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方法文章

毛细力光刻技术在心肌组织工程中的应用

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DOI：

10.3791/50039

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2014年6月10日

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1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Department of Pathology, University of Washington

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们展示了利用毛细力光刻技术，采用两种不同的高分子材料制备仿生心脏细胞培养基质的方法。in vitro 和 in vivo 应用的宏观心脏组织的结构与功能提供了一种可扩展、成本效益高的工程化技术。

摘要

心血管疾病仍然是全球死亡的首要原因1心脏组织工程具有巨大的潜力，有望实现突破性的医学发现，旨在开发用于心脏再生的功能性组织以及 体外 筛选试验。然而，构建高保真度心肌组织模型的能力一直难以实现。心脏的细胞外基质（ECM）是一种复杂的结构，包含从微米到纳米尺度的生化和生物力学信号2局部力学加载条件以及细胞-细胞外基质相互作用近年来被公认为心脏组织工程中的关键要素3-5.

心脏细胞外基质（ECM）的很大一部分由具有纳米级直径的取向胶原纤维构成，这些纤维显著影响组织结构和电机械耦合2。遗憾的是，目前很少有方法能够将细胞外基质纤维的排列结构模拟到纳米尺度。然而，近年来纳米制造技术的进步使得可扩展支架的设计与制备成为可能，这些支架能够模拟心脏中细胞外基质的体内结构特征和基质刚度信号6-9。

本文介绍了两种可重复、成本低且可放大的纳米图案化工艺的开发，用于利用生物相容性聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）8 和一种聚氨酯（PU）基聚合物实现心肌细胞的功能性定向排列。这些各向异性纳米制造的基底（ANFS）可模拟结构良好且有序排列组织的细胞外基质（ECM），可用于研究纳米形貌对细胞形态和功能的影响10-14。

利用纳米图案化（NP）硅模板制备聚氨酯丙烯酸酯（PUA）模具。随后，该PUA模具分别通过紫外光辅助或溶剂介导的毛细力光刻技术（CFL）对聚氨酯（PU）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）水凝胶进行图案化15,16。简言之，将PU或PLGA预聚物滴加至玻璃盖玻片上，然后将PUA模具置于其上。对于紫外光辅助CFL，将PU暴露于紫外光辐射（λ = 250–400 nm）下以实现固化；对于溶剂介导CFL，则在加热（120 °C）和加压（100 kPa）条件下对PLGA进行压印。固化后，将PUA模具剥离，从而在基底上形成各向异性纳米纤维结构（ANFS），用于细胞培养。该ANFS可用于培养原代细胞（如新生大鼠心室心肌细胞）以及人多能干细胞来源的心肌细胞2。

引言

心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因，给本已紧张的全球卫生系统带来了沉重的社会经济负担1,17心脏组织工程有两个明确的目标：（1）在缺血性疾病或心肌病后再生受损的心肌组织，或（2）构建心脏的高保真模型用于 体外 药物筛选或疾病建模

心脏是一个复杂的器官，必须持续工作以向全身供应血液。心肌细胞和支持性组织形成致密排列的层状结构，以螺旋模式分布于整个心壁。18,19心脏也存在电-机械耦合20 以高度协调的方式高效地将血液射入全身21然而，在大自然复杂的构造能够被可靠地重现之前，仍有若干主要障碍需要克服 体外首先，尽管稳健的心肌细胞分化方法仍在不断开发中22，人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）仍表现出相对不成熟的表型，其电机械特性和形态最接近胎儿水平23第二，当在传统培养条件下培养时，无论是干细胞来源的还是原代心肌细胞，均无法自组装成类似天然组织的结构。相反，细胞呈现随机排列，且不表现出成年心肌组织特有的条带状杆状形态。24.

细胞所相互作用的细胞外基质（ECM）环境在多种细胞过程中发挥着重要作用11,13,25细胞外基质（ECM）包含复杂的、明确的分子和拓扑信号，显著影响细胞的结构与功能。6,26在心脏中，细胞的排列紧密地沿 underlying 纳米级 ECM 纤维分布2然而，这些纳米级形貌线索对细胞和组织功能的影响还远未被完全理解。初步的纳米尺度细胞-生物材料相互作用研究表明，亚微米级形貌线索在细胞信号传导中可能具有重要影响。27，黏附28-30生长31，以及分化32,33然而，由于难以开发出可重复且可放大的纳米加工基底，此类研究无法重现复杂结构的多尺度细胞效应 体内 细胞外基质环境。本方案描述了一种简单且经济高效的纳米制造技术，用于制备模拟天然心肌细胞外基质纤维取向的细胞培养支架，从而支持对心肌细胞与生物材料相互作用的多种新型研究。深入了解心肌细胞与纳米级细胞外基质环境之间的相互作用，有助于调控细胞行为，使其更接近天然组织的功能。此外，相比于三维结构，细胞单层是一种简化的实验体系，但仍能表现出复杂的多细胞行为，适用于深入研究和功能筛选。2,34-36最后，此类支架在植入心脏用于再生治疗时，可用于改善细胞移植物的功能。37.

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方案

除非另有说明，所有操作均在室温（约 23 °C）下进行。

1. 硅模板的制备

  1. 用100%乙醇或二甲苯清洗硅片，并在O2/N2气体下干燥。
  2. 将硅片置于旋涂仪中，以2,000-4,000 rpm的转速旋转，形成厚度为0.3-0.5 µm的薄膜。
  3. 使用光刻系统对光刻胶薄膜进行正确尺寸的图形化。
  4. 将带有图形化光刻胶的硅片完全浸入适量的光刻胶显影液中。
  5. 用去离子水冲洗显影后的带光刻胶硅片。
  6. 使用刻蚀系统通过深反应离子刻蚀暴露的硅，以形成具有近垂直侧壁的亚微米级条状阵列。
  7. 将硅片放入等离子体灰化系统中，以去除残留的光刻胶。
  8. 使用金刚石刀具将硅片切割成适当尺寸的硅模板，用于后续的复制模塑。

2. 从硅模板制备PUA模具

注意：用于纳米制造的硅模板添加体积将根据待复制的纳米图案模板面积以及聚氨酯丙烯酸酯（PUA）溶液的黏度而变化。

  1. 使用100%乙醇或二甲苯清洁硅模板表面，并在O2/N2气体下吹干。
  2. 将硅模板的图案面朝上放置于培养皿中。
  3. 对于具有2 cm × 2 cm表面图案的硅模板，用移液器将40 µl的PUA滴加至图案表面。
  4. 在已分配的PUA上覆盖一张4 cm × 4 cm的透明聚酯（PET）薄膜。
  5. 用手按压PET薄膜，并使用滚轮或平边物体（如卡片）在薄膜下将PUA均匀涂布至整个图案表面，确保整个图案被PUA预聚物覆盖。
  6. 将硅模板、预聚物和PET薄膜置于20瓦（115 V）紫外灯（λ = 365 nm）下方约10 cm处，照射50秒。为达到有效固化，紫外光波长可在310–400 nm范围内，光源在基底表面的强度为10–15 mW/cm2。
  7. 固化后，用镊子缓慢揭下PET薄膜。PUA应附着在PET薄膜上，形成硅模板纳米图案的负模。
  8. 使用前，将PUA/PET纳米图案在紫外光下继续固化至少12小时。过度曝光不会产生不良影响。
  9. 清洁硅模板时，将另一片PET薄膜覆盖在模板上，不添加PUA，暴露于紫外光（λ = 365 nm）下50秒后揭下PET薄膜。此步骤可去除未反应的单体。
  10. 用100%乙醇或二甲苯冲洗硅模板，并在O2/N2气体下吹干。

3a. 聚氨酯聚合物的纳米图案化

  1. 将直径为 25 mm 的圆形玻璃片放入臭氧处理室中处理 10 分钟，以进行准备。
  2. 将经臭氧处理的玻璃片放置在小型 PDMS 块上，以便于操作。
  3. 用画笔在玻璃片表面涂覆一层薄薄的表面粘附促进剂，并在空气中干燥 30 分钟。
  4. 将玻璃片放置在一张打印纸之上。
  5. 在玻璃片中心滴加 10 μl 聚氨酯（PU）预聚物（NOA 76）。确保加入后无气泡产生。
  6. 将 PUA 模具图案面朝下放置在玻璃片上，然后沿模具表面滚动橡胶压辊，使 PU 均匀铺展。打印纸将吸收多余的聚合物溢出物。
  7. 开启瓦特级紫外灯。PU 的聚合时间取决于紫外光源的功率。
  8. 从紫外光源处取出样品，并小心地将 PUA 模具从涂有 PU 的玻璃片上剥离。当 PUA 模具能够干净地与样品分离，且 PU 玻璃片表面呈现虹彩外观时，表明 PU 已完全聚合。
  9. 将制备完成的样品置于干燥器中保存，可保存长达一个月。

3b. 纳米图案化聚乳酸-羟基乙酸共聚物水凝胶

  1. 按10:1的比例将硅弹性体基础剂与硅弹性体固化剂充分混合，制备平整的PDMS模具。
  2. 将混合好的PDMS预聚液倒入培养皿中，使PDMS预聚液沿培养皿边缘上升至5 mm高度（即 使PDMS厚度为5 mm。
  3. 将培养皿和PDMS前体放入真空干燥器中脱气1小时。
  4. 将培养皿和PDMS前体放入65 °C烘箱中至少2小时以使其固化。
  5. PDMS 固化后，使用剃刀将平坦的 PDMS 切割成 3 cm × 3 cm 的方形片。这些方形片将作为后续图案化过程中使用的平坦 PDMS 模具。
  6. 将直径为25 mm的圆形玻璃载玻片置于异丙醇中，在水浴超声仪中清洗30分钟。
  7. 在O下干燥清洁的玻璃载片2/无可用源文本/2 气体
  8. 在载玻片上滴加100 μl PLGA溶液（15% w/v PLGA溶于氯仿）。
  9. 将一块平的PDMS模具置于已点样的PLGA上方，以吸收溶剂并获得平整的PLGA表面。在PDMS上方放置一个200 g的砝码，施加轻微压力（约10 kPa），持续5分钟。
  10. 缓慢剥离平面PDMS模具，将盖玻片置于预热板（120 °C）上加热5分钟，以去除残留溶剂并增强PLGA与盖玻片之间的黏附性。
  11. 将NP PUA模具置于平整的PLGA表面，在加热板上于120 °C加热15分钟，同时在PUA模具上方放置1 kg砝码以施加恒定压力（约100 kPa）。
  12. 从PLGA盖玻片上移除重物，使基质冷却至室温。在基质冷却前，不得移除PUA模具。
  13. 待基底充分冷却后，小心剥离NP PUA模具，露出NP PLGA基底。NP PLGA基底应呈现虹彩外观。
  14. 将制备好的样品放入干燥器中，可保存长达一个月。

4. 细胞接种与培养

注意：本方案描述了新生大鼠心室心肌细胞（NRVMs）和H7人胚胎干细胞来源的心肌细胞（hESC-CMs）的培养方法，但也可使用其他细胞来源。

  1. 将 ANFS 盖玻片（PU 或 PLGA）固定在 35 mm 组织培养用聚苯乙烯培养皿中。用移液器将 20 µl Norland 光学胶（NOA83H）滴加至培养皿底部，然后轻柔地将 ANFS 盖玻片置于 NOA 上方。让胶水自然铺展并完全覆盖盖玻片底部。将培养皿暴露于紫外光下 10 分钟，使 NOA 固化。
  2. 用 2 ml 70% 水性乙醇溶液冲洗 ANFS，每次 5 分钟，重复两次以进行灭菌。通过抽吸去除乙醇。在生物安全柜内的紫外灭菌灯（λ = 200–290 nm）下，让 ANFS 完全自然干燥约 1 小时。
  3. 通过在 ANFS 上包被纤连蛋白过夜，可增强细胞黏附。将纤连蛋白用去离子水稀释至 5 µg/ml。向培养皿中加入 2 ml 纤连蛋白溶液。置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育过夜（至少 6 小时）。
  4. 根据先前的实验方案22获取 NRVMs、hESC-CMs 或其他感兴趣的心肌细胞。
  5. 将细胞样品以 1,000 rpm 离心 3 分钟，使细胞沉淀。
  6. 小心抽吸去除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  7. 用适当的培养基重悬细胞，调整细胞浓度至 4.6 × 106 个细胞/ml。
  8. 小心地将 200 µl 细胞悬液滴加到已灭菌的 ANFS 上。确保细胞悬液保留在盖玻片范围内。
  9. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 4 小时，使细胞充分贴附于 ANFS 上。
  10. 向培养皿中加入 2 ml 预热的培养基，并将细胞放回相同条件的培养箱中继续培养。
  11. 24 小时后，吸除培养基，并用 2 ml DPBS 洗涤两次，以去除未贴附的多余细胞。
  12. 向培养皿中加入 2 ml 预热的培养基，并将细胞放回相同条件的培养箱中继续培养。持续培养至细胞融合。每隔一天更换一次培养基。

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结果

图1是两种制备方法生产过程的示意图。由于纳米级形貌引起的光衍射，纳米图案化应使ANFS表面呈现虹彩。图2展示了在图案化良好的25 mm NP-PU盖玻片上观察到的虹彩表面（图2A），其脊和沟槽宽度为800 nm（图2B）。ANFS的虹彩外观会因脊和沟槽宽度的不同而略有差异。

将细胞接种到ANFS上后，细胞应开始沿基底脊的方向平行排列。接种后24小时内即可观察到明显的排列现象，并在整个培养期间持续保持。图3展示了NRVMs培养7天后以及hESC-CMs培养48小时后的代表性明场图像。在NP表面上的NRVMs和hESC-CMs显示出明显的结构各向异性和定向排列（图3B 和 图3D），而在无图案表面的心肌细胞则呈随机取向（图3A 和 图3C）。免疫组织化学分析突出了纳米形貌对细胞骨架排列...

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讨论

功能成熟的心脏组织对于两者均缺乏 体内 和 体外 心脏组织工程的应用。本文所述的CFL纳米制造方法是一种可靠的技术，可通过该系统的可扩展性实现细胞排列并影响组织的宏观功能。大面积区域可轻松实现图案化并用于细胞培养。在心脏组织工程中，宏观尺度的细胞排列对于构建仿生且具有功能的组织至关重要，因为它会影响心肌的机械和电学特性。38.

本文所述方法可广泛应用于心肌组织工程领域的多种用途。已有研究证实，纳米级信号有助于构建心脏干细胞微环境并促进再生14。因此，通过使用PLGA等可生物降解的聚合物，可制备出具有纳米图案的“补片”，以促进心脏损伤后的修复。此外，通过使用与天然心脏组织弹性模量相似的水凝胶，可在简化且可重复的体系中研究心肌细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。

其他多种方法，例如微接触印刷、静电纺丝和微形貌技术，此前已被用于在微米尺度上调控工程化心肌组织的结构39-41尽管这些技术在实现细胞排列方面已证明是成功的，但其结构...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

D. H. Kim 感谢华盛顿大学生物工程系提供的新教职启动资金。D. H. Kim 还获得了 Perkins Coie 发现奖、Wallace H. Coulter 基金会转化研究合作奖、华盛顿州生命科学发现基金以及美国心脏协会科学家发展资助（13SDG14560076）的支持。J. Macadangdang 和 A. Jiao 感谢美国国立卫生研究院（NIH）生物工程心血管培训项目资助金的支持。 本研究还得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01HL111197（授予 M. Regnier）的额外支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤连蛋白BD Biosciences354008
NOA 76Norland Products, Inc.7606B
表面粘附促进剂（玻璃底物处理剂）Minuta Tech
PUAMinuta TechMINS-311RM
软橡胶滚轮Speedball
硅晶圆NOVA Electronic MaterialsFA01-9900
光刻胶ShipleySPRT510
光刻胶显影液ShipleyMF320
电子束光刻系统JEOLJBX-9300FS
刻蚀系统Surface Technology SystemsNP10 8UJ
等离子灰化系统BMR Technology Co.DSF-200
臭氧固化系统Minuta TechMT-UV-O- 08
融合固化系统Minuta TechMT-UV-A 11
NOA 83HNorland Products, Inc.8301
旋涂仪Laurel TechnologyWS-400-6NPP
Skyrol PET 薄膜SKC Co., Ltd.23038-59-9
25 mm 玻璃载片Corning2948
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒Dow Corning6/5/2553
聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)Sigma-AldrichP2191-1G
氯仿Sigma-Aldrich372978-1L
500 g 砝码Global InsustrialT9FB503120
异丙醇EMD MilliporePX1835-2
加热板CorningPC-420D
超声波清洗机BransonB2510MTH

参考文献

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重印与许可

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纳米图案化基底PLGA 聚合物聚氨酯模具紫外辅助毛细管力光刻溶剂介导毛细管力光刻心肌细胞取向排列细胞外基质模拟明场显微镜
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