使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

摘要

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。

摘要

多种药物通过造成DNA损伤来靶向DNA修复通路并诱导细胞死亡。因此，直接检测DNA损伤的方法已被广泛评估。传统方法耗时长、成本高、资源消耗大，且需要细胞处于复制状态。相比之下，彗星试验（comet assay），即单细胞凝胶电泳试验，是一种更快捷、无创、经济、直接且灵敏的DNA损伤与修复检测方法。利用这一强大技术，可在单细胞水平上直观检测各种形式的DNA损伤及DNA修复过程。

彗星试验的基本原理是完整DNA具有高度有序的结构，而DNA损伤会破坏这种有序性。受损的DNA会渗入琼脂糖基质中，在电场作用下，带负电荷的DNA向带正电的阳极迁移。大分子量的未受损DNA片段无法从细胞核中迁移很远，而DNA损伤产生的较小DNA片段则能迁移得更远。彗星试验图像分析软件通过测量并比较细胞核内与迁移出细胞核的DNA的总体荧光强度来评估损伤程度。迁移DNA产生的荧光信号强度与DNA损伤程度成正比，DNA尾部越长、越亮，表明DNA损伤越严重。实验中测量的参数包括尾矩（反映尾部DNA的数量及其分布情况）、尾长以及尾部DNA所占百分比。由于DNA损伤的修复意味着损伤的消除，因此该方法也可用于检测DNA修复能力。该方法的检测灵敏度约为每二倍体哺乳动物细胞50个链断裂^1,2。使用任何DNA损伤剂（如依托泊苷）处理的细胞均可作为阳性对照。因此，彗星试验是一种快速且有效的DNA损伤检测方法。

方案

1. 细胞培养

1. 培养神经元细胞，并根据需要进行处理。
2. 将细胞收集至15 ml离心管中：吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，无钙、无镁）洗涤，加入胰蛋白酶消化，收集至15 ml离心管中，并用含适当血清的培养基中和胰蛋白酶。
3. 以1,000 × g离心5分钟。
4. 吸除上清液。
5. 用PBS重悬细胞。
6. 以1,000 × g离心5分钟。
7. 吸除上清液，用新鲜PBS重悬细胞。
8. 使用血细胞计数板或您偏好的细胞计数仪对细胞进行计数。
9. 细胞样品应在开始检测前立即制备。
10. 所有样品均应在避光或黄光条件下操作，以防止紫外线引起的DNA损伤。

2. 彗星试验

1. 载玻片制备

1. 将1%琼脂糖（1 g / 100 ml，溶于1X Tris-硼酸-EDTA缓冲液，TBE）放入微波炉中加热3分钟，直至所有颗粒完全溶解。
2. 将载玻片浸入熔化的琼脂糖中，用无尘纸（kimwipe）擦去一侧多余液体。静置晾干，形成透明薄膜。此步骤可预先完成，制备好的载玻片可储存备用。

2. 中性彗星实验

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讨论

彗星试验具有分析单个细胞的独特能力。这对于识别对细胞毒性试剂表现出不同反应的细胞亚群具有优势。但需考虑一些实际限制因素。可单独评估的细胞数量可能因个体而异。如果群体内DNA损伤存在变异，则需要增加样本量。该试验的关键在于获得有活力的单细胞悬液，因为坏死或凋亡细胞的大量存在会增加实验误差。裂解和电泳步骤可去除凋亡细胞、小片段DNA（小于50 kb）以及线粒体DNA，因此这些成分无法被彗星试验检测到^1,3-11。

如上所述，彗星试验是检测DNA单链和双链断裂的有效方法，包括碱不稳定位点以及DNA-DNA或DNA-蛋白质交联。本文概述了两种不同的实验方案：碱性彗星试验可检测单链断裂和双链断裂，而中性彗星试验仅能检测双链断裂。酶修饰的彗星试验可用于检测氧化性DNA加合物。例如，使用Endo III（内切核酸酶）和hOGG1（糖基化酶）分别识别氧化的嘧啶类物质，包括胸腺嘧啶乙二醇和尿嘧啶乙二醇^12,13，以及8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）^14,15。同样也可使用甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FPG）。在此修饰后.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 离心管	Santa Cruz Biotechnology, Inc	Sc-200271
10X TBE（Tris 碱、硼酸、EDTA）	Fisher Scientific	BP13331
15 ml 离心管	Fisher Scientific	0553851
琼脂糖	Sigma	A5093
铝箔	Fisher Scientific	01213101
烧杯	Fisher Scientific	FB102300
离心机	Thermo Scientific	75004261PR
彗星分析软件	Comet Assay IV Image Analysis System
量筒	Fisher Scientific	08555F
EDTA	GIBCO	15575
电泳槽	Thermo Scientific	09528101
乙醇	Fisher Scientific	A407P4
荧光显微镜	Zeiss Axio Vision		任何配备绿色滤光片的荧光显微镜均可使用
血细胞计数板	Fisher Scientific	0267152
低熔点琼脂糖	Promega	V2111
微波炉	Sears
无钙无镁磷酸盐缓冲液（PBS）	HyClone	SH3025601
电源	BioRad	1645050
冰箱	Sears
直尺	Staples
载玻片	Fisher Scientific	12550143
氯化钠	Sigma	S7653
氢氧化钠	Sigma	S5881
月桂酰肌氨酸钠	Fisher Scientific	S529
Sybr Green	Invitrogen	S7585
托盘	Fisher Scientific	15242B
Tris 碱	Sigma	T6066
Triton-X 100	Sigma	T8787
胰蛋白酶	HyClone	SH3023601
涡旋振荡器	Fisher Scientific	02216108
水浴锅	Fisher Scientific	154622Q