此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.
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方法文章
完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
评估基因的表达模式及其转录RNA的亚细胞定位特性，是理解其在发育过程中生物学功能的关键特征。RNA 原位 杂交（RNA-ISH）是一种强大的方法，可用于观察RNA在个体、细胞或亚细胞水平上的分布特性1。RNA-ISH基于使用标记的核酸探针（例如 反义RNA、寡核苷酸）与目标mRNA或非编码RNA序列互补配对的原理2。由于该方法仅需目标序列的初级序列信息即可生成序列特异性探针，因此可广泛适用于多种生物体和组织样本3。事实上，已有多个大规模的原位杂交研究在不同模式生物中系统记录了基因表达和RNA定位动态，从而建立了重要的公共资源4-11。尽管多年来已发展出多种探针标记与检测策略，但结合使用荧光标记的检测试剂与酶促信号放大步骤，可显著提高该方法的灵敏度和分辨率12。本文中，我们描述了一种优化的荧光原位 杂交方法（FISH），采用酪胺信号放大技术（TSA），用于可视化不同发育阶段果蝇（Drosophila）胚胎中RNA的表达与定位动态。该实验流程在96孔PCR板中进行，可极大方便大量样本的同步处理。
方案
1. RNA 探针制备
概述：以下部分描述了制备适用于荧光原位杂交（FISH）的地高辛标记（Dig）RNA探针所需的步骤。第一步是克隆或通过PCR扩增目标基因转录区域的相应序列，用于生成序列特异性的探针。可通过将基因片段克隆至质粒中实现，该质粒的多克隆位点两侧含有噬菌体启动子元件（T7、T3或Sp6），随后可使用包含启动子序列的侧翼引物对该质粒进行PCR扩增，从而获得在两端分别带有不同启动子序列的线性PCR产物（图1A）。或者，为避免克隆步骤，也可直接以基因组DNA或cDNA为模板，使用在5'端包含T7、T3或Sp6序列的寡核苷酸引物进行PCR扩增（例如 T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'；T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'；Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'）。随后，将这些线性PCR产物作为模板，利用相应的RNA聚合酶进行末端延伸的体外转录（run-off in vitro transcription），从而合成地高辛标记的正义链或反义链RNA探针（图1B）。在制备特定基因的探针时，我们建议使用不同的聚合酶分别制备正义链和反义链RNA探针，这有助于评估FISH信号的特异性（即 除非目标基因以反义方向转录，否则正义RNA探针将显示....
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结果
当操作成功时，该实验方法可显著提升在早期黑腹果蝇（Drosophila）胚胎发育过程中对基因表达时空动态及 mRNA 定位动态的分析细节水平。实际上，如图3A中经典的成对规则基因runt（run）所示，可通过本方案检测正在生成的转录焦点，从而观察到特定核群中的基因表达事件。此外，如图3B中的胚胎嵌合图像所示，该方法还能实现对 mRNA 定位特征的高分辨率可视化。
图1. RNA探针制备流程示意图。(A) 利用两侧带有噬菌体RNA聚合酶启动子元件的线性DNA模板，通过体外.......
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讨论
探针合成步骤中，我们通常通过体外转录生成反义RNA探针 体外 全长转录本 果蝇 从质粒中扩增的cDNA 黑腹果蝇 基因收集中心（DGC），相关信息详见以下网站： http://www.fruitfly.org/DGC/index.html 14,15该方法已广泛应用于大规模原位杂交研究中，旨在绘制果蝇胚胎中的基因表达和mRNA定位模式图谱 9,16DGC 质粒可从以下途径订购： 果蝇 基因组资源中心（https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/）。起始材料的灵活性以及设计带有T7、SP6或T3突出端的定制引物的能力，使得研究人员能够轻松地生成用于检测特定mRNA异构体的探针（例如 选择性剪接变体）或在标准c.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
Lécuyer 实验室的工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、加拿大卫生研究院（CIHR）以及魁北克健康研究基金会（FRSQ）的资助。Fabio Alexis Lefebvre 和 Gaël Moquin-Beaudry 获得了 NSERC 本科生研究奖学金的支持，而 Carole Iampietro 则获得了 Angelo Pizzagalli 博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶 | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | 试剂盒包含反应缓冲液。 |
| DIG RNA 标记混合物 | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M 醋酸钠 | |||
| 预冷的 100% 乙醇。 | |||
| 预冷的 70% 乙醇。 | |||
| 用蒸馏水按 1:1 比例稀释的次氯酸钠漂白液。 | |||
| 正庚烷 | |||
| 甲醇 | |||
| 蛋白酶 K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | 目录号 P2308 | |
| 新配制的 40% 甲醛溶液 | |||
| PBS-吐温溶液（PBT） | 1xPBS，0.1% Tween-20 | ||
| 甘氨酸溶液 | 2 mg/ml 甘氨酸溶于 PBT 中 | ||
| HRP 标记的小鼠单克隆抗 DIG 抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032-156 | 以 PBTB 将 1 mg/ml 储存液稀释至 1/400 |
| HRP 标记的绵羊单克隆抗 DIG 抗体 | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 以 PBTB 将储存液稀释至 1/500 |
| 生物素标记的小鼠单克隆抗 DIG 抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | 以 PBTB 将 1 mg/ml 储存液稀释至 1/400 |
| 链霉亲和素-HRP 偶联物 | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | 以 PBTB 将 1 μg/ml 储存液稀释至 1/100 |
参考文献
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the loca....
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重印与许可
