我们正在介绍一种用于检测血管通透性的体内实验方法。该方法基于静脉注射染料，随后观察其向间质空间的扩散情况。
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本文内容
摘要
摘要
该方法基于在小鼠这一实验动物模型中进行伊文思蓝的静脉注射。伊文思蓝是一种可与白蛋白结合的染料。在生理条件下，血管内皮对白蛋白具有不透性，因此与白蛋白结合的伊文思蓝被限制在血管内部。在某些促进血管通透性增加的病理条件下，内皮细胞部分失去紧密连接，导致内皮层对白蛋白等小分子蛋白质变得可透。这种情况使得伊文思蓝渗出至周围组织。健康的内皮可防止染料向邻近血管化组织的外渗。与内皮完整的器官相比，通透性升高的器官会表现出显著增强的蓝色着色。血管通透性水平可通过肉眼观察，或通过定量测定对照组与实验组动物/组织每毫克组织中所摄取染料的量来进行评估。该检测方法的两个显著优势在于其操作简便性和可定量性。可通过将特定质量的组织在甲酰胺中孵育，从而将伊文思蓝从组织中提取出来。伊文思蓝的吸收峰最大值位于620 nm，最小值位于740 nm。利用伊文思蓝的标准曲线，可将光密度测量值转换为每毫克组织所捕获的染料毫克数。应采用统计学分析来评估血管通透性之间的显著差异。
引言
选择性通透屏障的形成与维持对于器官的正常发育和功能至关重要 1,2内皮细胞排列在血管腔表面，形成半透性屏障，在血液与所有器官间质空间之间的选择性物质运输中起关键作用。通过生长因子、细胞因子及其他应激相关分子的严格调控，细胞间紧密连接维持了适当的通透性屏障。 3内皮细胞屏障的破坏可导致通透性增加和血管渗漏。这些效应出现在多种疾病状态下，对其潜在分子信号机制的理解需要采用多学科方法。 4,5在本文中，我们描述了一种 体内 利用小鼠模型测量血管通透性的方法
我们所描述的实验，又称 Miles 实验，是一种用于检测血管通透性的成熟方法 体内该检测基于以下事实：在基础生理条件下，白蛋白不会穿过内皮屏障。将一种对白蛋白具有高亲和力的偶氮染料——伊文思蓝注入实验动物的血液循环中，在生理条件下，其应被限制在血管内部。当施加血管通透性刺激物（无论是局部还是全身给药）时，血管开始渗漏蛋白质，从而导致与白蛋白结合的伊文思蓝也随之渗出。这会使具有通透性血管的组织迅速呈现蓝色着色。
小鼠尾侧静脉染料注射的成功对于实验的良好结果至关重要。尾静脉注射技术需要大量练习，应在开始实验前熟练掌握。
血管通透性高度依赖于动物的年龄和体重，因此在比较不同小鼠品系时，必须确保小鼠或其他实验动物的出生日期和体重尽可能一致。影响内皮屏障通透性的其他因素包括环境条件，如温度、湿度，以及非常重要的小鼠操作过程中的应激。由于多种因素可能影响实验结果，建议实验至少重复三次，并进行统计学分析。
该实验可用于比较经基因修饰的小鼠以及具有不同遗传背景的小鼠的血管通透性。根据所调控基因的功能，可在有或无刺激物的条件下评估通透性。该实验也可用于检测不同化合物对血管通透性的影响。
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方案
1. 小鼠尾侧静脉内注射伊文思蓝
- 配制0.5%的伊文思蓝PBS无菌溶液。如有必要，通过滤膜除菌以去除未溶解的颗粒物质。
- 用注射器吸取200 μl伊文思蓝溶液，避免吸入可能进入注射器的气泡。
- 将8至12周龄的小鼠放入固定装置中，使动物无法自由活动，但可操作其尾部。
- 将小鼠固定装置侧放，使侧尾静脉清晰可见并朝上。
- 用非惯用手的拇指和食指夹住小鼠尾巴。
- 以10–15度角将针头（细针头，27–30号）斜面向上刺入侧尾静脉，并朝头部方向推进。保持针头和注射器与尾巴平行。
- 不要施加回拉压力以确认位置是否正确，以免导致静脉塌陷。
- 缓慢向小鼠尾静脉注射200 μl伊文思蓝溶液。
- 观察推注活塞时的顺畅程度，这是判断针头是否正确进入静脉的依据。
- 将小鼠放回笼中，并观察30分钟。
2. 器官采集及器官中伊文思蓝的提取
- 通过颈椎脱位处死小鼠。出于Miles实验的目的，推荐使用颈椎脱位法，因其可最大限度减少对血管通透性的显著干扰。应尽可能同时处死所有小鼠。每次操作应使用6只或更少的小鼠，因为死亡后不久血管通透性会增加。
- 将小鼠仰卧放置，并用针固定其四肢于白色板上。
- 切开腹腔和胸腔，暴露胸腔和腹腔器官。
- 拍摄具有代表性的照片以显示伊文思蓝外渗的差异。应将所有小鼠置于同一视野内，以确保各小鼠的光照条件一致。
- 采集目标器官并放入1.5 ml离心管中。
- 称量一个空管，并将天平归零。
- 转移组织样本并称重。对所有组织样本重复此步骤。可将组织风干以消除不同器官间水分含量的差异。
- 向每份组织样本管中加入500 μl甲酰胺。
- 将所有离心管置于55 °C水浴或加热块中，孵育24–48小时，以从组织中提取伊文思蓝。
3. 间质组织中伊文思蓝外渗的定量
- 离心甲酰胺/伊文思蓝混合液，以沉淀任何残留的组织碎片。
- 在610 nm处测定吸光度。以500 μl甲酰胺作为空白对照。
- 计算每毫克组织外渗的伊文思蓝含量（ng）。
- 将所有数据绘制成图表。
- 进行统计学分析以确定显著性差异。
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结果
我们采用体内通透性实验检测8至12周龄小鼠的血管渗漏情况。该实验适用于比较不同遗传背景动物之间，或经不同处理后同一品系小鼠的血管通透性差异。我们的结果显示，我们在实验室中构建的一种基因修饰小鼠品系，其内皮通透性高于野生型小鼠。这些变化在多种器官中均能在宏观水平上观察到（图1）。
我们能够通过分光光度法测定每克组织中捕获的伊文思蓝量，从而量化不同器官中血管通透性的差异。如图2所示，不同器官对通透性诱导信号的反应不同，因此表现出不同的染料蓄积情况。这也与不同组织中血管化程度的高低有关。
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讨论
血管通透性是反映血管状态的关键指标。研究表明，多种全身性疾病（包括糖尿病、高血压和自身免疫性疾病）均存在血管通透性增加的现象6,7,8。血管通透性增加已被证实由剪切应力、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子等生长因子，以及5-羟色胺、组胺和缓激肽等炎症介质介导9。水和小分子的外渗被认为通过内皮细胞之间的微小间隙进行。细胞间连接的强度由分子间的相互作用严格调控10。
在生理条件下，内皮对水和离子具有通透性，而对蛋白质则不透。因此，在无炎症刺激的情况下，白蛋白被限制在血液中，不会进入细胞外液。通过注射可与白蛋白结合的染料伊文思蓝，我们可以监测蛋白质从血液渗漏至间质组织的程度。
该检测方法的一种改进版本使用了荧光标记的微球。通过采用不同尺寸的微球或不同分子量的荧光标记葡聚糖（4–70 kDa），可更准确地评估内皮细胞损伤的程度。然而，这种方法失去了直接观察的便利性，需要对组织进行固定，并通过荧光显微镜成像，或使用荧光酶标仪进行检测。
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披露
作者无任何利益冲突或竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 R01CA142928 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 伊文思蓝（EVANS BLUE） | SIGMA | E2129 | |
| 甲酰胺（FORMAMIDE） | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2 M 磷酸盐缓冲液 1.5 M NaCl pH 7.4 | ||
| 仪器 | |||
| 分光光度计（SPECTROPHOTOMETER） | EPPENDORF | 952000006 | |
| 小鼠固定装置（MOUSE RESTRAINT DEVICE） | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| 注射器（SYRINGE） | BD | 309659 | |
| 针头（NEEDLES） | BD | 305106 | 针头的规格取决于动物的大小。 |
| 天平（BALANCE） | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
参考文献
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
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重印与许可
