基因功能分析和可视化的纤毛产生的流体流动的在枯否囊泡中

Summary

纤毛产生的流体流动在枯否囊泡（KV）控制的斑马鱼胚胎的左右模式。在这里，我们描述了一种技术，调节基因的功能，特别是在KV细胞。此外，我们展示了如何提供KV可视化流体流动的荧光珠。

Abstract

内部器官，如心脏，大脑和肠道左右（LR）为他们的正常功能是至关重要的不对称性。运动纤毛参与建立LR的不对称性在脊椎动物胚胎，包括老鼠，青蛙和斑马鱼^2-6。这些'LR的纤毛'产生不对称的流体流动是必要的，以触发一个保守的不对称交点（TGF-β超家族）的信号级联在左侧侧板中胚层，这被认为是提供开发机关⁷ LR构图信息。因此，理解机制LR构图，它是必不可少的，以确定基因调节的LR纤毛细胞的组织，运动和长度LR纤毛和他们的能力，以产生强大的非对称流。

在斑马鱼胚胎中，LR纤毛位于巨噬泡^{（KV）2,4,5。} KV是由一个单一的层monociliated上皮细胞，附上一个充满液体的腔。 KV是来自一组被称为的背先行者细胞（DFCS）迁移外包阶段在背胚率在^8,9〜20-30细胞的命运映射。在早期的体节阶段，DFC的集群，并分化成纤毛上皮细胞，形成KV中的胚胎^10,11 tailbud。结合的光学透明度和快速发展的斑马鱼胚胎斑马鱼KV一个很好的模型系统来研究，LR纤毛细胞能够识别和跟踪八间指定流感诊所求诊。

有趣的是，DFC / KV细胞谱系的祖细胞保留蛋黄细胞的细胞质之间的桥梁，受精后4小时（HPF）的，而蛋黄细胞和其他接近⁸高倍视野2后的胚胎干细胞的细胞质之间的桥梁。利用这些细胞的桥梁，我们开发了一个特定阶段的喷油策略提供吗啉代寡otides（密苏里州）专门DFC的和击倒的目标基因的功能，在这些细胞中^12。这技术创造嵌合体胚胎基因的功能被撞倒在发展的背景下，野生型胚胎的DFC / KV血统的。在KV，我们要分析非对称流体流动注射荧光微球到KV珠流明，并记录运动时，通过电视显微镜^2。流体流动是易于可视化和可量化的跟踪珠位移随着时间的推移。

在这里，使用特定的阶段，的DFC-针对性的基因敲除技术和注射荧光微球KV可视化流程，我们提出了一个协议，提供了一个有效的方法来描述一个特定基因的作用在KV的发育和功能。

Protocol

概述特定阶段的斑马鱼胚胎注射液

反义吗啉代寡核苷酸（MO），结合到靶mRNA和蛋白表达，转录干扰，被广泛用于基因敲除（损失函数）的研究斑马鱼^13,14。基因的工具，LLC提供的MO，无论是羧基发出绿色荧光的或丽丝胺（发出红色荧光）的检测MO注射的胚胎中，使用荧光显微镜的标签。通过注入MO到蛋黄细胞在斑马鱼发育的不同阶段中，它能够提供的MO胚胎的具体的室中（ 图1A-F）。 MO注射成之间的蛋黄1-4细胞阶段（0-1 HPF）的进入所有胚胎细胞（ 图1A，D，D'）， 通过连接与蛋黄的持续存在，直到32 -细胞阶段^15，以促进全球击倒。 MO注射到蛋黄期间midblast乌拉阶段（2.5-3 HPF）的可以输入DFC的（ 图1B中，E，E'）可能是通过胞质桥⁸和敲除基因的功能专门在DFC / KV细胞谱系^12，而不进入大多数其它胚胎细胞谱系的祖。作为一个重要的控制测试基因功能是否需要在DFC / KV或也蛋黄^12,16，但也可以限制密苏里蛋黄细胞注射后之间的圆顶30％外包阶段（〜4.5 HPF）的已经关闭了所有的胞质桥（ 图1C，F，F'）。这些注射已被组合使用，以分析基因功能DFC / KV细胞^17-24。为了评估中流体流量的KV，荧光微珠注入对KV管腔之间的6-10体节阶段（12-14高倍视野），然后立即使用电视显微镜（ 图1G-J）成像。微珠可发出红色或绿色荧光（或两者）的，所以它是可以使用不同的图像荧光微球和MO的渠道。

1。特定阶段的注射液的吗啉代（密苏里州）

MO注射到斑马鱼的胚胎已被证明以前^25,26。在这里，我们简要地描述特定阶段的MO注射。所有注射之后，胚胎转移到陪替氏培养皿，并在28.5℃的孵育

1. 全球MO注射:收集胚胎受精后，立即将其装入一个喷射板。荧光MO加载到毛细管针，针安装到微量注射器（ 如哈佛设备PLI-90的Pico-喷油器）。额的针尖和调整喷射设置（压力和/或时间），以创建具有一定体积的1 NL所描述^25,26注射降使用解剖体视显微镜，注入1 NL到蛋黄的MO（ 图1A）的≥50胚胎每个实验。快速完成注射液的4芯雄鹿E。
2. DFC的目标MO注射:收集后立即受精的胚胎和孵化为28.5°C。 ，当胚胎已经达到256个细胞的阶段（约2.5 HPF），快速加载的喷射板，然后注入到蛋黄≥100之间的256细胞和1000细胞阶段的胚胎（ 图 1 NL荧光MO 1B）。
3. 卵黄的目标MO注射:收集胚胎受精和孵化后立即为28.5°C。在圆顶阶段（〜4 HPF）的，加载的胚胎成喷射板，然后注入荧光MO 1 NL≥100胚胎之间的圆顶和30％外包阶段（ 图1C）的蛋黄。

2。选择注射的胚胎分析

1. 当MO注射胚胎达到75％外包阶段（8 HPF），去除未受精和死胚，然后屏幕活胚胎在荧光显微镜分布的荧光MO。然后分配瓦特选择胚胎发育为28.5°C。
   1. 对于全球密苏里注射，选择胚胎荧光均匀地分布在整个所有的胚胎干细胞（ 图1D，图2A）。
   2. DFC目标MO注射，胚胎荧光MO已扩散到蛋黄，似乎集中在背胚率（DFCS）（ 图1E;图2B）。在这个阶段中，也可以是难以可视化荧光DFC的由于在底层卵黄明亮的荧光。小心排除胚胎的荧光MO纳入胚胎干细胞以外的其他八间指定流感诊所求诊或聚集在注射部位（ 图2D）。
   3. 对于蛋黄目标MO注射，选择其中MO荧光均匀地分布在整个蛋黄并没有观察到任何胚胎干细胞（ 图1F，图2C）中的胚胎。同样，取出胚胎的荧光MO仍然聚集在注射部位。
2. 之间的2-4-体节阶段（〜11 HPF）的，屏幕胚胎在荧光显微镜下，使用更高的放大倍率的第二时间。然后让选定的胚胎发育为28.5°C。
   1. 对于全球MO注射，确保选定的胚胎具有MO荧光均匀地分布在KV和所有的胚胎干细胞（ 图1D，图2E）。
   2. 对于有针对性的DFC-MO注射，精心选择胚胎，MO荧光只有在KV细胞和蛋黄（ 图1E）。转基因胚胎表达GFP KV细胞，例如作为^{Tg（DUSP6:d2EGFP）27，}可以帮助识别在其中MO已成功交付至KV细胞（ 图2F）的胚胎。放弃MO荧光另一方面，KV细胞在胚胎干细胞的胚胎。
   3. 蛋黄目标MO注射，选择MO荧光的胚胎，只在蛋黄（ 图1F:图2G）。

3。安装胚胎在KV流体流动分析

1. 分析非对称流体流动的KV全球MO，DFC有针对性的MO或蛋黄目标MO注射胚胎，仔细dechorionate的〜20胚体节间4-6级（11-12 HPF）用锋利的镊子。
2. 准备到5ml管作为干浴中的液体保持在42℃下的50毫升的1％低熔点琼脂糖和等分试样
3. 一个胚胎转移到玻璃抑郁症幻灯片（美国科学用品公司），并尽可能删除尽可能多的水。固定化的胚胎通过添加足够温暖的1％低熔点琼脂糖刚好盖住胚胎（太多琼脂糖可以干扰随后的成像）。琼脂糖凝固，使用产钳的位置，胚胎等，KV朝上（背视图）（ 图1H）。安装10每张幻灯片的一个胚胎的胚胎。快速地工作，以确保在下一步骤中的所有注射​​并发症eted由10个体节阶段（14 HPF）的。

4。荧光微球注射到KV

1. 稀释Fluoresbrite Multifuorescent 0.5微米直径的微球（Polysciences的公司）在无菌水中至1:50在1.5ml Eppendorf管中。
2. 1:50稀释的微珠混合彻底攻管和加载3微升毛细管针。使用的微量注射器用于MO注射（ 如哈佛设备PLI-90的Pico-注射器），打破了针尖，镊子和调整注入的设置，以产生尽可能小的（<0.5 NL）注射下降。
3. 在解剖显微镜下，对齐与KV针内腔中的第一安装胚胎。将针头插入管腔和注入体积小（<0.5 nl）的珠（ 图1G）。一个小针尖小的注射量是关键，以避免损坏KV。
4. 注射所有安装胚胎。一旦胚胎injecte的d，a将一滴无菌水可以添加琼脂糖上，以防止其干燥。珠粒的注射过程中，往往会阻碍针开口。这需要重新打破的针尖和调整通过调节压力或时间设定的显微注射装置的注射量。更换针头变钝，在注射过程中造成重大损害。
5. 屏幕注射的胚胎为成功交付珠一个堂堂正正的荧光化合物显微镜下（ 例如蔡司AxioImager M1）使用20倍的目标。首先，确定是否使用明视场照明（ 图1J）KV结构是完整的，然后用荧光观察珠粒。选择在珠是和里面的KV流明的胚胎。丢弃在KV KV损坏或不漂珠的胚胎。这是很容易会错过的KV，并提供附近的组织或相关蛋黄珠。如果不成功，安装ANOTHER 10个胚胎，并重复注射过程。

5。 KV流体流量的可视化和分析

1. 对于每个选定的胚胎KV珠内，加一滴无菌水覆盖琼脂糖，然后使用63X水浸泡目标（ 图1I）直立荧光化合物显微镜下观察KV。可替换地，可以应用于用于与非水浸渍的目标和/或倒置显微镜盖玻片。
2. 使用高速摄像机安装在显微镜上（ 例如蔡司AxioCamHSm）录制10秒的电影。记录使用明场或微分干涉相差（DIC）的信道使用的荧光通道（约70帧/秒），和对KV管腔的珠粒。
3. 为了形象化所有珠的动作，随着时间的推移，进口电影的荧光珠ImageJ软件（免费下载http://rsb.info.nih.gov/ij/ ）一的第二创建一个最大投影在电影中所有的荧光信号。要执行ImageJ的最大投影中，单击"图片→栈→Z项目。"在"Z项目"窗口中，项目全部与投影片类型的"最大强度"。此图像可以叠加在DIC的图像，其中珠粒成像（ 图3A-B）的KV。
4. 个人珠的变动可以使用ImageJ进行跟踪。可以下载一个插件（"手动跟踪"）在http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html 。打开荧光微球在ImageJ的电影和运行的手动追踪功能。手动跟踪，在该窗口中，选中"显示参数"和"时间间隔"和"X / Y校正"的输入参数。手动选择保持≥50帧的电影在焦平面的珠子，然后跟踪≥5珠，每胎。每个胎圈的路径和速度所产生的次e软件（ 图3 CD）。

Results

图1给出了一个流程图，用于测试基因功能DFC / KV细胞和如何引入荧光珠的可视化流体流的喷射策略阶段特异性的MO注射提供了一种有用的方法来分析基因功能的特定的室中的胚胎。在KV。在成功阶段特异性注射胚胎的是，荧光的MO分布示意性地示出在图2中，在图1D-F和在活胚胎。一个不成功的MO注射，在其中的MO仍然在蛋黄细胞聚集， 如图2D所示。

成功注入胚胎选择基于MO-4-6体节交付到KV腔（ 图1G-H）的荧光微珠流体流动分析阶段可以安装在本地化的荧光。电视显微镜是用来记录胎圈变动KV（ 图1I-J），其中可以定性分析（ 图3A-B）或定量（ 图3C-E）的使用ImageJ软件。在正常流动的控制胚胎，珠后续逆时针路径，可以可视化通过使荧光珠的位置随着时间的推移（ 图...

Discussion

使用特定阶段的目标MO注射到DFC / KV细胞系是一个非常有用的方法来研究基因功能的细胞自主性，避免多效性所造成的全球基因敲除的表型。然而，这些注射可以在技术上具有挑战性。注射液的MO之间的256细胞和1000细胞的阶段，可能会导致在三种可能的结果:1）在MO仍然聚集在注射部位，2）的MO整个蛋黄扩散并进入DFC / KV细胞或3）的MO整个蛋黄，进入DFC / KV细胞和胚胎干细胞的扩散。因此，在这个实验中，选择其中MO专门DFC / KV细胞移动的胚胎是一个关键步骤。重要的是要注意，MO可以加载到所有DFC / KV细胞，但这些细胞¹⁰往往仅输入的一个子集。这马赛克定位的原因仍不清楚，但可能反映如何有效的MO通过蛋黄和/或所述定时关闭IND移动的变异ividual之间的桥梁，蛋黄和DFC祖。我们还没有发现条件，提高靶向性，而是依赖于选择中，大多数的KV细胞已经采取了MO的胚胎。 MO在大多数的DFC / KV细胞生成胚胎的成功率通常〜20％至30％，但，这个可以相当变数日常的。出于这个原因，我们建议注入尽可能多的尽可能的胚胎（≥100），然后小心地选择具有适当分布的荧光吗啉代的胚胎。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号
标准控制寡里沙明标记	基因工具，LLC
定制Rock2b吗啉代寡核苷酸	基因工具，LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5微米的微球	Polysciences的公司	24054