我们介绍一种使用原代T细胞进行染色质免疫沉淀的稳健方法。该方法基于标准流程，但采用了一套特定的条件和试剂，可提高对有限数量细胞的操作效率。尤为重要的是，本文详细描述了数据分析阶段的具体步骤。
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本文内容
摘要
摘要
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛使用的方法，用于确定活细胞染色质中不同蛋白质与DNA之间的相互作用。这些蛋白质包括序列特异性的DNA结合转录因子、组蛋白及其不同的修饰状态、RNA聚合酶等酶类及辅助因子，以及DNA修复相关组分。尽管该技术应用广泛，但目前仍缺乏针对实验材料制备和精确分析的最新且详细的实验方法，难以实现对相互作用进行准确定量。由于此类信息的缺失，加之与所有免疫沉淀实验类似，ChIP实验的条件需针对新的实验体系重新优化，因此该检测方法容易产生不准确或定量性差的结果。
本方案最终源于转录因子与DNA相互作用的开创性研究1,2，但针对难以获取的细胞类型，在灵敏度和可重复性方面进行了多项改进。该方案已成功应用3,4，既可通过qPCR定量DNA富集程度，也可采用下述方案的一种半定量变体。
这种对PCR扩增产物的定量分析通过计算方法完成，是该检测方法中的一个限制因素。重要的对照和其他注意事项包括使用同型匹配的抗体，以及对基因组DNA中的对照区域进行评估，例如选择一个预测不会被目标蛋白结合的基因间区域（或预期在实验条件下不会发生改变的区域）。此外，对每个ChIP样品的输入材料均需建立标准曲线，以确定实验样品中富集的绝对水平。使用标准曲线有助于校正引物组之间的差异（无论其设计多么严谨），以及单个引物组在不同模板浓度范围内扩增效率的差异。我们的实验方案与其他已有方案5-8的不同之处在于，我们对后续的分析阶段进行了更为全面的覆盖。
方案
1. 小鼠脾脏初始CD4 T细胞的分离
- 按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的协议，以人道方式处死小鼠。解剖取出脾脏，并置于含有10 ml DMEM（含10% FBS）的培养皿中。
- 使用两片载玻片的磨砂端轻轻碾压脾脏，以释放脾细胞。将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中。
- 在4 °C条件下，以200 × g（对于典型转子直径的临床离心机，约为1,200 rpm）离心5分钟，收集细胞。
- 用2 ml ACK缓冲液重悬细胞，室温（RT）裂解红细胞1分钟。加入8 ml含FBS的DMEM终止反应。
- 在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟，收集细胞。
- 用5 ml含FBS的DMEM重悬细胞，并通过70 μm细胞筛滤器（BD Falcon，货号# 352350）。计数细胞后，按照制造商说明书使用CD4分离试剂盒（Miltenyi，货号# 130-095-248）分离初始型CD4 T细胞。在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟收集初始型CD4 T细胞。用10 ml含FBS的DMEM重悬细胞。
2. 染色质的制备
- 向 DMEM 细胞悬液中加入 37% 甲醛，使其终浓度为 1%，并在室温下轻轻摇动（例如使用 Nutator）15 分钟，以交联 DNA:蛋白质复合物。
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结果
本文所展示的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案通过使用一对引物扩增基因组中未结合的区域，从而对PCR中使用的DNA量的差异进行校正，该区域可作为“上样对照”。在图3所示的示例中，我们选用小鼠Actb基因的编码区作为目标蛋白不结合的区域，而以小鼠Il2基因启动子上转录因子NFAT的结合位点作为目标区域。或者，也可选择距离目标区域数千碱基对上游或下游、已知无目标蛋白结合的区域作为对照。在设计目标区域的引物对时，理想的PCR产物大小约为100–200 bp。此外，还需通过计算机分析确认这些引物在基因组中其他位置无结合位点。
如果选用相同的一组同型对照抗体和特异性抗体，则可以比较蛋白质在基因组不同区域上的相对富集程度。同一目标区域上各种蛋白质的富集程度取决于所用抗体的特异性和亲和力，以及结合到DNA上的特异蛋白的含量。例如，组蛋白的染色质免疫沉淀（ChIP）实验通常会得到较高的富集值，而转录因子可能仅在响应多种细胞信号时才结合DNA，其富集值通常较低。如果抗体的特异性良好，我们通常会观察到相对于非结合对照区域有2至10倍.......
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讨论
上述方案提供了一种利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术从原代淋巴细胞中准确量化DNA富集的可靠方法。该方案具有可靠性的主要原因是包含了生物学重复。上述方案采用了三个生物学重复，分别独立计算其富集程度，然后对结果取平均值以获得富集水平，并计算标准差以评估变异性。对于每个样本，还进行了三次技术重复，以消除样本处理、PCR扩增等过程中的操作差异。技术重复之间的变异程度通常远小于不同生物学样本之间的变异。可靠性的第二个原因是设置了多种技术对照，包括同型匹配的对照抗体、标准输入DNA曲线，以及针对非特异性基因组区域的对照扩增子。
上述方法的局限性与通常使用染色质免疫沉淀（ChIP）时遇到的问题相似。该方法的空间分辨率相对较低，其限制因素在于超声处理对DNA片段的剪切作用。因此，该方法的分辨能力仅约为500 bp的DNA片段。对于需要更高分辨率的实验，可采用微球菌核酸酶消化法。8 ，或对回收片段进行外切核酸酶消化（ChIP-exo）9,10 此外，上述染色质免疫沉淀（ChIP）样品制备可与回收片段的高通量测序相结合（ChIP-seq、ChIP-seq .......
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致谢
本工作得到美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 CA141009 和 GM39067 的资助。我们感谢 E. Parnell 和 R. Yarrington 对文稿部分提出的修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲醛 | Sigma | F-8775 | 室温保存 |
| 磷酸盐缓冲液 | Hyclone | SH30256.01 | 4 °C 保存 |
| 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | 04693116001 | 4 °C 保存 |
| Protein G 磁珠 | Active Motif | 101945 | 4 °C 保存 |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | -20 °C 保存 |
| 蛋白酶K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | 溶于 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA 聚合酶 | Invitrogen | 10966-034 | -20 °C 保存 |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | -20 °C 保存 |
| 1 M 甘氨酸 | 室温保存 | ||
| 细胞裂解缓冲液 (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | 4 °C 保存 | ||
| 核裂解缓冲液 (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | 室温保存 | ||
| ChIP 稀释缓冲液 (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | 4 °C 保存 | ||
| 低盐洗涤缓冲液 (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | 4 °C 保存 | ||
| 高盐洗涤缓冲液 (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | 4 °C 保存 | ||
| LiCl 洗涤缓冲液 (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% 脱氧胆酸钠, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | 4 °C 保存 | ||
| TE 缓冲液 (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | 4 °C 保存 | ||
| 洗脱缓冲液 (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | 现配现用 | ||
| 5 M NaCl | 室温保存 | ||
| 0.5 M EDTA | 室温保存 | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | 室温保存 | ||
| 特异性试剂表 | |||
| Clay Adams 品牌旋转混合仪 | Becton Dickinson | 型号：421105 | |
| 磁力架 | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | 型号：S3000 | |
| 紫外分光光度计 | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| 加热金属块 | VWR | 13259-030 | |
| 旋转混合仪 | VWR | 80085-692 | |
| 台式制冷离心机 | Beckman Coulter | 型号：Allegra X-12R | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5415 D | |
| 仪器设备表 |
参考文献
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J.
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