基因功能分析和可视化的纤毛产生的流体流动的在枯否囊泡中

Summary

纤毛产生的流体流动在枯否囊泡（KV）控制的斑马鱼胚胎的左右模式。在这里，我们描述了一种技术，调节基因的功能，特别是在KV细胞。此外，我们展示了如何提供KV可视化流体流动的荧光珠。

Abstract

内部器官，如心脏，大脑和肠道左右（LR）为他们的正常功能是至关重要的不对称性。运动纤毛参与建立LR的不对称性在脊椎动物胚胎，包括老鼠，青蛙和斑马鱼^2-6。这些'LR的纤毛'产生不对称的流体流动是必要的，以触发一个保守的不对称交点（TGF-β超家族）的信号级联在左侧侧板中胚层，这被认为是提供开发机关⁷ LR构图信息。因此，理解机制LR构图，它是必不可少的，以确定基因调节的LR纤毛细胞的组织，运动和长度LR纤毛和他们的能力，以产生强大的非对称流。

在斑马鱼胚胎中，LR纤毛位于巨噬泡^{（KV）2,4,5。} KV是由一个单一的层monociliated上皮细胞，附上一个充满液体的腔。 KV是来自一组被称为的背先行者细胞（DFCS）迁移外包阶段在背胚率在^8,9〜20-30细胞的命运映射。在早期的体节阶段，DFC的集群，并分化成纤毛上皮细胞，形成KV中的胚胎^10,11 tailbud。结合的光学透明度和快速发展的斑马鱼胚胎斑马鱼KV一个很好的模型系统来研究，LR纤毛细胞能够识别和跟踪八间指定流感诊所求诊。

有趣的是，DFC / KV细胞谱系的祖细胞保留蛋黄细胞的细胞质之间的桥梁，受精后4小时（HPF）的，而蛋黄细胞和其他接近⁸高倍视野2后的胚胎干细胞的细胞质之间的桥梁。利用这些细胞的桥梁，我们开发了一个特定阶段的喷油策略提供吗啉代寡otides（密苏里州）专门DFC的和击倒的目标基因的功能，在这些细胞中^12。这技术创造嵌合体胚胎基因的功能被撞倒在发展的背景下，野生型胚胎的DFC / KV血统的。在KV，我们要分析非对称流体流动注射荧光微球到KV珠流明，并记录运动时，通过电视显微镜^2。流体流动是易于可视化和可量化的跟踪珠位移随着时间的推移。

在这里，使用特定的阶段，的DFC-针对性的基因敲除技术和注射荧光微球KV可视化流程，我们提出了一个协议，提供了一个有效的方法来描述一个特定基因的作用在KV的发育和功能。

Protocol

概述特定阶段的斑马鱼胚胎注射液

反义吗啉代寡核苷酸（MO），结合到靶mRNA和蛋白表达，转录干扰，被广泛用于基因敲除（损失函数）的研究斑马鱼^13,14。基因的工具，LLC提供的MO，无论是羧基发出绿色荧光的或丽丝胺（发出红色荧光）的检测MO注射的胚胎中，使用荧光显微镜的标签。通过注入MO到蛋黄细胞在斑马鱼发育的不同阶段中，它能够提供的MO胚胎的具体的室中（ 图1A-F）。 MO注射成之间的蛋黄1-4细胞阶段（0-1 HPF）的进入所有胚胎细胞（ 图1A，D，D'）， 通过连接与蛋黄的持续存在，直到32 -细胞阶段^15，以促进全球击倒。 MO注射到蛋黄期间midblast乌拉阶段（2.5-3 HPF）的可以输入DFC的（ 图1B中，E，E'）可能是通过胞质桥⁸和敲除基因的功能专门在DFC / KV细胞谱系^12，而不进入大多数其它胚胎细胞谱系的祖。作为一个重要的控制测试基因功能是否需要在DFC / KV或也蛋黄^12,16，但也可以限制密苏里蛋黄细胞注射后之间的圆顶30％外包阶段（〜4.5 HPF）的已经关闭了所有的胞质桥（ 图1C，F，F'）。这些注射已被组合使用，以分析基因功能DFC / KV细胞

Results

图1给出了一个流程图，用于测试基因功能DFC / KV细胞和如何引入荧光珠的可视化流体流的喷射策略阶段特异性的MO注射提供了一种有用的方法来分析基因功能的特定的室中的胚胎。在KV。在成功阶段特异性注射胚胎的是，荧光的MO分布示意性地示出在图2中，在图1D-F和在活胚胎。一个不成功的MO注射，在其中的MO仍然在蛋黄细胞聚集， 如图2D所示。

成功注入胚胎选择基于MO-4-6体节交付到KV腔（ 图1G-H）的荧光微珠流体流动分析阶段可以安装在本地化的荧光。电视显微镜是用来记录胎圈变动KV（ 图1I-J），其中可以定性分析（ 图3A-B）或定量（ 图3C-E）的使用ImageJ软件。在正常流动的控制胚胎，珠后续逆时针路径，可以可视化通过使荧光珠的位置随着时间的推移（ 图.......

Discussion

使用特定阶段的目标MO注射到DFC / KV细胞系是一个非常有用的方法来研究基因功能的细胞自主性，避免多效性所造成的全球基因敲除的表型。然而，这些注射可以在技术上具有挑战性。注射液的MO之间的256细胞和1000细胞的阶段，可能会导致在三种可能的结果:1）在MO仍然聚集在注射部位，2）的MO整个蛋黄扩散并进入DFC / KV细胞或3）的MO整个蛋黄，进入DFC / KV细胞和胚胎干细胞的扩散。因此，在这个实验中，选择其中MO专门DFC / KV细胞移动的胚胎是一个关键步骤。重要的是要注意，MO可以加载到所有DFC / KV细胞，但这些细胞¹⁰往往仅输入的一个子集。这马赛克定位的原因仍不清楚，但可能反映如何有效的MO通过蛋黄和/或所述定时关闭IND移动的变异ividual之间的桥梁，蛋黄和DFC祖。我们还没有发现条件，提高靶向性，而是依赖于选择中，大多数的KV细胞已经采取了MO的胚胎。 MO在大多数的DFC / KV细胞生成胚胎的成功率通常〜20％至30％，但，这个可以相当变数日常的。出于这个原因，我们建议注入尽可能多的尽可能的胚胎（≥100），然后小心地选择具有适当分布的荧光吗啉代的胚胎。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号
标准控制寡里沙明标记	基因工具，LLC
定制Rock2b吗啉代寡核苷酸	基因工具，LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5微米的微球	Polysciences的公司	24054