本文描述了一种通过逆行灌注快速且完全去除完整猪心脏中细胞成分的方法。该方法可获得具有部位特异性的心脏细胞外基质支架，具有多种临床应用的潜力。
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本文内容
摘要
摘要
基于灌注的全器官脱细胞技术近年来在组织工程领域受到关注，作为一种可创建部位特异性细胞外基质支架的方法，同时在很大程度上保留支架的天然结构。迄今为止，该方法已应用于多种器官系统，包括心脏、肺和肝脏1-5。以往针对缺乏易于接近的血管网络的组织所采用的脱细胞方法，主要依赖于将组织长时间暴露于去污剂、酸或酶处理溶液中，以去除细胞和细胞核成分6-8。然而，这些方法的有效性取决于溶液通过扩散渗透组织的能力。相比之下，通过天然血管系统进行器官灌注可有效缩短扩散距离，促进脱细胞试剂进入组织，并将细胞成分从组织中运出。本文中，我们描述了一种通过冠状动脉逆行灌注完全脱细胞化完整猪心脏的方法。该方案获得了一个完全脱细胞的心脏细胞外基质（c-ECM）支架，其心脏的三维结构保持完整。我们的方法结合使用了一系列酶、去污剂和酸，并辅以高渗和低渗冲洗，以促进细胞裂解和清除。该方案首先使用胰蛋白酶溶液使细胞从基质上脱离，随后使用Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液帮助去除细胞物质。所述方案还采用了长时间高于2 L/min的灌注速度。高流速结合溶液更换，可确保试剂有效输送至组织，避免细胞碎片污染，并实现组织的有效冲洗。该方法清除了天然猪心脏组织中的全部细胞核物质，构建出一种部位特异性的心脏ECM支架，可用于多种应用。
方案
1. 组织制备与实验设置
- 从屠宰场或研究机构在实施安乐死后立即采集猪器官，并冲洗掉多余的血液。修剪心脏上的多余脂肪和组织，保留心房和主动脉的完整性。修剪脂肪以分离肺动脉与主动脉。若组织存在任何切口，应妥善弃用。
- 将每颗心脏单独用防冻纸包裹，并将所有组织置于 -80 °C 超低温冰箱中至少保存 24 小时，以确保完全冻结。
- 当准备使用时（通常在3个月内），将一颗完整的冷冻猪心脏置于4 L烧杯中，浸没于Ⅰ型水中，在4 °C条件下过夜解冻。
- 心脏完全解冻后，用纸巾吸干表面水分，称量心脏重量并记录。市售体重猪的心脏重量应约为375–450 g。
- 将Masterflex 18号管连接至¼"带齿减径接头的一端。将带齿减径接头及管路插入主动脉内，在无名动脉干下方稍处位置，用两个软管夹或扎带固定主动脉。减径接头和管路必须保持在主动脉瓣上方，以便灌注冠状动脉 （图1）。
- 使用30或60 ml注射器将Ⅰ型水注入管路中。将管路置于Masterflex滚压泵的泵头内，大致位于其中点位置。将管路的进液端浸入装有2.5 L水的4 L烧杯底部，并固定管路。
- 将心脏放入盛水的烧杯中，启动泵进行引水以排除气泡。若观察到气泡从管路插入主动脉的部位逸出，则可能需要重新调整主动脉位置或增加扎带固定。在脱细胞过程中，保持气密性密封对维持足够压力至关重要 （图2）。
- 将含有3 L 0.2% 胰蛋白酶/0.05% EDTA/0.05% NaN3 溶液的4 L烧杯置于磁力搅拌器上，加热至37 °C，以准备脱细胞处理。
2. 组织清洗
- 将泵的流速设置为 400 ml/min，并确保选择正确的管路尺寸。用 I 型水灌流心脏 15–25 分钟。启动泵后，心脏应出现肿胀，并从心室中流出血液。每 5–10 分钟或根据从心脏中清除的血量情况，及时更换新鲜溶液。若血液未从心脏中流出，应根据需要调整管路和夹具。
- 停止泵运行，将心脏转移至另一装有 2× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）的烧杯中。待管路浸入溶液后，启动泵并将流速提高至 700 ml/min。心脏需在溶液中保留 15 分钟，每 5 分钟更换一次溶液。每次更换溶液时，需暂时停止泵运行，将组织和管路转移至新的烧杯中。
- 将心脏转移至 I 型水中处理 10 分钟，并将流速提高至 750 ml/min。
3. 脱细胞化与溶液灌注
- 将心脏转移至含有0.2%胰蛋白酶/0.05% EDTA/0.05% NaN3的烧杯中，置于37 °C条件下。将泵速提高至1,200 ml/min并启动泵。将搅拌子置于烧杯底部，以促进烧杯内溶液循环。心脏需在37 °C的0.2%胰蛋白酶/0.05% EDTA/0.05% NaN3溶液中孵育共三小时。1小时后，将泵速增至1,500 ml/min；再过1小时后，将泵速进一步增至1,800 ml/min。通过逐步提高灌注速度，使组织逐渐适应，防止血管破裂。在此步骤中，心脏会逐渐肿胀，体积几乎增加一倍。组织将失去其天然颜色，颜色变化从心房向心尖方向逐步扩展 (图3)。
- 每次溶液灌注后，需进行两步清洗，以去除细胞碎片、化学残留物并促进细胞裂解。每步清洗包括在I型水中冲洗10分钟，随后在室温下用2X PBS溶液冲洗10分钟。每次清洗均需将原烧杯中的溶液移除，加入清洗液，并使灌注液在盛有浸没心脏的烧杯内循环。在完成0.2%胰蛋白酶/0.05% EDTA/0.05% NaN3溶液灌注后，以1,900 ml/min的速度灌注水，然后以1,950 ml/min的速度灌注2X PBS。
- 将心脏转移至室温下的3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3溶液中。将泵速提高至2,000 ml/min，并灌注溶液1小时。将烧杯中的溶液移除，更换为新鲜溶液，将泵速提高至2,100 ml/min，再灌注新鲜溶液1.5小时，使在3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3溶液中的总时间达到2.5小时。
- 以2,150 ml/min的速度用I型水冲洗组织10分钟，随后以2,180 ml/min的速度用2X PBS冲洗10分钟。
- 将心脏转移至室温下的4%脱氧胆酸钠溶液中。将泵速提高至2,200 ml/min，并灌注溶液3小时。
- 以2,200 ml/min的速度分别用I型水和2X PBS各冲洗15分钟，每种溶液在5–10分钟后更换一次。上述灌注步骤可分多天进行：完成两次清洗后，将连接导管的心脏在4 °C条件下过夜保存于浸没在I型水中的容器中。
- 次日，以750 ml/min的速度用I型水冲洗5分钟，随后以1,500 ml/min的速度用1X PBS冲洗5分钟。之后可按照规定流速在相应溶液中继续执行后续实验步骤。
4. 消毒与最终处理
- 将心脏转移至0.1%过氧乙酸/4%乙醇溶液中，在2,200 ml/min流速下灌注1.5小时。
- 所有组织终末冲洗步骤均在2,200 ml/min流速下进行。先以1× PBS灌注组织15分钟，随后用I型水洗涤两次，每次5分钟。此系列冲洗步骤需再重复一次，以完成溶液灌注程序。
- 关闭泵，将心脏从溶液中取出并进行引流。剪断主动脉上的结扎线，移除所有导管，并将心脏置于空烧杯中引流1小时。在此期间需定期排出多余液体。将心脏置于吸水垫上，使其充分引流 (图4)。
- 在大部分水分去除后，记录心脏细胞外基质（C-ECM）的重量。在脱细胞过程中，心脏重量预计会减少约20–25%。
- 分离右心室、左心室以及室间隔，用于DNA定量和组织学处理，以确认组织脱细胞的彻底性 (图5)。
- 在冷冻干燥前，将C-ECM于-80 °C冷冻至少2小时。
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结果
脱细胞处理对完整猪心脏的影响因心脏大小、压力和血管排列的差异而自然存在变化。因此，所获得的细胞外基质支架的具体组成在不同心脏之间并不完全相同。完成所述方案后，心脏将呈现白色或半透明状，表明细胞成分已被去除。然而，目前普遍认为，组织是否达到“脱细胞化”应基于若干更定量的参数综合判断8。成功的脱细胞化方案所获得的基质，其每毫克组织中的双链DNA含量应低于50 ng (图6)。为避免基质植入后引发宿主免疫反应，残留的DNA片段长度还应小于200个碱基对 (图7)。为验证上述结果，苏木精-伊红染色应在心室及室间隔代表性切片中显示无细胞核染色 (图8)。Masson三色染色可进一步证实心肌纤维束的消失以及胶原网络结构的保留 (图9)。
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讨论
本研究描述了一种对猪心脏进行一致且高效脱细胞的方法。该方案基于先前发表的报告1进行了改进，包括延长灌注时间和提高压力，从而获得更可重复的结果。所得的脱细胞组织满足已发表文献中关于组织成功脱细胞的所有标准2。通过频繁更换溶液以限制细胞成分重新进入组织，并尽量缩短每种脱细胞试剂的作用时间，以减少对细胞外基质（ECM）的不利影响。在方案的初始阶段，逐步提高灌注速率以对组织进行预适应，从而在后续阶段实现更高的流速。若不在早期阶段对组织进行预适应，心脏血管系统可能发生破裂，导致无法继续灌注。本方案因其高效性而被采用，但并未声称其优于其他方案。理论上可调整脱细胞试剂的确切组成和灌注速率，以获得具有更优机械或生物学特性的方案，但向心脏递送试剂的基本原则仍然适用。
心脏天然三维结构的保存归因于脱细胞化方案中实施的多个步骤。首先，组织在到达后被修剪并冷冻。冷冻促进了细胞裂解，并有助于为后续灌注循环预处理组织。组织需仔细检查是否存在切割损伤，并确保主动脉瓣上方保留至少2厘米完整无损的主动脉。若心包或心外膜有任何破损，则弃用该器官，因为灌注液无法到达心脏下游区...
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披露
在本研究进行期间，Gilbert 博士曾担任 ACell, Inc. 的科学顾问委员会成员，近期已出任该公司研发副总裁。ACell, Inc. 销售尿路膀胱基质产品，但对本研究无任何商业利益关系。
致谢
作者谨此致谢 Brogan Guest、Michelle Weaver 和 Kristen Lippert。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R03EB009237，以及由国立生物医学成像与生物工程研究所（National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering）提供的 NIH 培训项目 T32EB001026-06 和 T32HL076124-05。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | D6750-500G | |
| 过氧乙酸 | Pfaltz 和 Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex 泵驱动器 | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex 管路 | Cole Parmer | 96400-18 | 18号 |
| 带刺减压接头 | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L烧杯 | Fisher Scientific | 02-540T |
参考文献
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重印与许可
