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方法文章

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

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DOI：

10.3791/50049

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2012年12月19日

 ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham, 2Department of Radiation Oncology, The Ohio State University Medical School, 3Department of Cell Biology, and Pharmacology and Toxicology, Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, University of Alabama-Birmingham

本文内容

摘要

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。

摘要

多种药物通过造成DNA损伤来靶向DNA修复通路并诱导细胞死亡。因此，直接检测DNA损伤的方法已被广泛评估。传统方法耗时长、成本高、资源消耗大，且需要细胞处于复制状态。相比之下，彗星试验（comet assay），即单细胞凝胶电泳试验，是一种更快捷、无创、经济、直接且灵敏的DNA损伤与修复检测方法。利用这一强大技术，可在单细胞水平上直观检测各种形式的DNA损伤及DNA修复过程。

彗星试验的基本原理是完整DNA具有高度有序的结构，而DNA损伤会破坏这种有序性。受损的DNA会渗入琼脂糖基质中，在电场作用下，带负电荷的DNA向带正电的阳极迁移。大分子量的未受损DNA片段无法从细胞核中迁移很远，而DNA损伤产生的较小DNA片段则能迁移得更远。彗星试验图像分析软件通过测量并比较细胞核内与迁移出细胞核的DNA的总体荧光强度来评估损伤程度。迁移DNA产生的荧光信号强度与DNA损伤程度成正比，DNA尾部越长、越亮，表明DNA损伤越严重。实验中测量的参数包括尾矩（反映尾部DNA的数量及其分布情况）、尾长以及尾部DNA所占百分比。由于DNA损伤的修复意味着损伤的消除，因此该方法也可用于检测DNA修复能力。该方法的检测灵敏度约为每二倍体哺乳动物细胞50个链断裂1,2。使用任何DNA损伤剂（如依托泊苷）处理的细胞均可作为阳性对照。因此，彗星试验是一种快速且有效的DNA损伤检测方法。

方案

1. 细胞培养

  1. 培养神经元细胞，并根据需要进行处理。
  2. 将细胞收集至15 ml离心管中：吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，无钙、无镁）洗涤，加入胰蛋白酶消化，收集至15 ml离心管中，并用含适当血清的培养基中和胰蛋白酶。
  3. 以1,000 × g离心5分钟。
  4. 吸除上清液。
  5. 用PBS重悬细胞。
  6. 以1,000 × g离心5分钟。
  7. 吸除上清液，用新鲜PBS重悬细胞。
  8. 使用血细胞计数板或您偏好的细胞计数仪对细胞进行计数。
  9. 细胞样品应在开始检测前立即制备。
  10. 所有样品均应在避光或黄光条件下操作，以防止紫外线引起的DNA损伤。

2. 彗星试验

1. 载玻片制备

  1. 将1%琼脂糖（1 g / 100 ml，溶于1X Tris-硼酸-EDTA缓冲液，TBE）放入微波炉中加热3分钟，直至所有颗粒完全溶解。
  2. 将载玻片浸入熔化的琼脂糖中，用无尘纸（kimwipe）擦去一侧多余液体。静置晾干，形成透明薄膜。此步骤可预先完成，制备好的载玻片可储存备用。

2. 中性彗星实验

  1. 使用前将裂解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA pH 10、10 mM Tris碱、1% 月桂酰肌氨酸钠、1% Triton X-100，pH 10）在4 °C下预冷至少1小时。
  2. 2.2.2. 在微波炉中加热1%低熔点琼脂糖（1 g / 100 ml 1X Tris碱、硼酸、EDTA缓冲液）3分钟，直至颗粒完全溶解。琼脂糖需在水浴中冷却至37 °C，以避免人为诱导彗尾形成。理想情况下，琼脂糖应在使用前冷却约30分钟。
  3. 2.2.3. 将细胞悬液稀释至每毫升含100,000个细胞。按1:10（v/v）的比例将细胞悬液与37 °C的低熔点琼脂糖混合，短暂涡旋混匀后立即吸取50 μl滴加至彗星电泳载玻片上。用移液器吸头侧面将细胞悬液在样品区域均匀铺开。每个处理组至少设三个重复。
  4. 将载玻片平放于冰箱中30分钟，直至玻片边缘出现环形凝固圈。
  5. 预先将裂解液冷却，将载玻片完全浸入该溶液中，在4 °C（或冰箱中）避光孵育30分钟。
  6. 倒出或吸除裂解液，加入1X中性电泳缓冲液（Tris碱、硼酸、EDTA，1X TBE）。将载玻片在冰箱中继续孵育30分钟。
  7. 在电泳槽中加入预冷的1X中性电泳缓冲液（TBE），将载玻片放入电泳槽托架中。调整载玻片位置，使其与电极距离相等。
  8. 加入1X中性电泳缓冲液至载玻片上方约0.2英寸处。缓冲液过多将干扰电泳过程。
  9. 将电源电压设定为1 V/cm（电极至电极距离），在4 °C（或低温室）避光条件下运行30分钟。

3. 碱性彗星实验

  1. 使用前，将裂解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA pH 10、10 mM Tris碱、1% 月桂酰肌氨酸钠和1% Triton X-100，pH 10）在4 °C预冷至少1小时。
  2. 将1%低熔点琼脂糖（1 g / 100 ml，溶于1X Tris碱、硼酸、EDTA缓冲液）在微波炉中加热3分钟，直至颗粒完全溶解。随后在37 °C水浴中冷却至少30分钟。
  3. 将细胞浓度调整为1 × 10⁵ / ml，与37 °C熔融的低熔点琼脂糖按1:10（v/v）比例混合，短暂涡旋混匀后，立即吸取50 μl滴加至彗星电泳载玻片上。用移液器吸头侧面将细胞悬液均匀铺展于样品区域。每个处理组至少设置三个重复。
  4. 将载玻片平放于冰箱中静置30分钟，直至玻片边缘出现环形凝固圈。
  5. 将载玻片浸入预冷的裂解液中，于4 °C避光孵育1小时至过夜。
  6. 从裂解液中取出载玻片，沥干后用冷的中和缓冲液冲洗一次，每次5分钟，以去除碱性解旋步骤前残留的去垢剂和盐分。
  7. 将载玻片放入电泳槽中，加入新配制并预冷的电泳缓冲液（300 mM NaOH、1 mM EDTA，pH > 13），液面高度不超过载玻片上方0.5 cm。调整载玻片位置，使其与两侧电极距离相等。
  8. 在避光条件下，让载玻片于碱性缓冲液中静置30分钟，以使DNA充分解旋并暴露碱性敏感性损伤位点。
  9. 将电源电压设定为1 V/cm（以电极间距离为准），在4 °C（或冷藏室环境）下电泳运行30分钟。

4. 固定与染色细胞

  1. 排去过量电泳缓冲液
  2. 将载玻片浸入预冷的蒸馏水中，室温下处理 5 分钟。
  3. 将载玻片浸入预冷的 70% 乙醇中，室温下处理 5 分钟。
  4. 干燥样品过夜。切勿将载玻片暴露于强光下。此阶段样品可在室温下保存数月，之后再进行评分。
  5. 将载玻片浸入 Sybr green（1X 稀释于 PBS 中）溶液中，于冰箱中染色 20 分钟。
  6. 取出载玻片，置于暗处彻底干燥。完全干燥后，琼脂糖将变为透明。

4. 图像采集与分析

  1. 使用荧光显微镜（Zeiss AxioVision）在绿色滤光片下采集图像，并使用彗星分析软件（Perceptive Instruments）进行分析。
  2. 点击“彗星头部”（即细胞核），软件将自动计算相关参数，包括平均尾矩和细胞核中的DNA含量。
  3. 每种处理组至少分析200个细胞。
  4. 将数据导出至 Microsoft Excel。
  5. 计算每组处理的平均尾矩，并根据需要绘制数据图表。

5. 代表性结果

神经元细胞彗星实验分析示例如下所示 图2 和 图3在此情况下，神经元细胞经照射后会诱导产生DNA损伤。当细胞处于电场中时，由于DNA片段大小不同，其迁移速率也不同，随后使用Comet Assay软件进行分析。DNA损伤越严重，DNA从细胞核中迁移出的距离就越远，导致细胞核内的荧光强度降低。该变化被软件检测到，从而产生更高的尾矩值。 表1 展示了彗星实验分析的一个代表性表格 图4 显示了通过彗星实验测量辐射后神经元细胞中DNA损伤的代表性图表。

彗星试验流程图；琼脂糖凝胶电泳中的细胞；通过荧光显微镜进行分析。
图1. 彗星试验流程图。 点击此处查看大图。

海马神经元的彗星实验结果，DNA损伤分析，显微镜图像。
图2. 神经元细胞的代表性图像：(A) 无彗星尾；(B) 有彗星尾。

荧光显微镜流程图、发射分析、样品观察步骤 A-C。
图3. 使用Comet Assay软件进行彗星试验分析。（A）使用Carl Zeiss荧光显微镜获取图像并用Comet Assay软件分析的代表性截图。（B）点击细胞核或“彗星头部”（绿色圆圈标示）将生成荧光图谱和曲线图（黄色圆圈标示）以及（C）数据表（红色圆圈标示）。 点击此处查看大图。

柱状图；辐射对DNA损伤的影响；平均尾矩比较；有辐射与无辐射结果。
图4. 通过中性彗星实验分析经辐射与未经辐射的神经元细胞中的DNA损伤，绘制出的代表性图表。如预期所示，3 Gy辐射（X射线）可诱导DNA损伤，表现为经辐射神经元细胞中较高的平均尾矩。图中显示的是平均尾矩（±标准误差），**P<0.01。

彗星实验结果数据表：头部长度、尾部强度、总面积和时间细节。
表 1. 经彗星实验分析辐照与未辐照神经元细胞所获得的代表性数据表。 点击此处查看大图。

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讨论

彗星试验具有分析单个细胞的独特能力。这对于识别对细胞毒性试剂表现出不同反应的细胞亚群具有优势。但需考虑一些实际限制因素。可单独评估的细胞数量可能因个体而异。如果群体内DNA损伤存在变异，则需要增加样本量。该试验的关键在于获得有活力的单细胞悬液，因为坏死或凋亡细胞的大量存在会增加实验误差。裂解和电泳步骤可去除凋亡细胞、小片段DNA（小于50 kb）以及线粒体DNA，因此这些成分无法被彗星试验检测到1,3-11。

如上所述，彗星试验是检测DNA单链和双链断裂的有效方法，包括碱不稳定位点以及DNA-DNA或DNA-蛋白质交联。本文概述了两种不同的实验方案：碱性彗星试验可检测单链断裂和双链断裂，而中性彗星试验仅能检测双链断裂。酶修饰的彗星试验可用于检测氧化性DNA加合物。例如，使用Endo III（内切核酸酶）和hOGG1（糖基化酶）分别识别氧化的嘧啶类物质，包括胸腺嘧啶乙二醇和尿嘧啶乙二醇12,13，以及8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）14,15。同样也可使用甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FPG）。在此修饰后...

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致谢

本工作由阿拉巴马大学伯明翰分校综合癌症中心放射肿瘤学系的IMPACT奖、抗击儿童癌症基金会以及加布里埃尔天使基金会（授予ESY.）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 离心管Santa Cruz Biotechnology, IncSc-200271
10X TBE（Tris 碱、硼酸、EDTA）Fisher ScientificBP13331
15 ml 离心管Fisher Scientific0553851
琼脂糖SigmaA5093
铝箔Fisher Scientific01213101
烧杯Fisher ScientificFB102300
离心机Thermo Scientific75004261PR
彗星分析软件Comet Assay IV Image Analysis System
量筒Fisher Scientific08555F
EDTAGIBCO15575
电泳槽Thermo Scientific09528101
乙醇Fisher ScientificA407P4
荧光显微镜Zeiss Axio Vision任何配备绿色滤光片的荧光显微镜均可使用
血细胞计数板Fisher Scientific0267152
低熔点琼脂糖PromegaV2111
微波炉Sears
无钙无镁磷酸盐缓冲液（PBS）HyCloneSH3025601
电源BioRad1645050
冰箱Sears
直尺Staples
载玻片Fisher Scientific12550143
氯化钠SigmaS7653
氢氧化钠SigmaS5881
月桂酰肌氨酸钠Fisher ScientificS529
Sybr GreenInvitrogenS7585
托盘Fisher Scientific15242B
Tris 碱SigmaT6066
Triton-X 100SigmaT8787
胰蛋白酶HyCloneSH3023601
涡旋振荡器Fisher Scientific02216108
水浴锅Fisher Scientific154622Q

参考文献

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