库普弗囊泡中基因功能分析及纤毛驱动液体流动的可视化

摘要

Kupffer’s囊泡（KV）中纤毛产生的液体流动控制着斑马鱼胚胎的左右模式形成。本文中，我们描述了一种特异性调控KV细胞基因功能的技术。此外，我们还展示了如何将荧光微珠导入KV以可视化液体流动。

摘要

心脏、大脑和肠道等内脏器官在发育过程中会形成左右（LR）不对称性，这种不对称性对其正常功能至关重要¹。在包括小鼠、青蛙和斑马鱼在内的脊椎动物胚胎中，运动性纤毛参与建立这种左右不对称性^2-6。这些“左右纤毛”能够产生不对称的液体流动，从而触发左侧侧板中胚层中保守的不对称Nodal（TGF-β超家族）信号级联反应，该信号被认为可为发育中的器官提供左右模式信息⁷。因此，要理解左右模式形成的机制，关键在于鉴定那些调控左右纤毛细胞排列、左右纤毛的运动能力与长度，以及其产生稳定不对称流体流动能力的基因。

在斑马鱼胚胎中，左右不对称性纤毛位于库普弗囊（Kupffer's vesicle, KV）^2,4,5。KV 由单层单纤毛上皮细胞构成，包裹着一个充满液体的腔室。命运图谱研究表明，KV 起源于一群约 20–30 个被称为背侧前导细胞（dorsal forerunner cells, DFCs）的细胞，这些细胞在表胚层扩展阶段沿背侧胚层边缘迁移^8,9。在早期体节阶段，DFCs 聚集成簇并分化为具纤毛的上皮细胞，于胚胎尾芽处形成 KV^10,11。由于能够识别和追踪 DFCs，加之斑马鱼胚胎具有光学通透性强和发育迅速的特点，使得斑马鱼 KV 成为研究左右不对称性纤毛细胞的优良模型系统。

有趣的是，DFC/KV细胞谱系的前体细胞与卵黄细胞之间的胞质桥可保留至受精后4小时（hpf），而卵黄细胞与其他胚胎细胞之间的胞质桥则在受精后2小时（hpf）即关闭。⁸利用这些细胞质桥，我们开发了一种阶段特异性的注射策略，可将吗啉代寡核苷酸（MO）特异性地递送至DFCs，从而在这些细胞中敲低目标基因的功能¹²该技术可产生嵌合胚胎，其中在野生型胚胎背景下，DFC/KV谱系中的基因功能被敲低。为分析KV中的不对称液体流动，我们将荧光微珠注入KV腔内，并通过视频显微镜记录微珠的运动情况。²通过追踪随时间推移的微珠位移，可轻松实现流体流动的可视化与定量分析。

本文利用特定发育阶段的 DFC 靶向基因敲降技术，并通过向 KV 中注射荧光微珠以可视化液流，提供了一种有效表征特定基因在 KV 发育与功能中作用的实验方案。

方案

斑马鱼胚胎特异性发育阶段注射操作概述

反义吗啉代寡核苷酸（MO）可结合特定靶向mRNA并阻断该转录本的蛋白表达，广泛用于斑马鱼基因敲低（功能缺失）研究^13,14Gene Tools, LLC 提供带有羧基荧光素（发出绿色荧光）或丽丝胺（发出红色荧光）标记的吗啉代寡核苷酸（MO），可通过荧光显微镜检测注射后胚胎中的 MO。通过在斑马鱼发育的不同阶段将 MO 注射至卵黄细胞，可将 MO 递送至胚胎的特定区域图1A-F）。在1-4细胞期（0-1 hpf）将MO注射到卵黄中，可使其进入所有胚胎细胞图1A、D、D') 通过 持续至32细胞期的卵黄连接¹⁵ 以实现全局敲降。在囊胚中期（2.5–3 hpf）将吗啉代寡核苷酸（MO）注射到卵黄中，可使其进入DFC前体细胞图1B、E、E'可能通过胞质桥⁸ 并在DFC/KV细胞谱系中特异性敲低基因功能¹²，而不进入大多数其他胚胎细胞谱系。作为重要对照，用于检测基因功能是否仅在 DFC/KV 中需要，还是在卵黄中也需要^12,16，也可以通过在所有胞质桥闭合后的大约4.5 hpf（即包被期至30%外包期之间）将MO注射至卵黄细胞，从而将其限制在卵黄细胞内。图1C、F、F'）。这些注射已被联合用于分析DFC/KV细胞中的基因功能^17-24在6-10体节期（12-14 hpf）将荧光微珠注入KV腔内，以评估KV中的液体流动，随后立即通过视频显微镜进行成像图1G-J）。市面上有可发出红色或绿色荧光（或同时发出两种荧光）的微珠，因此可以使用不同的通道分别对荧光微珠和显微镜油（MO）进行成像。

1. 特定阶段注射吗啉寡核苷酸（MO）

先前已有研究证明了将吗啉代寡核苷酸（MO）注射到斑马鱼胚胎中的方法^25,26。本文简要描述了特定发育阶段的MO注射操作。所有注射完成后，将胚胎转移至培养皿中，并在28.5 °C下孵育。

1. 全局MO注射：在受精后立即收集胚胎，并将其装入注射板中。将荧光标记的MO吸入毛细玻璃针中，并将针头安装至显微注射仪上。例如 Harvard Apparatus PLI-90 Pico-注射器）。折断针尖并调整注射参数（压力和/或时间），以制备体积为1 nl的注射液滴，具体操作如所述^25,26使用解剖体视显微镜，将1 nl的MO注射到卵黄中（图1A每次实验至少使用50个胚胎。操作需迅速，确保在4细胞期前完成注射。
2. 靶向DFC的MO注射：受精后立即收集胚胎，并在28.5 °C下培养。当胚胎发育至256细胞期（约2.5 hpf）时，迅速将其转移至注射用培养皿中，并在256细胞期至1,000细胞期之间，向≥100个胚胎的卵黄内各注射1 nl荧光标记的MO（morpholino）图1B).
3. 卵黄靶向吗啉代寡核苷酸注射：受精后立即收集胚胎，并在28.5 °C下培养。在囊胚期（约4 hpf），将胚胎装载至注射板中，随后在囊胚期至30%外包期之间的阶段，向≥100个胚胎的卵黄内注射1 nl荧光标记的吗啉代寡核苷酸图1C).

2. 选择用于分析的注射胚胎

1. 当注射 Morpholino（MO）的胚胎发育至 75% 包被期（8 hpf）时，移除未受精和死亡的胚胎，然后在荧光解剖显微镜下筛选存活胚胎，观察荧光标记 MO 的分布情况。随后将筛选出的胚胎置于 28.5 °C 条件下继续培养。
   1. 对于全胚胎 MO 注射，选择荧光信号均匀分布于所有胚胎细胞中的胚胎（图 1D；图 2A）。
   2. 对于 DFC 靶向 MO 注射，选择荧光 MO 已扩散至卵黄并在胚盘背侧边缘（DFCs）富集的胚胎（图 1E；图 2B）。在此阶段，由于下方卵黄荧光较强，可能难以清晰观察到 DFCs 的荧光信号。需仔细排除荧光 MO 进入除 DFCs 以外其他胚胎细胞或仍聚集于注射位点的胚胎（图 2D）。
   3. 对于卵黄靶向 MO 注射，选择荧光 MO 仅均匀分布于卵黄且在任何胚胎细胞中均未检测到信号的胚胎（图 1F；图 2C）。同样，排除荧光 MO 仍聚集于注射位点的胚胎。
2. 在 2–4 体节期之间（约 11 hpf），再次使用更高倍率的荧光显微镜对胚胎进行二次筛选。随后将筛选出的胚胎继续在 28.5 °C 条件下培养。
   1. 对于全胚胎 MO 注射，确保所选胚胎的 Kupffer's vesicle（KV）及所有胚胎细胞中均均匀分布有 MO 荧光信号（图 1D'；图 2E）。
   2. 对于 DFC 靶向 MO 注射，仔细挑选仅在 KV 细胞和卵黄中显示 MO 荧光的胚胎（图 1E'）。表达 GFP 标记的转基因胚胎（如 Tg(Dusp6:d2EGFP)²⁷）有助于识别 MO 成功递送至 KV 细胞的个体（图 2F）。弃除在 KV 细胞以外其他胚胎细胞中出现 MO 荧光的胚胎。
   3. 对于卵黄靶向 MO 注射，选择 MO 荧光仅局限于卵黄中的胚胎（图 1F'；图 2G）。

3. 固定胚胎以分析Kupffer囊泡中的液体流动

1. 为了分析注射了全局吗啉代（global MO）、DFC靶向吗啉代（DFC-targeted MO）或卵黄靶向吗啉代（yolk-targeted MO）的胚胎中Kupffer's囊泡（KV）内的不对称液体流动，使用尖头镊子小心地去除约20个处于4-6体节期（约11-12 hpf）胚胎的卵膜。
2. 配制50 ml的1%低熔点琼脂糖，并分装至5 ml离心管中，置于42 °C干浴装置中保温，保持液态。
3. 将一个胚胎转移至玻璃凹面载玻片（United Scientific Supplies, Inc.）上，并尽可能去除多余的水。加入适量温热的1%低熔点琼脂糖，刚好覆盖胚胎即可（过多琼脂糖可能干扰后续成像）。在琼脂糖凝固过程中，使用镊子调整胚胎位置，使Kupffer's囊泡朝上（背侧视图）（图1H）。每个载玻片上固定一个胚胎，共制备10个样本。操作需迅速，确保在10体节期（14 hpf）前完成下一步的所有注射操作。

4. 将荧光微珠注入KV

1. 将Fluoresbrite Multifuorescent 0.5微米直径微球（Polysciences, Inc.）用无菌水按1:50比例稀释至1.5 ml Eppendorf管中。
2. 将磁珠按1:50稀释后，通过轻敲离心管充分混匀，取3 μl加入毛细玻璃针中。使用与MO注射相同的显微注射仪（例如 Harvard Apparatus PLI-90 Pico-注射器），用镊子折断针尖，并调整注射参数以产生尽可能小的（<0.5 nl 注射液滴
3. 在解剖显微镜下，将针头与第一个已固定的胚胎的KV腔对齐。将针头插入腔内，并注入少量液体（< 0.5 nl）的珠子（beads）（图1G）。针尖尺寸较小且注射体积较小对于避免损伤KV至关重要。
4. 注射所有已固定的胚胎。一旦完成某个胚胎的注射，可在琼脂糖上方添加一滴无菌水，以防止其干燥。在注射过程中，微珠常会堵塞针头开口，此时需重新打断针尖，并通过调节显微注射装置的压力或时间设置来调整注射体积。若针头变钝并可能在注射过程中造成明显损伤，则应更换针头。
5. 在正置荧光复合显微镜下观察注射后的胚胎，筛选成功植入微珠的个体例如 使用20倍物镜在Zeiss AxioImager M1显微镜下观察。首先，在明场照明下判断KV结构是否完整（图1J），然后使用荧光观察珠子。选择珠子存在于KV腔内并发生移动的胚胎。若胚胎的KV结构受损或KV内无悬浮珠子，则予以弃用。操作中容易错过KV，将珠子注入邻近组织或下方的卵黄中。若注射失败，另取10个胚胎重新装片，并重复注射步骤。

5. KV流体流动的可视化与分析

1. 对于每个KV内含有珠子的选定胚胎，加入一滴无菌水以覆盖琼脂糖，然后使用63倍水浸物镜在直立式荧光复合显微镜下观察KV（图1I）。或者，也可加盖盖玻片，以便使用非水浸物镜和/或倒置显微镜进行观察。
2. 使用安装在显微镜上的高速相机（例如 Zeiss AxioCamHSm）录制一段10秒的视频。同时通过荧光通道（约70帧/秒）记录珠子的运动，并通过明场或微分干涉差（DIC）通道记录KV腔室的结构。
3. 为随时间可视化所有珠子的运动，将荧光珠子的视频导入ImageJ软件（可在 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 免费下载），并对视频中所有荧光信号生成最大强度投影图。在ImageJ中执行最大投影时，点击“图像→堆栈→Z投影”。在“Z投影”窗口中，选择投影类型为“最大强度”，并对所有切片进行投影。该图像可叠加在记录珠子时所获取的KV的DIC图像上（图3A-B）。
4. 可使用ImageJ软件追踪单个珠子的运动轨迹。一个名为“Manual Tracking”的插件可在 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html 下载。在ImageJ中打开荧光珠子的视频，并运行“Manual Tracking”功能。在“Manual Tracking”窗口中，勾选“显示参数”，并输入“时间间隔”和“x/y标定”参数。手动选择在视频焦平面内持续存在≥50帧的珠子，并对每个胚胎追踪≥5个珠子。软件将自动生成每个珠子的运动路径和速度（图3 C-D）。

结果

阶段特异性吗啉寡聚体（MO）注射为分析胚胎特定区域中基因功能提供了一种有效方法。图1展示了用于检测DFC/KV细胞中基因功能的注射策略流程图，以及如何引入荧光微珠以可视化KV中的液体流动。成功进行阶段特异性注射后，荧光MO在胚胎中的分布情况在图1D-F中以示意图形式展示，并在活体胚胎中显示于图2。一次不成功的MO注射示例（MO仍聚集在卵黄细胞中）见图2D。

根据荧光标记的吗啉代（MO）定位筛选出成功注射的胚胎，可在4-6体节期将其固定，以便将荧光微珠导入KV腔内（图1G-H），用于分析液体流动。通过视频显微镜记录KV中微珠的运动（图1I-J），可使用ImageJ软件对结果进行定性（图3A-B）或定量分析（图3C-E）。在具有正常流动的对照胚胎中，微珠沿逆时针路径运动，可通过随时间叠加荧光微珠位置生成最大投影图（

讨论

采用特定发育时期的注射方法将吗啉寡聚体（MO）靶向DFC/KV细胞谱系，是研究基因功能细胞自主性并避免因全胚胎基因敲低所导致多效性表型的有效策略。然而，此类注射在技术上具有挑战性。在256细胞期至1000细胞期之间注射MO可能产生三种结果：1）MO滞留在注射部位未扩散；2）MO扩散至卵黄并进入DFC/KV细胞；或3）MO扩散至卵黄并同时进入DFC/KV细胞及其他胚胎细胞。因此，在本实验中，筛选出MO仅特异性分布于DFC/KV细胞的胚胎是关键步骤。需要指出的是，MO可能进入全部DFC/KV细胞，但通常仅进入其中一部分细胞¹⁰。这种嵌合性靶向的机制尚不明确，可能与MO通过卵黄迁移的效率差异，或卵黄与DFC前体细胞之间连接桥关闭时间的个体差异有关。我们尚未发现可提高靶向效率的实验条件，因而主要依赖于筛选出大多数KV细胞已摄取MO的胚胎。通常情况下，获得MO分布于大多数DFC/KV细胞的胚胎成功率约为20–30%，但该比例在不同实验日之间可能存在较大波动。因此，我们建议尽可能多地注射胚胎（≥100枚），随后仔细筛选出荧光标记吗啉寡聚体分布符合预期的胚胎。

对照实验对于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
标准对照寡核苷酸-Lissamine标记	Gene Tools, LLC
定制Rock2b吗啉代寡核苷酸	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite多功能荧光0.5微米微球	Polysciences, Inc.	24054