本文描述了一种通过逆行灌注快速且完全去除完整猪心脏中细胞成分的方法。该方法可获得具有部位特异性的心脏细胞外基质支架，具有多种临床应用的潜力。
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本文内容
摘要
摘要
基于灌注的全器官脱细胞技术近年来在组织工程领域受到关注，作为一种可创建部位特异性细胞外基质支架的方法，同时在很大程度上保留支架的天然结构。迄今为止，该方法已应用于多种器官系统，包括心脏、肺和肝脏1-5。以往针对缺乏易于接近的血管网络的组织所采用的脱细胞方法，主要依赖于将组织长时间暴露于去污剂、酸或酶处理溶液中，以去除细胞和细胞核成分6-8。然而，这些方法的有效性取决于溶液通过扩散渗透组织的能力。相比之下，通过天然血管系统进行器官灌注可有效缩短扩散距离，促进脱细胞试剂进入组织，并将细胞成分从组织中运出。本文中，我们描述了一种通过冠状动脉逆行灌注完全脱细胞化完整猪心脏的方法。该方案获得了一个完全脱细胞的心脏细胞外基质（c-ECM）支架，其心脏的三维结构保持完整。我们的方法结合使用了一系列酶、去污剂和酸，并辅以高渗和低渗冲洗，以促进细胞裂解和清除。该方案首先使用胰蛋白酶溶液使细胞从基质上脱离，随后使用Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液帮助去除细胞物质。所述方案还采用了长时间高于2 L/min的灌注速度。高流速结合溶液更换，可确保试剂有效输送至组织，避免细胞碎片污染，并实现组织的有效冲洗。该方法清除了天然猪心脏组织中的全部细胞核物质，构建出一种部位特异性的心脏ECM支架，可用于多种应用。
方案
1. 组织制备与实验设置
- 从屠宰场或研究机构在实施安乐死后立即采集猪器官，并冲洗掉多余的血液。修剪心脏上的多余脂肪和组织，保留心房和主动脉的完整性。修剪脂肪以分离肺动脉与主动脉。若组织存在任何切口，应妥善弃用。
- 将每颗心脏单独用防冻纸包裹，并将所有组织置于 -80 °C 超低温冰箱中至少保存 24 小时，以确保完全冻结。
- 当准备使用时（通常在3个月内），将一颗完整的冷冻猪心脏置于4 L烧杯中，浸没于Ⅰ型水中，在4 °C条件下过夜解冻。
- 心脏完全解冻后，用纸巾吸干表面水分，称量心脏重量并记录。市售体重猪的心脏重量应约为375–450 g。
- 将Masterflex 18号管连接至¼"带齿减径接头的一端。将带齿减径接头及管路插入主动脉内，在无名动脉干下方稍处位置，用两个软管夹或扎带固定主动脉。减径接头和管路必须保持在主动脉瓣上方，以便灌注冠状动脉 （图1）。
- 使用30或60 ml注射器将Ⅰ型水注入管路中。将管路置于Masterflex滚压泵的泵头内，大致位于其中点位置。将管路的进液端浸入装有2.5 L水的4 L烧杯底部，并固定管路。
- 将心脏放入盛水的烧杯中，启动泵进行引水以排除气泡。若观察到气泡从管路插入主动脉的部位逸出，则可能需要重新调整主动脉位置或增加扎带固定。在脱细胞过程中，保持气密性密封对维持足够压力至关重要 （图2）。....
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结果
脱细胞处理对完整猪心脏的影响因心脏大小、压力和血管排列的差异而自然存在变化。因此，所获得的细胞外基质支架的具体组成在不同心脏之间并不完全相同。完成所述方案后，心脏将呈现白色或半透明状，表明细胞成分已被去除。然而，目前普遍认为，组织是否达到“脱细胞化”应基于若干更定量的参数综合判断8。成功的脱细胞化方案所获得的基质，其每毫克组织中的双链DNA含量应低于50 ng (图6)。为避免基质植入后引发宿主免疫反应，残留的DNA片段长度还应小于200个碱基对 (图7)。为验证上述结果，苏木精-伊红染色应在心室及室间隔代表性切片中显示无细胞核染色 (图8)。Masson三色染色可进一步证实心肌纤维束的消失以及胶原网络结构的保留 (图9)。
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讨论
本研究描述了一种对猪心脏进行一致且高效脱细胞的方法。该方案基于先前发表的报告1进行了改进，包括延长灌注时间和提高压力，从而获得更可重复的结果。所得的脱细胞组织满足已发表文献中关于组织成功脱细胞的所有标准2。通过频繁更换溶液以限制细胞成分重新进入组织，并尽量缩短每种脱细胞试剂的作用时间，以减少对细胞外基质（ECM）的不利影响。在方案的初始阶段，逐步提高灌注速率以对组织进行预适应，从而在后续阶段实现更高的流速。若不在早期阶段对组织进行预适应，心脏血管系统可能发生破裂，导致无法继续灌注。本方案因其高效性而被采用，但并未声称其优于其他方案。理论上可调整脱细胞试剂的确切组成和灌注速率，以获得具有更优机械或生物学特性的方案，但向心脏递送试剂的基本原则仍然适用。
心脏天然三维结构的保存归因于脱细胞化方案中实施的多个步骤。首先，组织在到达后被修剪并冷冻。冷冻促进了细胞裂解，并有助于为后续灌注循环预处理组织。组织需仔细检查是否存在切割损伤，并确保主动脉瓣上方保留至少2厘米完整无损的主动脉。若心包或心外膜有任何破损，则弃用该器官，因为灌注液无法到达心脏下游区.......
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披露
在本研究进行期间，Gilbert 博士曾担任 ACell, Inc. 的科学顾问委员会成员，近期已出任该公司研发副总裁。ACell, Inc. 销售尿路膀胱基质产品，但对本研究无任何商业利益关系。
致谢
作者谨此致谢 Brogan Guest、Michelle Weaver 和 Kristen Lippert。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R03EB009237，以及由国立生物医学成像与生物工程研究所（National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering）提供的 NIH 培训项目 T32EB001026-06 和 T32HL076124-05。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | D6750-500G | |
| 过氧乙酸 | Pfaltz 和 Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex 泵驱动器 | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex 管路 | Cole Parmer | 96400-18 | 18号 |
| 带刺减压接头 | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L烧杯 | Fisher Scientific | 02-540T |
参考文献
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med<....
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重印与许可
