减薄颅骨皮层窗技术 体内 光学相干断层成像

摘要

我们介绍一种在小鼠模型中制备薄颅骨皮层窗（TSCW）的方法 体内 大脑皮层的OCT成像

摘要

光学相干断层扫描（OCT）是一种具有高时空分辨率的生物医学成像技术。由于其微创特性，OCT 已广泛应用于眼科、皮肤科和胃肠病学领域。^1-3. 采用减薄颅骨皮层窗（TSCW），我们利用谱域光学相干断层成像（SD-OCT）技术作为成像工具对皮层进行成像 体内通常，开颅手术已用于神经成像，因其具有更高的灵活性；然而，经颅窗（TSCW）方法侵入性更小，是神经病理学研究中进行长期成像的有效手段。本文介绍了一种在小鼠模型中建立经颅窗的方法 体内 大脑皮层的OCT成像

引言

自20世纪90年代初引入以来，光学相干断层扫描（OCT）已广泛用于生物组织结构与功能的成像²OCT 通过测量后向散射光的回波时间延迟来生成横截面图像⁴ 通过采用低相干光源与光纤迈克耳孙干涉仪相结合的方式^2,4SD-OCT，也称为傅里叶域OCT（FD-OCT），于1995年首次被提出⁵ 与传统的时域光学相干断层扫描（TD-OCT）相比，提供更优越的成像方式。在SD-OCT中，参考臂保持静止，从而实现高速和超高分辨率的图像采集^6-9.

目前，TSCW模型主要被用于 体内 双光子显微镜在脑成像中的应用，替代传统的开颅手术。这些经颅窗口（TSCW）可与定制颅骨板或玻璃盖玻片同时使用。^10-13 以提供额外的成像稳定性。在我们的研究中，观察到当使用TSCW时，此类附件对于OCT成像并非必需。因此，无需颅骨板或玻璃盖玻片，可避免其对光束的干扰以及对OCT图像的改变，从而允许更大范围的成像窗口尺寸。

一种去薄颅骨制备方法在利用双光子显微镜进行脑部成像的研究中已显示出优势^10-13在我们的实验中，我们利用谱域光学相干断层成像系统（SD-OCT）对皮层进行成像 体内 通过TSCW。我们定制的SD-OCT成像系统包含一个宽带低相干光源，该光源由两个中心波长为1295 nm、带宽为97 nm的超发光二极管（SLD）组成，可实现8 μm的轴向分辨率和20 μm的横向分辨率¹⁴利用我们的光学成像设备，我们预计通过TSCW进行成像在识别和可视化光学致密脑组织中的结构与功能方面具有巨大潜力。

方案

1. 手术准备

1. 实验中使用6至8周龄的雌性CD 1小鼠。
2. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（80 mg/kg氯胺酮/10 mg/kg赛拉嗪）对小鼠进行麻醉。将小鼠置于恒温垫上，以维持约37 °C的适宜体温。通过检测动物的反射（例如，用钝头镊子轻夹脚趾）持续监测麻醉深度，并在必要时追加麻醉剂。
3. 使用人工泪液软膏润滑双眼。用剃刀去除头皮上的毛发，并用70%酒精棉片清除残留毛发。在头皮上涂抹一层薄薄的Nair脱毛膏，静置2分钟使其发挥作用。用生理盐水浸湿的棉签和酒精棉片轻轻擦去Nair及残留毛发。此时头皮应完全无毛。
4. 使用聚维酮碘棉签对头皮进行消毒，再用70%乙醇棉片清洁。
5. 小心地用手术巾包裹动物，以维持约37 °C的适宜体温，并将动物固定于立体定位仪上以固定颅骨。轻敲颅骨以确认其稳定性。所用材料清单见表1。

2. 薄化颅骨皮层窗制备

1. 从两眼之间的中点开始切口，向后沿中线延伸至两耳之间的中点。用镊子分开皮肤。
2. 在解剖显微镜下定位需变薄的区域，用镊子轻轻去除筋膜。在制作变薄的皮层窗之前，用无菌棉签将颅骨表面擦干。在本实验中，我们在前囟后方及侧方约1 mm处制作一个4 × 4 mm的变薄颅窗。
3. 使用直径为0.75 mm的圆形碳化钨钻头，在外科手钻上以轻柔的扫动方式开始磨薄颅骨，切勿对颅骨施加直接压力。每钻20-30秒应暂停一次，用无菌生理盐水和棉签清除骨屑，并防止颅骨过热。生理盐水也有助于热量在颅骨内均匀散失。
4. 当外层致密骨完全去除后，中间的松质骨层应已可见。由于松质骨层中的血管更为明显，可能会出现轻微出血。此时应更换为绿色砂轮钻头，并格外小心地继续钻磨，因为松质层更为脆弱。绿色砂轮钻头可减少骨组织去除量，同时使颅窗表面更加均匀。应不时暂停钻磨，以清除骨屑并冷却颅骨。
5. 最后，当颅骨变得较为透明且脑表面的血管结构可见时，开始使用抛光钻头对颅骨进行抛光。此步骤可在进一步精确减薄的同时使颅骨表面更加平滑。可用镊子轻轻敲击颅骨以检查其薄度。当颅骨变得略有弹性时，停止抛光。
6. 此时，变薄的颅窗应完全光滑且具有反光性，已准备好用于成像（图1）。由于脑组织具有高度散射特性，为获得最佳成像深度，颅骨应至少磨薄至55 μm。所用材料清单见表1。

3. 光学相干断层扫描成像

1. 手术完成后，检查动物的呼吸频率和反射，以确认麻醉深度是否合适，必要时追加麻醉剂。将动物从立体定位仪上取下，保持其包裹在手术单中，并转移至成像工作站。
2. 成像前检查动物的反射情况，必要时涂抹人工泪液。将动物固定在立体定位仪上，以稳定颅骨。
3. 将动物置于OCT相机下，并将TSCW置于光束下方（图2）。此时可观察到颅骨与脑组织的横截面图像（图3）。
4. 定位感兴趣区域后即可开始数据采集。为实现成像，我们使用振镜获得宽度为4.0 mm的成像视野。在入射功率为6 mW、聚焦点位于减薄颅骨下方1 mm的条件下，可达到2 mm的成像深度。每个横截面由2,048条轴向扫描线组成，图像采集速率为每幅0.14秒。
5. 通过使用两组振镜进行x-y方向扫描，可采集一系列二维横截面图像，从而获得脑组织的三维扫描图像，其中第一组振镜使光束在矢状方向扫描，第二组振镜在冠状方向扫描。

结果

在大脑皮层上创建减薄窗后，血管结构应变得更加清晰可见（图1），并可实现更深的成像深度（可达1 mm）。右侧皮层被减薄至约55 μm，而正常颅骨厚度约为140 μm（图1），从而提供了更佳的光学透明度。进一步减薄至10–15 μm是可能的¹¹，但由于本实验未使用玻璃盖玻片和颅骨板，因此并非必要（图1和图2）。该特定方法使我们能够在OCT横断面图像中识别特定结构（大脑皮层、胼胝体）（图3）。图中展示了正常颅骨（图3A）与减薄颅骨（图3B）的旁矢状面OCT图像，以比较成功实施经颅减薄颅窗（TSCW）后的OCT成像效果。此外，还获取了冠状面OCT横断面图像，以辅助识别中线结构（图3C）。图3的最大信号强度比噪声基底高45 dB。对未减薄颅骨与减薄颅骨的强度分布对比显示，在TSCW模型中信号强度更高且穿透深度更大（图4）。<...

讨论

使用OCT和磨薄颅骨进行成像是一种新型神经成像技术，近年来才开始受到研究^{15, 16}在我们的实验中，我们通过小鼠模型证明了利用TSCW进行SD-OCT成像的可行性 体内根据我们的结果，颅骨被减薄至约55 μm，成像轴向和横向分辨率分别为8 μm和20 μm，穿透深度可达约1 mm。在信号强度分布中，与正常颅骨相比，通过TSCW进行OCT成像可提高信号强度和穿透深度图4相比之下，使用TSCW在颅骨厚度约为10–15 μm时进行双光子成像，可达到皮层表面下150–250 μm的成像深度^{10, 11, 13} 轴向分辨率为约 3 μm¹⁰ 而厚度约为20 μm的颅骨成像深度可达大脑皮层内300–400 μm¹²总体而言，光学相干断层扫描（OCT）作为一种成像模式展现出良好的应用前景，可在组织透明化切片（TSCW）减薄过程中允许更厚的样本厚度，同时相比多光子显微镜具有更深的成像穿透深度。

采用去薄颅骨法在光学成像（如OCT^{15, 16}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Phoenix Pharmaceuticals	57319-542-02
赛拉嗪	Akorn, Inc.	139-236
人工泪液软膏	Rugby	0536-6550-91
脱毛膏（Nair）	Church & Dwight Co., Inc.	4010130
无菌酒精消毒片	Kendall Healthcare	6818
棉签	Fisherbrand	23-400-115
聚维酮碘溶液涂抹棒	Purdue Products	67618-153-01
生理盐水溶液，0.9%	Phoenix Pharmaceuticals	57319-555-08
立体定位仪	Stoelting
高速外科手柄钻	Foredom		38,000 rpm
碳化钨圆磨头	Stoelting		0.75 mm
Dura-Green 磨石	Shofu		柄部：HP 形状：BA1
CompoMaster 粗磨头与 CompoMaster 抛光头	Shofu		形状：Mini-Pt.
SpaceDrapes 手术铺巾	Braintree Scientific, Inc.