T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

摘要

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。

摘要

癌症免疫治疗可以利用免疫反应的特异性来靶向并清除肿瘤。基于过继性转移经基因改造以表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞的过继性细胞治疗（ACT），在临床试验中已显示出巨大前景^1-4。使用CAR⁺ T细胞治疗癌症具有多项优势，包括能够靶向非MHC限制性抗原，对T细胞进行功能优化以实现在宿主体内的最佳存活、归巢和持久性；最后，当出现宿主毒性时，可诱导CAR⁺ T细胞发生凋亡⁵。

明确CAR的最佳功能⁺ 与临床获益相关的T细胞对于设计下一代临床试验至关重要。活体动物成像技术（如多光子显微镜）的最新进展已彻底改变了免疫细胞功能的研究。 体内^6,7尽管这些研究推动了我们对T细胞功能的理解 体内基于T细胞的过继性细胞治疗（ACT）在临床试验中，需要通过利用输注前T细胞制剂的分子与功能特征，将其与输注后的临床疗效相关联 体外 检测T细胞功能（如细胞毒性和细胞因子分泌）的实验方法。目前已开发出基于标准流式细胞术的检测方法，可在单细胞水平上测定T细胞群体的整体功能，但这些方法不适用于监测免疫突触的形成与持续时间，或同一细胞杀伤多个靶细胞的能力。⁸.

采用生物相容性聚合物（如聚二甲基硅氧烷（PDMS））制备的微加工阵列，是一种在微小体积内对效应细胞与靶细胞进行空间限制的极具吸引力的方法⁹。结合自动化的延时荧光显微镜技术，可通过成像纳米孔阵列中的各个独立孔，同时监测数千个效应细胞-靶细胞相互作用。本文介绍一种高通量的方法，用于在单细胞水平上监测T细胞介导的细胞毒性，该方法可广泛应用于研究T细胞的溶细胞功能。

方案

1. 试剂准备

1. 通过将500 ml RPMI-1640与各5 ml的青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和HEPES溶液混合，制备RPMI-PLGH。
2. 通过将RPMI-PLGH与10%胎牛血清（FBS）混合制备R10溶液。FBS在添加前需在56 °C下热灭活30分钟。
3. 将50 ml RPMI-PLGH、15 ml PBS和15 ml R10在无菌锥形管中于37 °C预热。
4. PDMS中纳米孔阵列的制备：硅模板的制备采用光刻技术，基本步骤如先前所述¹⁰。在一次性杯子中使用塑料刀以10:1的质量比充分混合Sylgard 184弹性体试剂盒的基础剂和固化剂。将混合物置于真空腔中脱气1小时。将混合物倒入纳米孔阵列上，用载玻片密封并静置30分钟。将组装件转移至设定为80 °C的烘箱中加热2小时，然后在室温下冷却1小时。在此期间，弹性体会固化并与载玻片粘合。含有PDMS纳米孔阵列的载玻片从硅模板上小心剥离，用透明胶带覆盖后保存，以备后续使用。

2. 靶细胞（T）标记

1. 使用血细胞计数板计数500万个靶细胞，并在无菌15 ml锥形管中以340 × g离心5分钟收集细胞。前一天将细胞培养物以总体积5 ml（密度=100万个/ml）分装至T-25培养瓶（VWR）中进行培养。使用血细胞计数板进行细胞计数的实验方案此前已有详细描述¹¹。
2. 吸除多余培养基，保留约50 μl培养基。
3. 通过将0.5 μl CTR储备液（1 mM）与150 μl RPMI-PLGH混合，配制Cell Tracker Red（CTR）工作液（终浓度为2.5 μM）。向靶细胞中加入150 μl工作液，并使用P200移液器充分混匀。或者，可根据生产商说明书使用PKH26（终浓度为2 μM）对靶细胞进行标记。
4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育20分钟。

3. 效应（E）细胞标记

1. 使用血细胞计数板从细胞培养物中计数500万个效应细胞，并在无菌15 ml锥形管中以340 × g离心5分钟收集细胞。
2. 吸除多余培养基
3. 通过将1 μl的5 mM Vybrant Violet储备液加入1 ml R10培养基中，制备Vybrant DyeCycle Violet染料的工作液（终浓度为5 μM）。将工作液加入细胞中，并使用P200移液器重悬细胞。 alternatively，可根据制造商说明书使用PKH67（终浓度为2 μM）标记靶细胞。如果使用PKH67，则不应使用SYTOX Green，因为它们处于相同的荧光通道。在此情况下，凋亡靶细胞的计数 exclusively 通过Annexin V染色完成。
   注意： 若进行延时成像而非终点检测，应避免使用Vybrant Violet等紫外染料。
4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育20分钟。

4. 使用密度梯度分离活细胞与死细胞

1. 向靶细胞和效应细胞中分别加入 6.8 ml 和 6.0 ml RPMI-PLGH，用移液器轻轻吹打混匀。
2. 将 3.5 ml FICOLL-Paque Plus 缓慢地沿管壁加入含有靶细胞和效应细胞的锥形管底部。缓慢加入 FICOLL，以确保 FICOLL 与培养基之间形成清晰的分层。
3. 将两根离心管在 340 × g 条件下离心 30 分钟，不使用刹车和加速。
4. 在离心过程中，将 7 ml 预热的 PBS 转移至 4 孔板中。准备纳米孔阵列（在 PDMS 中制备）：用乙醇清洁载玻片底部，并使用等离子氧化仪在高射频（RF）设置下对 PDMS 进行 1 分钟氧化处理。此步骤可对纳米孔阵列进行灭菌，同时使 PDMS 表面变为亲水性。立即把纳米孔阵列放入含 PBS 的孔板中。
5. 将孔板转移至生物安全柜中，吸除多余的 PBS。通过将 100 mg 琼脂粉加入 10 ml 去离子水中，微波加热 30–45 秒，制备 10 ml 1% Noble 琼脂。将温热的 1% Noble 琼脂涂布于含有纳米孔阵列的载玻片顶部和底部边缘，以固定阵列，并静置 10 分钟使琼脂凝固。加入 3 ml PBS，吸除多余的琼脂。
6. 在纳米孔阵列上方加入 3 ml R10，平衡约 10 分钟。
7. FICOLL 离心后，从每根离心管的上层小心吸除 5 ml 培养基，注意不要吸到含有细胞的层。
8. 用 P1,000 移液器从 FICOLL 与培养基之间的界面层（白色层）回收 1–2 ml 细胞，转移至新的无菌锥形管中，收集细胞。对两组细胞重复此操作，注意尽量提高细胞回收率。
9. 向每根离心管中加入 3 ml 预热的 RPMI-PLGH，用移液器吹打混匀，然后在 340 × g 条件下以全速加速和刹车离心 5 分钟。
10. 吸除多余培养基，向每根离心管中加入 5 ml 预热的 RPMI-PLGH，再次在 340 × g 条件下离心 5 分钟。
11. 吸除多余培养基，将细胞沉淀重悬于 500 μl R10 中。
12. 使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数活细胞。

5. 将细胞加载至纳米孔阵列

1. 吸去纳米孔阵列表面多余的培养基，并在整个阵列上加入 2 ml 新鲜的 R10 培养基。再次吸去液体，同时确保纳米孔阵列顶部不过于湿润或干燥，以免影响细胞分布。
2. 将 1 × 10⁵ 效应细胞溶于 200 μl R10 培养基中，接种至纳米孔阵列表面（细胞密度 = 5 × 10⁵ 细胞/ml）。
3. 静置细胞 5 分钟，使用标准组织培养显微镜检查，确保细胞分布理想。如有必要，补充更多细胞。
4. 将 1 × 10⁵ 靶细胞溶于 200 μl R10 培养基中，接种至纳米孔阵列表面（细胞密度 = 5 × 10⁵ 细胞/ml）。
5. 静置细胞 5 分钟，使用标准组织培养显微镜检查，确保细胞分布理想。如有必要，补充更多细胞。
6. 用 2 ml R10 培养基小心冲洗纳米孔阵列，并吸去多余液体。
7. 在 15 ml 无菌锥形管中准备 3 ml 预热的 R10 培养基。加入 3 μl 0.5 mM SYTOX Green 核酸染料（终浓度 0.5 μM）和 60 μl Annexin V-Alexa Fluor 647，配制成工作液。小心将工作液加入 4 孔板中，注意避免细胞从孔中移位。
8. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 15 分钟。

6. 成像 1

1. 使用荧光显微镜获取纳米孔阵列的图像：在本示例中，我们使用配备电动载物台和Lambda-DG4的ZEISS Observer Z-1显微镜。
2. 初始化软件和显微镜，并检查透射光及其他荧光通道的信号强度。总体上共有五个通道，分别对应：透射光、Annexin V-647（Cy5滤光片）、CTR（DsRed滤光片）、SYTOX Green（FITC滤光片）和Vybrant Violet（DAPI滤光片）。确保显微镜设置能够实现最大信噪比，同时避免信号饱和。
3. 设置纳米孔阵列的X和Y位置。首先将零位设为纳米孔阵列印模左上角7×7纳米孔阵列块的中心，并在此处初始化对焦。将每个阵列块的x、y位置设置为其几何中心，z值则准确反映该块的对焦位置。
4. 当位置和对焦全部设置完成后，确保将图像采集模式设为线性模式并开始采集图像。注意：如有需要，应在实验开始前至少30分钟开启显微镜的培养箱和CO₂供应。

7. 成像后处理

将含有纳米孔阵列的4孔板放入培养箱（37 °C/5% CO₂）中孵育6小时。

8. 成像 2

按照步骤6所述，在第二个时间点获取图像。

9. 图像分析

1. 纳米孔中细胞占据情况的确定依赖于适当图像分割程序的使用（例如 ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/) 基本按照先前所述方法进行^9,12 .
2. 显微镜图像初始数据集的分析（t = 0 小时； t₀) 用于生成单个纳米孔的数据库，每个纳米孔精确包含一个活的目标细胞（通过CellTracker Red标记，呈红色），且不含任何死细胞（通过Annexin V染色检测，呈绿色）[T1t₀ 纳米孔
3. 第二组显微镜图像的分析（t =6 小时；t₆）用于独立确定第二个含有1个目标细胞（红色）[T1t]的纳米孔数据库₆ 纳米孔]。通过完整性检查（数据库查询）确保在时间点 t 的所有活体靶标₀ 与 t 时刻的目标相匹配₆ 以生成一组最终匹配的目标（实现为含有 T1t 的纳米孔）₀ = T1t₆，指定为T1match）
4. 使用Vybrant Violet染色法测定纳米孔中效应细胞的数量 t₀ [E1 纳米孔]
5. 通过数据库查询来识别含有单个效应细胞与单个靶细胞共孵育的纳米孔（定义为同时含有E1和T1的纳米孔）。_匹配，指定为E1T1）
6. 通过鉴定在 t 时刻为 Annexin V 阴性的靶细胞来评估效应细胞诱导的凋亡₀ 且在 t 时 Annexin V 呈阳性₄ (E1T1 与 t 时刻 Annexin V 靶向染色)₆).

10. 使用尼康 BioStation IM 进行杀伤过程的可选延时成像

1. 取一个底部带有盖玻片的培养皿，剪下一小块纳米孔阵列芯片（在步骤5中制备），使其恰好能够贴合在盖玻片上。切割时确保芯片始终保持湿润。
2. 将 1 × 10⁶ 个靶细胞与 1 × 10⁶ 个 T 细胞混合于 100 μl 培养基中，用移液器将混合液滴加至盖玻片上。
3. 静置约 15–30 分钟，使细胞充分沉降。
4. 迅速将小片纳米孔阵列芯片倒置，并放置于盖玻片上。
5. 为确保成像过程中芯片不会移动，可在芯片上方放置一至两片 20 mm × 20 mm 的盖玻片，并轻轻施加压力，使芯片紧贴培养皿底部。

注意：纳米孔阵列芯片的底部过厚，无法进行高分辨率成像，因此必须将其倒置。在此过程中，许多细胞会被冲洗掉。由于该过程难以精确控制，步骤 9.2 中的细胞数量和步骤 9.3 中的孵育时间需要优化。

结果

高通量细胞毒性检测方法的应用示例如图2所示。简而言之，将标记的CD19特异性CAR⁺ T细胞与标记的小鼠EL4靶细胞共同孵育于纳米孔阵列的各个孔中（第1-5节）。首先在自动荧光显微镜下采集初始图像，以确定阵列中每个纳米孔的占据情况（效应细胞和/或靶细胞）（第6节）。通过图像处理识别出所有恰好含有一个靶细胞和一个效应细胞的纳米孔，并排除含有死亡靶细胞的孔（第9节）。随后将芯片转移至培养箱中孵育6小时，之后再次对芯片成像（第7-8节）。在仅含有单个效应细胞和单个靶细胞的纳米孔中，通过Annexin V染色检测效应细胞诱导靶细胞发生凋亡的能力。为测定抗原特异性裂解频率，使用相同的效应细胞与两组不同的靶细胞（EL4-CD19⁺ 和 EL4-CD19-（阴性对照））平行开展两次实验（图2）。理想的非特异性裂解频率应较低（约2-4%）。该方法依赖于合适靶细胞的可获得性，因此需平行开展不含效应细胞的对照实验，以评估靶细胞在无效应细胞存在下的自发凋亡情况。若在6小时孵育期间，未加效应细胞的对照组中靶细胞凋亡频率较高（> 8%），则提示需优化细...

讨论

我们已概述了一种高通量单细胞细胞毒活性检测方法的实验方案，该方法通过将效应细胞与靶细胞共同孵育于纳米孔阵列中实现（图1）。除高通量外，该技术的主要优势在于能够监测效应细胞对特定靶细胞的细胞毒性作用，而无需对靶细胞进行基因工程改造，从而允许使用自体来源或配对的原代肿瘤细胞作为靶细胞。空间限域特性使得在实验结束时可回收并进一步克隆具有功能活性的T细胞⁹。该检测方法的一个局限性在于需要配备自动载物台和快速切换光学系统的专业显微镜。然而，鉴于此类设备目前已广泛作为科研核心设施的组成部分，这一限制并不严重。

基于流式细胞术的多种检测方法可在保持单细胞分辨率的同时实现更高的通量。这些方法包括针对脱颗粒替代标志物（CD107a）、效应细胞中的穿孔素含量以及靶细胞中caspase/颗粒酶活性的染色检测 ^13,14 然而，这些检测方法并不能真正监测效应细胞与靶细胞的结合，或效应细胞识别并杀伤多个靶细胞的能力。与经典的4小时51Cr释放实验（通常在效靶比为1:1的条件下进行）相比，我们的方法通常能够报告总体相当数量的细胞溶解...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640 不含 L-谷氨酰胺	Cellgro	15-040-CV
青霉素-链霉素	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. 青霉素，10,000 μg/ml 链霉素
L-谷氨酰胺	Cellgro	25-005-CI	200 mM 溶液
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1 M
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11150	经批次检测
Cell Tracker Red 染料	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet 染料	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX Green 核酸染料	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco's PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble 琼脂	DIFCO	2M220	100 g
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154	0.4% 液体，经无菌过滤
血细胞计数板	Hausser Scientifics	1492	亮线型
4 孔板	Thermo Fisher	167603
Harrick 等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC-32G	基础型等离子清洗仪
Observer.Z1	ZEISS		荧光显微镜（与以下三个部件配合使用）
Lambda 10-3	Sutter Instrument		滤光片控制器
Lambda DG-4	Sutter Instrument		超高速波长切换器
Hamamatsu EM-CCD 相机	Hamamatsu	C9100-13	CCD 显微成像相机
15 ml 圆锥形离心管	BD Falcon	352097
50 ml 圆锥形离心管	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm 培养皿，10 mm 微孔