生物质的使用限制金额高效的染色质免疫沉淀

Summary

我们描述了一个可靠的方法，使用的主要的T细胞染色质免疫沉淀。该方法是建立在标准的方法，但使用一组特定的条件和试剂，提高效率有限的数量的细胞。重要的是，在数据分析阶段的详细描述。

Abstract

染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种广泛使用的方法，用于确定不同的蛋白质与DNA的活细胞染色质的相互作用。的实例包括序列特异性DNA结合转录因子，组蛋白和其不同的修改状态，如RNA聚合酶和辅助因子，酶，DNA修复组件。尽管它的无处不在，有缺乏到最新的，详细的工作台上准备材料的准确的分析，使相互作用的定量度量方法。由于缺乏这方面的信息，并且，因为，像任何免疫沉淀的条件，必须重新优化的一组新的实验条件下，ChIP分析容易不准确或低定量的结果。

我们的协议是最终来自转录因子:DNA的相互作用^1,2开创性的工作，但影响与采用了多项改进VITY和再现性难以取得的细胞类型。该协议已经被成功地使用^3,4，都使用定量PCR，定量DNA浓缩，或使用以下协议的变体，一种半定量。

进行PCR扩增的材料，这种定量​​分析计算，并表示在测定中的一个限制因素。重要的控制及其他考虑因素包括使用的同种型匹配的抗体，以及评价的一个控制区域的基因组DNA，如预测由所研究的蛋白质（或预计不被束缚的间隔区不显示变化下本实验条件下）。此外，输入材料的每一个的ChIP样品的标准曲线是用来推导出在实验材料的绝对水平的富集。使用标准曲线，可以考虑到引物组之间的差异，无论它们被设计的仔细，效率也不同整个范围内的模板浓度为一个单一的引物组的分配办法。我们的协议是不同于其他^5-8中，我们广泛覆盖后，分析阶段。

Protocol

1。分离小鼠脾幼稚的CD4 T细胞

1. 牺牲了鼠标，以人道的方式，符合机构的动物护理和使用委员会（IACUC）协议。解剖脾，并将其放置在培养皿中含有10毫升含10％FBS的DMEM。
2. 粉碎使用磨砂两端的两个载玻片释放脾脾。细胞悬液转移15毫升锥形管中。
3. 通过离心收集细胞，在200×g离心（〜1,200 rpm下一个典型的转子直径的临床离心机）5分钟，在4℃下
4. 将细胞重新悬浮在2ml ACK缓冲液裂解红血细胞，在室温（RT）1分钟。加入8毫升与胎牛血清（FBS）的DMEM终止反应。
5. 收集细胞以200×g离心5分钟，在4℃下
6. 在5毫升含FBS重悬细胞和通过70微米网状过滤器（BD猎鹰，猫＃352350）。计数细胞，并继续孤立幼稚的CD4 T细胞CD4细胞分离试剂盒（美天旎，猫＃130-095-248）使用制造商的说明使用。收藏幼稚的CD4 + T细胞通过离心分离，在200×g离心5分钟，在4℃下在10毫升与胎牛血清（FBS）的DMEM培养液中重悬细胞。

2。染色质的制备

1. 至终浓度为1％的DMEM将细胞悬浮液加入37％的甲醛，并轻轻摇动15分钟，交联在RT（ 例如使用Nutator），DNA:蛋白质复合物。
2. 停止，加入1 M甘氨酸至终浓度为125 mM的交联。继续摇动5分钟，在室温。
3. 收集细胞以200×g离心5分钟，在4℃下
4. 洗细胞，重新悬浮于5毫升冰冷的PBS含蛋白酶抑制剂。在冰冷的PBS含蛋白酶抑制剂，共3次洗涤，并通过离心收集细胞，在4℃下
5. 重悬在1ml的细胞冰冷的细胞裂解液含有蛋白酶抑制剂。在冰上孵育15分钟。可以由一小等分的细胞重新悬浮在0.4％台盼蓝溶液（Sigma公司，年龄组＃T8154），用显微镜观察细胞裂解的效率。
6. 通过离心收集细胞核在200 XG（一般为〜1200转）5分钟，在4℃下小心弃上清。
7. 重悬在500μl的核含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中的原子核。在冰上孵育15分钟。
8. 超声细胞，使用一个Misonix的超声波清洗3,000，探头尺寸1.6毫米:输出电平，15秒连拍，在冰上的4倍。每个样品必须在1-2分钟，在冰上冷却，然后再次超声处理样品，以防止过热。过热会引起交叉链接的逆转。
9. 超声处理的染色质在16000×g离心（〜13,200 rpm，以微量离心）离心5分钟，在4℃下
10. 取20微升等分明确supernatant，加DNA上样染料，并检查通过超声处理的DNA通过电泳在2％琼脂糖凝胶（对于大多数应用超声处理的DNA的理想大小为200-500碱基对）。
11. 确定DNA的浓度用紫外分光光度计。设立染色质免疫沉淀反应，剪切染色质可以立即使用或储存于-80℃。通常情况下，我们取得2-3×10 ⁶纯化的CD4 T细胞每鼠7.5-10微克DNA。

3。染色质免疫沉淀（所有步骤必须在0-4°C）

1. 超声处理的染色质稀释的DNA浓度为5-10微克/毫升（总体积= 1毫升）中的ChIP与蛋白酶抑制剂的缓冲液稀释。
2. 减加入100μl（10％）作为输入。存放在冰上。
3. 分装450微升成两个1.7毫升离心管型对照（鼠或兔IgG）和抗体的标记。如果有多个相同的同种型的抗体的使用，一单一的同种型对照醇将足以进行这种分析。您将需要多个同型对照，如果使用不同的动物源或同型抗体。
4. 添加2-5微克的特异性抗体，这取决于所使用的抗体的特异性，或同种型对照的各管。
5. 摇动使用Nutator管在4℃下过夜，以允许染色质抗体复合物的形成。
6. 向上述混合物中加入25μl的G蛋白磁珠（1:1淤浆悬浮有孔玻璃珠），并允许岩石至少2小时，在4℃。从我们的供应商的有孔玻璃珠，可以直接使用。
7. 离心管放置磁性的立场上，让珠收集磁化侧。
8. 小心删除解决方案的愿望而不扰乱珠。
9. 加入低盐洗涤液1毫升，，并允许轻轻摇动5分钟一个nutator。收集珠使用磁性的立场和取出洗涤液。重复一次。
10. 高盐洗涤溶液中加入1毫升，并允许为5一个nutator分钟摇滚。收集珠使用磁性的立场和取出洗涤液。重复一次。
11. 氯化锂洗涤溶液中加入1毫升，并允许为5一个nutator分钟摇滚。收集珠使用磁性的立场和取出洗涤液。重复一次。 LiCl的使用提高与有孔玻璃珠的非特异性的染色质相互作用的有效去除。
12. 加入1毫升TE的解决方案，并允许为5一个nutator分钟摇滚。收集珠使用磁性的立场和取出洗涤液。
13. 从有孔玻璃珠，加入250微升的洗脱缓冲液洗脱DNA。在室温下摇动15分钟。吸出的洗脱液保存这种材料一个新的1.7 ml离心管。再重复一次，并结合双方的洗脱。丢弃的珠子。
14. 为了扭转交叉链接添加氯化钠5米至终浓度为0.3米和1微升的核糖核酸酶A（20米克/毫升）的洗脱下来的DNA。在步骤3.2中，保存到输入端，使该卷500微升的洗脱缓冲液中加入400μl。到输入端添加氯化钠0.3 M，1微升的核糖核酸酶A，10微升的0.5M EDTA，20微升的1M的Tris-HCl pH 6.5的蛋白酶K（20毫克/毫升）和1μl。
15. 孵育过夜管在65℃下，在干燥的加热块。为了避免蒸发的样品，密封管上放置一个重量，让他们打开。也可用于杂交炉。
16. 让冷却至RT管。加入1毫升100％乙醇中，孵育2小时过夜，在-80℃下沉淀DNA。
17. 离心管，以16,000×g 15分钟沉淀的DNA。洗涤DNA沉淀用70％乙醇和空气干燥的颗粒一次。 DNA沉淀重悬在100μl的高压灭菌蒸馏水。
18. 纯化DNA用QIAquick离心柱，在总体积为50μl的洗脱缓冲液洗脱。这DNA是准备用于PCR。

"> 4。制备PCR反应（所有步骤必须进行冰）

1. 收集所有的芯片和相应的输入样本的DNA样本。此外，收集所有的PCR试剂和引物进行有针对性的区域，以及一个控制区。使用"热启动"Taq DNA聚合酶。在此过程中，我们将使用的SYBR Green为基础的检测DNA扩增量化，如果有必要，可以用来但在盒子定量PCR试剂盒。
2. 进行连续稀释的DNA模板以生成标准曲线进行定量PCR分析:例如，在洗脱缓冲液中的10％，1％，0.1％和0.01％（在步骤3.18中的QIAquick离心柱）。的浓度范围，在此标准曲线模板集增量的ChIP富集的基础上预期的水平而有所不同，分配输入10μl的DNA样本的96 - 孔板的各孔中，猫＃T-3182-1（Genemate ），一式两份。
3. 免除10毫升芯片型对照DNA以及在各自的特异性抗体井，一式三份。
4. "大师"包含任一目标的引物或控制引物（引物各0.1微米终浓度）混合和分配到各井的10微升。例如，在下面的模板免除主混合井含有针对性的引物标记为绿色和红色标记，分配主控制引物组合成井。
5. 盖上的PCR板与光学塑料密封膜和离心500 XG在临床离心机（1200转），1分钟RT收集一切在井底。
6. 启动PCR反应。我们将使用的LightCycler 480 II（罗氏公司）经营的LightCycler 480SW 1.5软件运行在这个例子中的qPCR。

预孵育:1周期:95℃/ 5分钟。

放大:40-45周期:94°C / 5秒，60°C / 5秒，72°C/10秒（退火温度应为2-3°C小于熔化TEMPERATUR辰引物）。

熔解曲线:1个周期。

冷却方式:1个周期。

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

一

10％输入

10％输入

抗体亚型

具体

乙

1％的输入

1％的输入

抗体亚型

具体

Ç

0.1％的输入

0.1％的输入

抗体亚型

具体

ð

0.01％输入

0.01％输入

ë键

10％输入

10％输入

抗体亚型

具体

F

1％的输入

1％的输入

抗体亚型

具体

ĝ

0.1％的输入

0.1％的输入

抗体亚型

具体

ħ

0.01％输入

0.01％输入

绿色环保:使用针对性的区域引物。

红色:使用控制区域的引物。

5。分析

1. 计划的qPCR软件定量DNA的绝对数量。重要的是，使用的标准曲线内插未知的具体的和同种型的样品中的DNA量允许在样本中的浓度的范围内设置的所有引物的质量和效率的评价和匹配。此外，它也提供了铁道部E可靠方法_，CQ（C T _C P）值转换到最终相对倍浓缩的结果比usingΔΔCq和相关方法。
2. 进入采样编辑器和包含输入样本的各种稀释液（10％，1％，0.1％和0.01％）与标准曲线值的井马克。同时要注明井未知的芯片样品，PCR板奠定了完全一样。在使用相同的软件在其他的qPCR机，指定子集对应每对引物，标准曲线值和实验型对照样品相应的反应。
3. 在LightCycler软件，去子集编辑器和标记的子集，包括井与输入样本以及未知的芯片样品。未知样品的定量使用产生的，用于分析输入样本的已知浓度的标准曲线。在使用相同的软件在其他的qPCR机，候子集的对应元素onding每个引物对所有的反应。
4. PCR扩增完成后，"ABS Quant/2nd衍生最大"进行分析和选择的子集进行分析，并按下OK。在使用相同的软件在其他的qPCR机，CQ值转换的DNA量在每个子集。
5. 按"计算"，这将产生使用输入样本的已知浓度的标准曲线，将显示未知样品中存在的DNA的绝对量。
6. 如果剪切的DNA的质量是好的，并且，如果引物特异性结合的对象区域，PCR扩增效率应该是接近2。
7. 执行"以旧换新调用"相同的子集，如果有一个熔解曲线分析。单峰表示，只有一个特定的产品扩增。随着电泳PCR产物通过琼脂糖凝胶中的DNA梯状条带，扩增特定的DNA也可以进行测试。
8. 将数据导出为一个标签带分隔符的文本文件，它可以在Microsoft Excel中打开，作进一步的分析。
9. 使用Microsoft Excel中，划分的DNA量进行有针对性的引物特异性抗体同型对照。重复此步骤，为控制区引物。如果有多个相同的同种型的抗体被用于不同的免疫沉淀，标准化每个这些值与从相同的同种型对照。此外，如果使用的多个对象的引物对，DNA的数量从一个单一的控制引物对集应用于每个目标的归一化（ 图1和2）。的输出值表示在每个位置相对于非特异性抗体背景免疫沉淀的特异性抗体的免疫沉淀倍浓缩。
10. 倍浓缩（同型控制）控制区域的引物进行有针对性的引物获得富集相对于除以倍浓缩（同型对照）控制未绑定的区域（ 图1）。重要的是，请注意，因为与总输入的每个样品的DNA，产生标准曲线插值的每个上述的免疫沉淀实验值，从标准曲线已经归一化到，并表示为，则该部分的总输入由机器软件。
11. 如果用于免疫沉淀或洗涤的缓冲区的严格性太高，它是可能的鲁棒扩增样品与特异性抗体的免疫沉淀将被观察到，而从同种型对照的扩增将不会被观察到免疫沉淀的样品。在这样的情况下，最好是由特异性抗体的同种型对照的ChIP的ChIP为目标区域和未结合的区域中减去的金额。可以计算出相对富集，将未绑定的区域（ 图3）的差异进行有针对性的区域差异。

Results

染色质免疫沉淀（ChIP）提出的协议控制的差异，如果有的话，通过使用一个未绑定的基因组区域的引物对，放大DNA用于PCR的金额，因此作为"负荷控制"。在图3中所示的例子中，我们已经使用鼠标Actb的基因的编码区作为未结合的蛋白，小鼠IL2作为目标区域的启动子上的兴趣和转录因子NFAT结合位点的区域。另外，几个千碱基的区域的上游或下游已知有感兴趣的蛋白质没有约束力的目标区域内，可以选择用于此目的。当设计的目标区域的引物对的PCR产物，理想的大小是约100-200个碱基对。同样重要的是，计算验证不结合，这些引物在基因组中的其他地方。

相对富集的差异蛋白结合erent区域的基因组进行比较，如果一组相同的同种型对照和特异性抗体的选择。将取决于使用的抗体的特异性和亲和力的特定蛋白结合的DNA的量以及在相同的目标区域中的各种蛋白质富集。例如，相对富集的情况下进行组蛋白的芯片通常会返回一个更高的富集的值时相比，各种细胞信号响应可能与DNA结合的转录因子。如果抗体的特异性好，我们通常观察到2-10倍浓缩在未绑定控件区域（

Discussion

上述协议提供了一种可靠的方法准确地量化使用芯片的主要淋巴细胞DNA富集。在这个协议的鲁棒性的主要原因之一是列入生物复制。上述协议使用三个重复，这是独立计算的富集。然后平均的输出提供一定程度的富集和标准偏差计算提供一定程度的变异。对于每个样品，三个技术也进行消除变化的样品处理，PCR扩增等的技术重复的变化量通常远小于所观察到的不同的生物样品之间的复制。鲁棒性的第二个原因是包含多个技术控制，包括同种型匹配的对照抗体，使用一个标准的输入DNA曲线，使用的控制相对应的一种非特异性的基因组区域的扩增子。

上述方法的局限性。的方法患有稍差的空间分辨率的限制因素是通过超声处理的DNA片段的剪切。因此，该方法的分辨能力仅约500 bp的DNA。实验中，需要更高的分辨率，可利用微球菌核酸酶消化^8，或回收的片段的核酸外切酶消化（芯片-外^）9,10。此外，上述的ChIP制剂耦合到回收片段的高通量测序（ChIPseq，芯片起的^{ChIP-SEQ）11,12}代替定量PCR，产生一个取样的交叉点，这可能是不同...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
甲醛	Sigma	F-8775	储存在 RT
磷酸盐缓冲盐水	Hyclone	SH30256.01	储存在 4 度;C
蛋白酶抑制剂片	Roche	04693116001	Store at 4 °C
蛋白 G 磁珠	活性基序	101945	储存温度为 4 °C
RNase A （20 mg/ml）	EMD Millipore	556746	在 -20 °C 下储存;C
蛋白酶 K （20 mg/ml）	罗氏	03115879001	溶于 50 mM Tris-HCl、10 mM CaCl2，pH 8.0
铂 Taq DNA 聚合酶	Invitrogen	10966-034	储存温度为 -20 °C;C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	储存在 -20 °C
1 M 甘氨酸			储存在 RT
细胞裂解缓冲液（5 mM 管，pH 8.0;85 mM KCl;0.5% NP-40）			储存在 4 °C
细胞核裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1;10 mM EDTA;1% SDS）			储存在 RT
ChIP 稀释缓冲液（0.01% SDS;1.1% Triton X-100;1.2 mM EDTA;16.7 mM Tris pH 8.1;190 mM NaCl）			储存在 4 °;C
低盐洗涤缓冲液（0.1% SDS;1% Triton X-100;2 mM EDTA;20 mM Tris pH 8.1;150 mM NaCl）			在 4 ° 下储存;C
高盐洗涤缓冲液（0.1% SDS;1% Triton X-100;2 mM EDTA;20 mM Tris pH 8.1;600 mM NaCl）			储存在 4 °C
LiCl 洗涤缓冲液（0.25 M LiCl;1% NP-40;1% 脱氧胆酸钠;1 mM EDTA;10 mM Tris pH 8.0）			在 4 °C 下储存;C
TE 缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4,1 mM EDTA）			在 4 °C 下储存;C
洗脱缓冲液（1% SDS;0.1 M NaHCO3）			制备新鲜
5 M NaCl			储存在 RT
0.5 M EDTA			储存
RT 1 M Tris-HCl，pH 6.5			储存在 RT
特定试剂表
Clay Adams 品牌章动器	Becton Dickinson	型号：421105
磁力架	Promega	Z5342
Qiaquick PCR 纯化套件	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	型号：S3000
紫外分光光度计	NanoDrop Technologies	ND-1000
加热块	VWR	13259-030
旋转器	VWR	80085-692
冷冻台式离心机	Beckman Coulter	型号：Allegra X-12R
微量离心机	Eppendorf	5415 D
设备表