In ovo 鸡胚腹侧中脑中 microRNA 的表达

摘要

异位表达是阐明微小RNA在脑发育中作用的一种技术。然而，利用该方法靶向特定区域时存在 在卵内 电穿孔具有挑战性。在此，我们展示了一种高效选择性电穿孔腹侧和背侧中脑区域的方法。

摘要

非编码RNA在调控基因表达中发挥着重要作用。in ovo靶向电穿孔技术可实现对异位表达microRNA的时空精确控制。然而，腹侧脑区（如腹侧中脑）较难通过常规方法进行操作。本文展示了一种利用铂金细电极将miRNA高效电穿孔至腹侧中脑的有效方法。该技术为中脑特定区域的转染提供了可靠手段，是开展in vivo研究的有力工具。

引言

小非编码RNA被确认为基因表达调控中的新参与者，为基因组编程/基因调控增添了新的复杂性。不同种类的非编码RNA在神经细胞中具有重要功能，包括小非编码RNA^1-4。例如，微小RNA（miR或miRNA）在发育中的大脑中表现出特异且动态变化的表达谱⁵。对鸡胚进行靶向的in ovo电穿孔，可在发育过程中实现基因表达与沉默的时间和空间特异性调控。

本视频展示了利用in ovo电穿孔技术在鸡胚中脑特定区域进行miR异位表达的各个步骤^6-10。为了确保这些小非编码RNA在细胞中具有持久的作用效果，将miR的DNA序列克隆到单顺反子或双顺反子载体中。进行in ovo电穿孔时，通过在蛋壳上开一个小窗口暴露胚胎，将含有miR的载体注射至中脑神经管内。为了转染中脑的特定区域，将小型正极（阳极）和负极（阴极）铂电极置于特定位置。对于腹侧中脑的转染，施加电流前，将阳极置于左侧腹侧中脑下方，阴极置于右侧中脑上方。蛋壳上的开口用胶带封闭，胚胎根据分析所需时间进行孵育。该方法最初由Muramatsu et al.⁶描述，并由Momose et al.⁸改进，以实现特定区域的转染。

方案

1. 要求 在卵内 电穿孔

1. 准备载体构建： miR正义链和反义链引物根据Ambion的说明设计，退火后连接至经ApaI/EcoRI酶切的pSilencer U6.1载体。成功转化后，选取其中一个阳性克隆进行扩增培养，并使用Qiagen质粒大提试剂盒通过碱裂解法提取pSilencer质粒。
2. 电极： 电极可直接购买或自行制备¹³我们使用自制的铂丝电极（直径 Φ = 0.2、0.25 或 0.5 mm），或在某些情况下使用更细的钨丝电极（直径 Φ = 0.1 mm）⁸ 根据我们想要进行电穿孔的区域而定。为避免组织灼伤，通常遵循的原则是，电极距离组织越近，电极越细。对于中脑的大范围电穿孔，我们使用直径为0.5 mm的铂丝，将其焊接到黄铜/不锈钢制成的管状轴上，并固定于电极夹持器中，电极间距为3–5 mm（图1）。为了对特定区域进行电穿孔，我们使用直径为0.25 mm的铂丝作为阳极，直径为0.2 mm的铂丝或0.1 mm的钨丝作为阴极，电极间距约为1 mm或更小。
3. 溶液： 准备好以下溶液：
   1. 高压灭菌的鸡林格液，pH 7.5（9.0 g NaCl，0.42 g KCl，0.24 g CaCl₂，溶于1 L蒸馏水中）。....

结果

通过与miR表达载体一同注射的报告载体所表达的GFP，可以观察到中脑区域被miR转染的范围（图2）。使用直径为0.5 mm的铂电极，并将其平行于中脑的前后（AP）轴放置，通常可在背腹（DV）轴和前后（AP）轴方向上实现广泛区域的转染，包括后脑、中脑，有时还包括间脑（图2A和B）。电极的尺寸导致在脑区施加了较宽的电场，从而产生较大的转染区域。

准确靶向腹侧中脑等区域较为困难。通过缩短0.5 mm电极之间的距离以获得更小的电场，通常会对胚胎产生毒性并导致伪影。我们采用了更小直径的电极（0.2 mm、0.25 mm铂电极或0.1 mm sharpened钨丝），可实现更局限的转染，例如难以到达的腹侧脑区（图2C-I）。较小的电极可降低施加的电场强度，并允许将电极更贴近组织插入。图2F展示了一个成功转染整个腹侧中脑的示例。在图2G和2H中，转染的腹侧区域较小，但部分后脑（2F）或间脑（

讨论

本视频展示了一种将质粒有效转染至鸡胚中脑特定区域神经上皮细胞的方法。低电压的矩形电脉冲可在鸡胚体内（in ovo）将DNA导入鸡胚神经管的细胞中^6,16。然而，由于电场范围较宽，通常会通过相对较大的电极（Φ = 0.5 mm）产生，从而影响DNA靶向的精确性。我们尝试依据Momose et al.⁸ 提出的指导原则，采用直径更小的电极来解决这一问题。对于腹侧中脑的转染，我们将阴极置于明区膜下方，或在胚胎发育阶段允许的情况下，直接置于腹侧中脑的下方。后一种操作需要一定的练习，因为阳极不应接触或损伤中脑/神经管组织。加入林格氏液通常有助于将胚胎头部轻微抬离覆盖明区的膜。

我们用手持握两个电极。然而，这需要手部保持平静和稳定，并经过一定练习。由于阴极的位置位于胚胎上方，可将该电极固定在显微操作器上，从而只需手动放置另一个电极。电极若过于靠近胚胎或神经管，会直接灼伤胚胎，导致不良的解剖结构畸形。因此，应针对每组实验仔细调整电压强度，并在放置电极时格外小心。采取这些预防措施可避免操作本身引起的任何形态学、细胞或.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硼硅酸盐玻璃毛细管	Hartenstein		型号：0.9 mm
微毛细管拉制仪	WPI, Berlin		型号：Pul1-E
电穿孔仪	Intracel		型号：TSSIC
荧光体视显微镜	LEICA		型号：MZFLIII
体视显微镜	Zeiss		型号：Stemi
相机及软件	Zeiss		型号：Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8