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方法文章

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

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DOI：

10.3791/50057

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2013年1月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

摘要

评估基因的表达模式及其转录RNA的亚细胞定位特性，是理解其在发育过程中生物学功能的关键特征。RNA 原位 杂交（RNA-ISH）是一种强大的方法，可用于观察RNA在个体、细胞或亚细胞水平上的分布特性1。RNA-ISH基于使用标记的核酸探针（例如 反义RNA、寡核苷酸）与目标mRNA或非编码RNA序列互补配对的原理2。由于该方法仅需目标序列的初级序列信息即可生成序列特异性探针，因此可广泛适用于多种生物体和组织样本3。事实上，已有多个大规模的原位杂交研究在不同模式生物中系统记录了基因表达和RNA定位动态，从而建立了重要的公共资源4-11。尽管多年来已发展出多种探针标记与检测策略，但结合使用荧光标记的检测试剂与酶促信号放大步骤，可显著提高该方法的灵敏度和分辨率12。本文中，我们描述了一种优化的荧光原位 杂交方法（FISH），采用酪胺信号放大技术（TSA），用于可视化不同发育阶段果蝇（Drosophila）胚胎中RNA的表达与定位动态。该实验流程在96孔PCR板中进行，可极大方便大量样本的同步处理。

方案

1. RNA 探针制备

概述：以下部分描述了制备适用于荧光原位杂交（FISH）的地高辛标记（Dig）RNA探针所需的步骤。第一步是克隆或通过PCR扩增目标基因转录区域的相应序列，用于生成序列特异性的探针。可通过将基因片段克隆至质粒中实现，该质粒的多克隆位点两侧含有噬菌体启动子元件（T7、T3或Sp6），随后可使用包含启动子序列的侧翼引物对该质粒进行PCR扩增，从而获得在两端分别带有不同启动子序列的线性PCR产物（图1A）。或者，为避免克隆步骤，也可直接以基因组DNA或cDNA为模板，使用在5'端包含T7、T3或Sp6序列的寡核苷酸引物进行PCR扩增（例如 T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'；T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'；Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'）。随后，将这些线性PCR产物作为模板，利用相应的RNA聚合酶进行末端延伸的体外转录（run-off in vitro transcription），从而合成地高辛标记的正义链或反义链RNA探针（图1B）。在制备特定基因的探针时，我们建议使用不同的聚合酶分别制备正义链和反义链RNA探针，这有助于评估FISH信号的特异性（即 除非目标基因以反义方向转录，否则正义RNA探针将显示背景信号水平）。在以下所有步骤中，应特别注意防止外源性核糖核酸酶（RNAses）可能引起的降解，操作前需先用70%乙醇或商用RNase去污染溶液清洁所有实验台面和设备，并使用无RNase的耗材（例如 水、枪头、微量离心管）。

材料

  • 1.5 ml 微量离心管（Abgene，美国纽约州罗切斯特，货号 0900）
  • 凝胶回收试剂盒（QIAGEN，加拿大安大略省密西沙加，货号 28706）
  • 无 RNA 酶水（Wisent, Inc.，货号 809-115-CL）
  • RNA 聚合酶（T7、T3 或 SP6）（20 U/μl，Fermentas Biosciences，货号 EP0101、EP0111、EP0131）
  • RNA酶抑制剂（RNase-OUT，40 U/μl）（Invitrogen，加拿大安大略省伯灵顿，货号 10777-019）
  • 地高辛（Digoxigenin, DIG）标记核苷酸混合物（DIG-11-UTP，Roche Applied Biosciences，加拿大魁北克省拉瓦尔，货号 11209256910）

仪器设备

  • 台式微型离心机
  • 凝胶电泳装置
  1. 从基因组DNA、cDNA或质粒DNA中通过PCR扩增基因特异性序列，以获得两端带有噬菌体T7、T3或Sp6启动子序列的线性PCR产物。PCR反应条件请遵循试剂生产商的推荐。
  2. 通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和大小。根据生产商的说明，使用标准凝胶回收试剂盒切取并纯化目标条带，并用50 μl洗脱缓冲液洗脱产物。
  3. 向PCR产物中加入5 μl 3M乙酸钠（pH 5.2）和150 μl预冷的100%乙醇，于-70 °C沉淀过夜。在4 °C下以13,000 × g离心10分钟，弃上清后用70%乙醇洗涤沉淀。再次离心，彻底去除乙醇残留，室温下空气干燥沉淀。将沉淀重悬于25–50 μl无RNA酶的水中。
  4. 以200–500 ng纯化的PCR产物为模板，在20 μl反应体系中进行地高辛（Dig）标记探针的体外转录，反应体系如下：2 μl 10X T7转录缓冲液（Invitrogen）、1 μl（20 U/μl）RNA酶抑制剂、2 μl Dig-NTP混合物、2 μl T7 RNA聚合酶（20 U/μl），用无RNA酶的水补足至终体积20 μl。将转录反应在37 °C孵育3–4小时。
  5. 用无RNA酶的水将转录产物调整至50 μl，并按照步骤3的方法沉淀地高辛标记的RNA探针。将洗涤后的RNA沉淀重悬于100 μl无RNA酶的水中。将重悬的探针样品储存于-70 °C。
  6. 使用NanoDrop分光光度计对探针进行定量。为验证探针质量，取1–2 μl样品在含溴化乙锭的1–2%琼脂糖凝胶上电泳检测。

2. 样本采集与固定 果蝇 胚胎

概述：本部分描述了收集和处理不同发育阶段的Drosophila胚胎的步骤。根据所需胚胎的数量，果蝇可在不同大小的群体饲养笼中维持培养。以下步骤适用于使用900 cm3圆柱形饲养笼及100 mm苹果汁收集板进行的胚胎收集。适当的固定需要去除包围胚胎的两层保护结构：外层的卵壳（chorion）和内层的卵黄膜（vitelline membrane）13。收获胚胎后，首先将其置于50%次氯酸钠溶液中浸泡以去除卵壳，随后将其与含有庚烷（用于通透卵黄膜）和含3.7%甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）的两相溶液混合。接着通过将胚胎转移至庚烷与甲醇组成的两相混合液中，使卵黄膜破裂并被去除。正确固定胚胎并有效去除卵黄膜对于后续FISH实验的成功至关重要。

材料

  • 苹果汁琼脂平板（40% 苹果汁，4% 蔗糖，3.5% 琼脂，0.3% 对羟基苯甲酸甲酯），配以硬币大小的酵母糊（将面包酵母与水混合至黄油状稠度）
  • 粉末状多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德；货号：19208）
  • 正庚烷
  • 甲醇
  • 3% 次氯酸钠溶液
  • 20 ml 玻璃闪烁瓶（Thermo Fisher Scientific，加拿大安大略省渥太华；货号：03-337-15）

仪器设备

  • 种群笼
  • 收集篮（使用 Nitex 网格和剪去底部的 50 ml 聚丙烯管上部制成，管盖上需打孔）
  • 小型毛笔
  • 台式涡旋振荡器
  1. 在25 °C下，用新鲜的苹果汁/酵母培养板对饲养良好的果蝇种群笼进行预清除，持续1小时。
  2. 向笼中添加新的苹果汁/酵母培养板以收集早期胚胎。在25 °C下孵育笼子4小时（注意：可根据所需胚胎发育阶段调整收集时间）。
  3. 在通风橱内，将3.7 g多聚甲醛粉末、70 μl的2N KOH和7.3 ml的milliQ水加入玻璃闪烁瓶中，配制新鲜的37%甲醛溶液。加热至多聚甲醛完全溶解，随后冷却至室温，并过滤至新的闪烁瓶中。
  4. 在闪烁瓶中将2.25 ml的1X PBS与250 μl的37%甲醛混合，再加入7.5 ml庚烷，配制双相固定液。
  5. 从笼中取出苹果汁培养板，加入少量室温自来水，用画笔轻轻刷下胚胎以收集。将重悬的胚胎转移至收集篮中，并用温自来水冲洗。
  6. 将收集篮浸入漂白液中90秒以去除卵膜，随后用温自来水彻底冲洗（直至无漂白剂气味）。
  7. 拆开收集篮，用画笔轻柔地收集胚胎，并将其转移至双相固定液中。胚胎将聚集在PBS与庚烷两相之间的界面处。
  8. 密封闪烁瓶并固定于涡旋振荡器上，以最低转速振荡20分钟。
  9. 使用巴斯德移液管移除并弃去大部分下层PBS相和上层庚烷相。将残留的PBS/庚烷/胚胎混合物吸入移液管中，逐滴弃去下层PBS相，注意避免损失胚胎。将胚胎沉积至含有500 μl庚烷（上相）和500 μl甲醇（下相）双相溶液的1.5 ml离心管中。
  10. 手动剧烈振荡离心管30–45秒，以破裂卵黄膜。一旦卵黄膜破裂，胚胎将沉入甲醇相中。
  11. 弃去上层庚烷相以及位于庚烷/甲醇界面处未破裂的胚胎，加入500 μl甲醇。振荡5秒。
  12. 用甲醇洗涤3次，并将胚胎保存于-20 °C（此时胚胎可保存数周至数月）。

3. 固定后处理、杂交及杂交后洗涤

概述：本部分详细介绍了在进行FISH实验前，胚胎通透化的处理步骤，包括预杂交、与RNA探针杂交以及杂交后的洗涤步骤。在初始的通透化步骤中，胚胎以混合形式在单个离心管中处理（如下步骤1-9，目标为每样本获得10-15 μl沉淀胚胎体积），但在进入预杂交步骤前（如下步骤10），需将胚胎分装至96孔PCR板的各个独立孔中。此操作有助于确保实验初期所有胚胎均得到均一处理。在设置FISH实验时，应包含阴性对照，以确定每次实验中的背景信号水平。为此，我们建议设置一个“无探针”样本，并如第1节所述，设置一个使用“正义”RNA探针进行杂交的样本，该样本通常产生的信号与“无探针”条件相当。

材料：

  • 甲醇
  • 含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBT）
  • 蛋白酶K 1 mg/ml 储存液（Sigma Aldrich，加拿大奥克维尔。货号：P2308）
  • 甘氨酸（20 mg/ml 储存液）
  • 杂交溶液：50% 甲酰胺，5X SSC，0.1% Tween-20，100 μg/ml 剪切的鲑鱼精子DNA，100 μg/ml 肝素
  • 0.2 ml 半裙边96孔PCR板，Abgene，美国纽约州罗切斯特，货号：0900

仪器设备

  • 可调节至 56 °C、80 °C 或 100 °C 的杂交炉、数字加热块、水浴锅，或 PCR 仪。
  • 多通道移液器（建议使用以简化洗涤步骤）
  • 旋转摇床
  1. 用甲醇冲洗胚胎，然后用甲醇:PBT（1:1）混合液冲洗，再用PBT冲洗两次。
  2. 在1 ml含有3.7%新鲜配制甲醛（按步骤11所述配制）的PBT中固定胚胎，持续在振荡器上轻轻摇动20分钟。
  3. 在PBT中振荡洗涤胚胎，每次2分钟，共洗3次。
  4. 在PBT中配制3 μg/ml的蛋白酶K（PK）溶液，并向每个样品中加入500 μl。在室温下孵育10分钟，不摇动。每2分钟用移液器吹打或轻轻翻转管子混合胚胎。
  5. 将胚胎样品转移至冰上放置1小时。
  6. 将样品移至室温，吸除PK溶液。用含2 mg/ml甘氨酸的PBT溶液（1 ml）洗涤2次，每次2分钟。
  7. 在1 ml含3.7%甲醛的PBT中固定样品20分钟，持续摇动。用PBT冲洗胚胎5次。
  8. 用1 ml PBT与杂交液（Hyb solution）的1:1混合液冲洗胚胎，然后更换为0.5–1 ml的100%杂交液（此步后胚胎可在-20 °C保存数天至数周）。
  9. 将胚胎分装至96孔板的各个孔中（每孔约含10–15 μl沉淀胚胎，注意使用宽口吸头以避免损伤胚胎）。
  10. 将100 μl/样品的杂交液在80 °C加热5分钟，然后在冰上冷却5分钟。该溶液用于样品的预杂交（Pre-Hyb）。
  11. 向每个样品加入100 μl预杂交液，在56 °C孵育至少2小时。
  12. 对每个样品，将约100 ng探针溶于100 μl杂交液中。在80 °C加热3分钟，然后在冰上冷却5分钟（加热后的探针可在冰上保存数小时）。
  13. 吸除胚胎中的预杂交液，替换为RNA探针溶液。
  14. 在56 °C杂交12–16小时。
  15. 提前将以下洗涤液预热至56 °C：(A) 每样品200 μl杂交液；(B) 每样品100 μl杂交液:PBT（3:1）混合液；(C) 每样品100 μl杂交液:PBT（1:1）混合液；(D) 每样品100 μl杂交液:PBT（1:3）混合液；(E) 每样品400 μl PBT。
  16. 先用100 μl洗涤液A冲洗样品，然后在56 °C下依次用每样品100 μl的溶液A–D各洗涤15分钟。随后在56 °C下用每样品100 μl的溶液E洗涤4次，每次5分钟。
  17. 将样品冷却至室温。

4. 探针检测

概述：本部分描述了用于在杂交后检测和可视化RNA探针信号分布的抗体及检测试剂。这些步骤在图2中以示意图形式展示。此处仅列出我们用于强效信号扩增的标准检测试剂，但市面上也存在多种可替代的试剂可供选择，尤其是在进行双重FISH实验以同时共检测不同RNA或进行蛋白-RNA双重染色时。本方案所获得结果的示例展示于图3的mRNA表达/定位模式嵌合图中。

材料

  • HRP标记的小鼠单克隆抗DIG抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 货号：200-032-156）
  • 生物素标记的小鼠单克隆抗DIG抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 货号：200-062-156）
  • 链霉亲和素-HRP偶联物（Molecular Probes, Eugene OR, USA, 货号：S991）
  • Cy3-酪胺偶联物（Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, 货号：SAT704A）
  • DABCO封片液：取1.25克DABCO（1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷；Sigma D-2522）加入50 ml离心管中，先用15 ml 1×PBS溶解，再加入35 ml甘油，混匀至完全均一。预先用PBS稀释可显著加快DABCO粉末的溶解。将封片液于-20 °C保存。
  • 载玻片、盖玻片

仪器设备

  • 旋转混匀仪
  • 多通道移液器
  • 荧光显微镜
  1. 配制 PBTB 溶液，其中包含 PBT 和 1% 脱脂奶粉（通常 50–100 ml 足以用于所有检测试剂孵育和洗涤步骤）。
  2. 在室温下，将样品置于 100 μl PBTB/样品中，于旋转摇床（nutator）上振荡孵育 10 分钟以封闭非特异性结合位点。
  3. 移除封闭液，加入 100 μl/样品的单克隆生物素化抗 DIG 抗体溶液（用 PBTB 将原液稀释 1/400），室温下振荡孵育 1.5–2 小时。
  4. 用 100 μl/样品的 PBTB 溶液，在振荡条件下洗涤样品 6 次，每次 5 分钟。
  5. 加入 75 ml/样品的链霉亲和素-HRP 溶液（用 PBTB 将原液稀释 1/100，终浓度为 10 μg/ml），室温振荡孵育 1.5 小时。
  6. 用 100 μl/样品的 PBTB 溶液，在振荡条件下洗涤样品 6 次，每次 5 分钟（如需进行 DNA 复染，将 DAPI 用 PBTB 稀释至 1× 工作浓度，并在第一次洗涤时使用该溶液）。
  7. 用 PBT 冲洗胚胎，随后用 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
  8. 在旋转摇床（nutator）上，加入 50 μl/样品的 Cy3-酪胺溶液（用酪胺扩增缓冲液稀释 1/50），室温孵育 2 小时。从本步骤开始，务必确保样品置于避光容器中。
  9. 在旋转摇床（nutator）上，用 100 μl/样品的 PBS 溶液洗涤样品 6 次，每次 5 分钟。
  10. 移除 PBS，加入 100–125 μl/样品的封片液（含 70% 甘油和 2.5% DABCO）。将样品于 4 °C 保存，可长期保存数年。
  11. 使用宽口吸头，通过轻柔吹打重悬胚胎，取 25 μl 胚胎悬液转移至载玻片上，盖上盖玻片，并用指甲油密封固定。
  12. 使用荧光显微镜观察胚胎样品。

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结果

当操作成功时，该实验方法可显著提升在早期黑腹果蝇（Drosophila）胚胎发育过程中对基因表达时空动态及 mRNA 定位动态的分析细节水平。实际上，如图3A中经典的成对规则基因runt（run）所示，可通过本方案检测正在生成的转录焦点，从而观察到特定核群中的基因表达事件。此外，如图3B中的胚胎嵌合图像所示，该方法还能实现对 mRNA 定位特征的高分辨率可视化。

DNA分析流程图：探针制备、杂交、检测、显微镜分析。
图1. RNA探针制备流程示意图。(A) 利用两侧带有噬菌体RNA聚合酶启动子元件的线性DNA模板，通过体外...

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讨论

探针合成步骤中，我们通常通过体外转录生成反义RNA探针 体外 全长转录本 果蝇 从质粒中扩增的cDNA 黑腹果蝇 基因收集中心（DGC），相关信息详见以下网站： http://www.fruitfly.org/DGC/index.html 14,15该方法已广泛应用于大规模原位杂交研究中，旨在绘制果蝇胚胎中的基因表达和mRNA定位模式图谱 9,16DGC 质粒可从以下途径订购： 果蝇 基因组资源中心（https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/）。起始材料的灵活性以及设计带有T7、SP6或T3突出端的定制引物的能力，使得研究人员能够轻松地生成用于检测特定mRNA异构体的探针（例如 选择性剪接变体）或在标准c...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

Lécuyer 实验室的工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、加拿大卫生研究院（CIHR）以及魁北克健康研究基金会（FRSQ）的资助。Fabio Alexis Lefebvre 和 Gaël Moquin-Beaudry 获得了 NSERC 本科生研究奖学金的支持，而 Carole Iampietro 则获得了 Angelo Pizzagalli 博士后奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶 Fermentas Life SciencesEP0101,EP0111,EP0131试剂盒包含反应缓冲液。
DIG RNA 标记混合物 Roche Applied Science11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences27-0816-01
3M 醋酸钠
预冷的 100% 乙醇。
预冷的 70% 乙醇。
用蒸馏水按 1:1 比例稀释的次氯酸钠漂白液。
正庚烷
甲醇
蛋白酶 K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada目录号 P2308
新配制的 40% 甲醛溶液
PBS-吐温溶液（PBT） 1xPBS，0.1% Tween-20
甘氨酸溶液 2 mg/ml 甘氨酸溶于 PBT 中
HRP 标记的小鼠单克隆抗 DIG 抗体 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc200-032-156以 PBTB 将 1 mg/ml 储存液稀释至 1/400
HRP 标记的绵羊单克隆抗 DIG 抗体 Roche Applied Science, Laval, QC1 207 733以 PBTB 将储存液稀释至 1/500
生物素标记的小鼠单克隆抗 DIG 抗体 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA200-062-156以 PBTB 将 1 mg/ml 储存液稀释至 1/400
链霉亲和素-HRP 偶联物 Molecular Probes, Eugene OR, USAS991以 PBTB 将 1 μg/ml 储存液稀释至 1/100

参考文献

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  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846(2004).

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