一些任氏液使头部从卵黄膜上抬升，并将阳极置于腹侧中脑下方。若头部未抬起，可将电极插入分隔卵黄与胚胎的膜下，以避免灼伤神经管。阴极应置于中脑背外侧，与阳极相对。切勿触碰神经管。我们通常转染中脑左侧腹半区，以避免对心脏发育造成干扰。电极间距约为1–0.5 mm，其余参数设置为10 V、20 msec脉冲宽度和50 msec间隔时间。
5. 再滴加一滴生理盐水覆盖胚胎表面，以降温并去除气泡。
6. 用胶带密封蛋壳，于37°C孵育至少4小时，以满足载体表达所需的最短时间。

4. 鸡胚的固定

1. 从卵中取出胚胎。
2. 在体视显微镜下清洗胚胎，并使用荧光体视显微镜评估转染效率。
3. 在4% PFA中过夜固定胚胎 4°C继续进行切片和/或染色（原位 杂交，免疫组织化学）以分析转染区域的变化。

结果

通过与miR表达载体一同注射的报告载体所表达的GFP，可以观察到中脑区域被miR转染的范围（图2）。使用直径为0.5 mm的铂电极，并将其平行于中脑的前后（AP）轴放置，通常可在背腹（DV）轴和前后（AP）轴方向上实现广泛区域的转染，包括后脑、中脑，有时还包括间脑（图2A和B）。电极的尺寸导致在脑区施加了较宽的电场，从而产生较大的转染区域。

准确靶向腹侧中脑等区域较为困难。通过缩短0.5 mm电极之间的距离以获得更小的电场，通常会对胚胎产生毒性并导致伪影。我们采用了更小直径的电极（0.2 mm、0.25 mm铂电极或0.1 mm sharpened钨丝），可实现更局限的转染，例如难以到达的腹侧脑区（图2C-I）。较小的电极可降低施加的电场强度，并允许将电极更贴近组织插入。图2F展示了一个成功转染整个腹侧中脑的示例。在图2G和2H中，转染的腹侧区域较小，但部分后脑（2F）或间脑（

讨论

本视频展示了一种将质粒有效转染至鸡胚中脑特定区域神经上皮细胞的方法。低电压的矩形电脉冲可在鸡胚体内（in ovo）将DNA导入鸡胚神经管的细胞中^6,16。然而，由于电场范围较宽，通常会通过相对较大的电极（Φ = 0.5 mm）产生，从而影响DNA靶向的精确性。我们尝试依据Momose et al.⁸ 提出的指导原则，采用直径更小的电极来解决这一问题。对于腹侧中脑的转染，我们将阴极置于明区膜下方，或在胚胎发育阶段允许的情况下，直接置于腹侧中脑的下方。后一种操作需要一定的练习，因为阳极不应接触或损伤中脑/神经管组织。加入林格氏液通常有助于将胚胎头部轻微抬离覆盖明区的膜。

我们用手持握两个电极。然而，这需要手部保持平静和稳定，并经过一定练习。由于阴极的位置位于胚胎上方，可将该电极固定在显微操作器上，从而只需手动放置另一个电极。电极若过于靠近胚胎或神经管，会直接灼伤胚胎，导致不良的解剖结构畸形。因此，应针对每组实验仔细调整电压强度，并在放置电极时格外小心。采取这些预防措施可避免操作本身引起的任何形态学、细胞或...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硼硅酸盐玻璃毛细管	Hartenstein		型号：0.9 mm
微毛细管拉制仪	WPI, Berlin		型号：Pul1-E
电穿孔仪	Intracel		型号：TSSIC
荧光体视显微镜	LEICA		型号：MZFLIII
体视显微镜	Zeiss		型号：Stemi
相机及软件	Zeiss		型号：Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8