哺乳动物细胞中内质网定位mRNA的可视化

摘要

本文介绍一种在哺乳动物组织培养细胞中可视化内质网相关mRNA的方法。该技术包括利用皂苷选择性通透细胞膜以去除胞质内容物，随后进行荧光标记 原位 杂交以检测总多聚(A) mRNA 或特定转录本。

摘要

在真核生物中，编码分泌蛋白和膜蛋白的大多数信使RNA（mRNAs）定位于内质网（ER）表面。然而，这些mRNAs的可视化具有挑战性，尤其当仅有部分mRNA与ER相关联，且其在该细胞器中的分布受到非靶向（non-targeted）mRNA干扰时更是如此。即 “游离”转录本。为了监测与内质网（ER）相关的mRNA，我们开发了一种方法：细胞经短时间暴露于皂苷（digitonin）提取液中，该处理可选择性地通透细胞质膜，从而去除细胞质内容物，同时保持内质网结构的完整性。当该方法与荧光技术联用时 原位 通过荧光原位杂交（FISH），可利用荧光显微镜清晰地观察到内质网（ER）结合的mRNA。根据本实验方案，可评估甚至定量分析总体多聚腺苷酸化（poly(A)）转录本或特定mRNA与内质网的结合程度。在此过程中，还可利用该检测方法探究mRNA与内质网相互作用的性质。

引言

在真核生物中，编码分泌蛋白和膜蛋白的mRNA可通过信号识别颗粒^1,2在翻译过程中共翻译地靶向内质网（ER），并在翻译期间通过核糖体与易位子之间的直接相互作用而保留在内质网上^3,4。然而，mRNA是否能够在不依赖核糖体或翻译的情况下被靶向并保留在内质网上，直到最近仍不清楚。以往的研究尝试利用细胞分级分离技术来探讨是否存在不依赖翻译的mRNA与内质网的结合。由于需要使用强烈的化学条件才能将核糖体从内质网来源的囊泡上解离，而这些条件可能会破坏潜在的脆弱的mRNA-内质网结合，因此这些研究结果尚无定论，既有支持^5-8也有反对^9,10核糖体非依赖性mRNA锚定至内质网的证据。

为解决这些问题，我们开发了一种分离和成像内质网结合mRNA的实验方案。该方法包括温和的提取处理，可有效去除细胞中所有细胞质内容物（包括非内质网结合的mRNA），同时保持内质网的形态及其所有相关分子的完整性。利用该方案，我们已证明一部分mRNA能够被靶向并独立于核糖体或翻译过程而稳定地定位于内质网上¹¹。

方案

1. 提取材料的准备

1. 细胞的制备
   1. 在实验前一天，将组织培养细胞接种于经酸处理的盖玻片上，至少培养一天。我们通常使用 COS-7 或 U2OS 细胞系，因为这两种细胞系能高效表达分泌蛋白，且内质网结构清晰。需要注意的是，为获得较高的提取效率，实验当天盖玻片上的细胞融合度不应超过 80%。
   2. 若需研究特定的外源 mRNA，可在接种细胞后一天，使用标准转染方法将含有目的基因的质粒转染入细胞。随后让细胞表达该 mRNA 至少 18 小时，再进行提取。
2. 用翻译抑制剂处理细胞
   1. 为检测完整核糖体对 mRNA 与内质网结合状态维持的影响，可使用干扰核糖体与 mRNA 结合的翻译抑制剂处理细胞¹¹。
   2. 翻译起始抑制剂，如高哈尔满廷（homoharringtonin, HHT）、帕卡霉素（pactamycin）或 2-(4-甲基-2,6-二硝基苯胺基)-N-甲基丙酰胺（MDMP），可阻止新的核糖体与转录本结合，同时允许已结合的核糖体完成翻译过程^12-14。由于哺乳动物细胞中大多数蛋白质的翻译速率约为每秒 5 个氨基酸，不受密码子使用频率或 mRNA 长度的影响¹⁵，因此经过 30 分钟处理后，理论上可使开放阅读框长达 27,000 个核苷酸（编码长达 9,000 个氨基酸的蛋白质）的 mRNA 上的核糖体完全脱离。
   3. 诸如嘌呤霉素（puromycin）等抑制剂可促使新生肽链提前释放，从而破坏多聚核糖体结构¹²。然而，要彻底解除经嘌呤霉素处理后的核糖体与 mRNA 的结合，还需在皂苷素（digitonin）提取缓冲液中加入镁离子螯合剂如 EDTA¹¹。
   4. 在本实验中，细胞在提取前需用 200 μM 嘌呤霉素、5 μM HHT 或对照培养基处理 30 分钟。
3. 皂苷素提取缓冲液的配制。为了在无游离（即 胞质中、非内质网结合）转录本干扰的情况下可视化定位于内质网的 mRNA，我们使用皂苷素对细胞进行选择性通透化处理。皂苷素（Sigma Aldrich）是一种类固醇糖苷，优先与 3β-羟基类固醇相互作用。在低浓度下，皂苷素可选择性地通透细胞质膜的部分区域，导致其“渗漏”¹⁶；相比之下，胆固醇含量较低的内质网膜和核膜则保持完整^16,17。
   1. 将皂苷素（Sigma Aldrich）粉末以 5% 质量/体积浓度溶于蒸馏水中，将该储存液分装成小份，保存于 -20 °C。据我们的经验，反复冻融会降低皂苷素溶液的活性。
   2. 使用无 RNase 的试剂配制 10x CHO 缓冲液储存液（工作浓度为 1x：115 mM KAc、25 mM HEPES pH 7.4、2.5 mM MgCl₂、2 mM EGTA 和 150 mM 蔗糖），储存于 -20 °C。通过将储存液用无 RNase 水稀释，可获得 1x CHO 缓冲液工作液，可保存于 4 °C。

2. 皂苷提取

1. 准备提取溶液
   1. 将带有平坦表面的加热块预热至 40 °C，并在提取过程中保持该温度。
   2. 为形成无 RNase 的平坦工作表面，用少量水润湿加热块，然后覆盖一张新的 Parafilm M（Bemis Company, Inc）。使用无 RNase 手套和 Kimwipes（VWR）将 Parafilm 膜与加热块之间的气泡抚平。
   3. 将 1x CHO 缓冲液置于水浴中孵育，使其升温至 37 °C。
   4. 使用 6 孔板清洗和固定细胞。每排 3 个孔用于一个盖玻片。向该排的前两个孔中各加入 2 ml 预热的 CHO 缓冲液；向最后一个孔中加入 2 ml 固定液（PBS + 4% 多聚甲醛（Electron Microscope Sciences））。此板可在 37 °C 培养箱中保存，直至细胞准备进行提取。
   5. 在使用前，用预热的 CHO 缓冲液将储存的皂苷溶液稀释至 0.025%，以制备皂苷提取液。再次注意，对于经嘌呤霉素处理的细胞，提取缓冲液中必须额外添加 20 mM EDTA，以有效解离核糖体¹¹。在提取前立即在覆盖 Parafilm 的加热块上放置 100 μl 的提取液液滴。
2. 皂苷提取与细胞固定
   1. 将细胞从 37 °C 培养箱中取出。
   2. 在提取过程中，使用珠宝镊子操作盖玻片。用镊子夹起盖玻片，依次浸入第一和第二孔中的 CHO 缓冲液，以洗去培养基。
   3. 用 Kimwipe 迅速吸去盖玻片背面多余的缓冲液，并立即将细胞面向下的盖玻片放置于提取液液滴上。
   4. 10 秒后，用镊子夹起盖玻片，并立即转移至含有 4% 多聚甲醛固定液的孔中，使细胞面向上。
   5. 让样品在室温下于固定液中孵育至少 15 分钟。
3. 未提取对照细胞的制备。为确定细胞质中 mRNA 的总量，建议制备一份未提取的对照样品。
   1. 盖玻片上的细胞按上述方法培养（见第 2.2 节），但跳过皂苷提取步骤（2.2.3）。
   2. 固定后，未提取的细胞需在 PBS + 0.1% Triton X-100 中于室温下透化 15 分钟。

3. FISH 染色

1. 设计荧光探针 原位 杂交
   1. 目的 mRNA 的初级序列通过 RNA 二级结构预测软件（如 RNAstructure 5.0¹⁸通过目视评估mRNA的折叠情况，以确定一个约50个核苷酸长度且无显著二级结构的区域。
   2. 该区域的反向互补链在探针5'端连接Alexa546荧光染料后合成（购自Integrated DNA Technologies）。
   3. 将探针用无RN酶的水稀释至100 μM的储存浓度，可保存于-20 °C。
2. 使用FISH探针进行染色
   1. 请注意，尽管经皂苷提取的细胞无需进一步透化，但在FISH染色前，将这些固定样本用2 ml 0.1% Triton X-100（溶于PBS）在室温下处理15分钟，有助于降低背景信号。
   2. 载玻片随后用 PBS 洗涤两次，以去除残留的多聚甲醛或 Triton X-100。
   3. 细胞随后用含25%至60%甲酰胺的1X柠檬酸钠缓冲液（150 mM NaCl 和 15 mM 柠檬酸钠）洗涤两次。通常，对于长度为50-60个核苷酸的特异性FISH探针，使用60%甲酰胺；而对于使用寡核苷酸(dT) FISH探针进行的poly(A) mRNA染色，则甲酰胺浓度降低至25%。
   4. 准备染色室时，将150 mm培养皿底部加水，并将一片Parafilm置于水面上。通过倒置培养皿的方式除去水分，使Parafilm贴附在培养皿底部。使用Kimwipe手动去除气泡。
   5. 对于每张待染色的盖玻片，用移液器吸取100 μl含有目标FISH探针的杂交液，滴加至染色盒中石蜡膜上。将FISH探针原液用含25%至60%甲酰胺的杂交缓冲液（1x SSC、100 mg/ml硫酸葡聚糖、1 mg/ml酵母tRNA、5 mM 钒核糖核苷复合物、25–60%甲酰胺）稀释至工作浓度0.2 μM。请注意，甲酰胺的用量应根据所用特定探针进行优化，其浓度应与SSC洗涤缓冲液中的浓度一致（见步骤3.3.3）。
   6. 将盖玻片细胞面朝下置于染色室的FISH溶液中，在37 °C湿化孵育箱（如组织培养孵箱）中孵育5-24小时。
3. 染色样品的洗涤与封片
   1. 为准备一个无RNase的清洗区域，将一片Parafilm铺在水平的平坦表面（如实验台）上。为确保Parafilm平整，可先将水平表面润湿，然后铺上Parafilm，并用Kimwipe手动去除任何气泡。
   2. 将染色盒从培养箱中取出，置于平坦水平的表面上。然后用移液器在每张盖玻片边缘附近加入约500 μl FISH洗涤缓冲液，使盖玻片漂浮。溶液将通过毛细作用被吸入盖玻片与Parafilm之间。
   3. 对于每张盖玻片，将1 ml洗涤缓冲液（1×SSC含25–60%甲酰胺，见步骤3.3.3）移液至Parafilm洗涤区域（见步骤3.4.1）。
   4. 用镊子将盖玻片从染色盒中取出，逐一置于洗涤缓冲液液滴中，室温孵育5分钟。重复洗涤过程3次。
   5. 载玻片用70%乙醇清洗，并用擦镜纸擦干。
   6. 每个盖玻片上滴加25 μl封片液（DAPI Fluoromount G，Southern Biotech）。请注意，该溶液含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），可对DNA进行染色，从而实现细胞核的可视化。
   7. 使用镊子和擦镜纸，将盖玻片背面擦干，并吸去多余的FISH洗涤缓冲液，注意避免样本干燥。随后将每张盖玻片有细胞的一面朝下，置于封片剂液滴上。
   8. 载玻片样品随后进行标记，并可在4 °C下保存。

4. 成像与定量分析

1. 成像
   1. 使用落射荧光显微镜对FISH染色后的细胞进行成像。通过在相应通道中观察到强烈的荧光信号，可将转染细胞与未转染细胞区分开来。理想情况下，每个采集的视野中还应包含一个未转染细胞，用于确定定量分析中的背景荧光水平。
   2. 对每个视野，分别采集FISH和DAPI通道的图像。此外，如果细胞共染了蛋白质标记物，则还需采集免疫荧光通道的图像。请注意，Digitonin提取也可用于可视化内质网结合的核糖体和蛋白质¹¹。
   3. 为了确保不同视野之间的荧光强度具有可比性，每个实验组中各通道的曝光时间应保持恒定。
   4. 同样，为了确保不同盖玻片上细胞间的荧光强度可比，应尽量减少落射荧光强度的日常波动或FISH信号的衰减，建议在同一次实验中完成所有盖玻片的成像。
2. 定量分析。为了量化定位于内质网上的mRNA含量，我们使用Nikon NIS Element软件，但也可使用其他图像分析软件，如ImageJ。
   1. 使用Nikon NIS ELEMENT图像分析工具，将细胞边缘和细胞核分别划定为独立的兴趣区域（ROIs）。
   2. 对每个ROI，记录其荧光强度（I_T表示全细胞强度，I_N表示核强度）和面积（A_T和A_N），并导出至Excel表格。
   3. 对每张图像，通过记录一个未转染细胞的荧光强度来确定背景荧光强度（I_B）。若分析的是poly(A) mRNA水平，则选择一个无细胞区域进行测定。
   4. 提取细胞中内质网（或未提取细胞中的细胞质）的总荧光量通过以下公式计算：
      [A_T][ I_T - I_B] - [A_N][ I_N - I_B]
   5. 核区荧光强度也可计算，并作为不同处理间的内参对照。由于细胞核不受Digitonin处理¹⁷或核糖体解聚¹¹的影响，因此各处理间核内mRNA的量应保持恒定。核荧光的计算公式如下：
      [A_N][ I_N - I_B]
   6. 细胞质中定位于内质网的mRNA百分比可通过以下方式计算：取30–40个经提取细胞的平均内质网荧光值（见4.2.4），除以30–40个未提取细胞的平均细胞质荧光值（同样见4.2.4）。关键在于，提取与未提取的细胞必须平行制备、染色和成像。

结果

为了确定与内质网（ER）相关的mRNA所占比例，我们对转染了含有胎盘碱性磷酸酶（ALPP）或细胞色素P450-8B1（CYP8B1）质粒的COS-7细胞进行了处理：一部分细胞先用皂苷提取再固定，另一部分则直接固定（见图1，比较“未提取对照”与“提取对照”）。在两组样本中定量分析了细胞核外的荧光信号，并据此计算出ER相关mRNA的比例（图2）。我们的数据明确显示，对于ALPP和CYP8B1这两种mRNA而言，约有60%的细胞质mRNA与内质网相关。由于这两种mRNA所编码的蛋白质均在内质网腔内进行加工，因此该结果与“此类mRNA在内质网表面进行翻译”的假说一致。

为了在核糖体解离后监测这些转录本与内质网（ER）的关联情况，将转染的COS-7细胞分别用对照培养基、嘌呤霉素或HHT处理30分钟，随后进行提取、固定，并使用针对每种mRNA的特异性荧光原位杂交（FISH）探针进行染色（代表性图像见图1...

讨论

mRNA通过与mRNA定位蛋白相互作用，被运输至细胞内不同亚细胞区域，这一现象广泛存在，对于蛋白质正确分选至其最终定位以及根据亚细胞区域的局部需求精细调控基因表达具有重要意义^19,20。

利用本文所述的检测方法，我们重新探讨了编码分泌蛋白的mRNA是否能够在有或无核糖体及翻译的情况下维持在内质网（ER）上的问题。事实上，我们发现这类mRNA中有一部分具有这种活性¹¹。例如，通过本提取方案，我们确定在对照处理的COS-7细胞中，ALPP 和 CYP8B1 mRNA均定位于内质网表面（图1-2）。然而，在用翻译抑制剂嘌呤霉素或HHT处理细胞后，只有ALPP mRNA（而非CYP8B1 mRNA）在缺乏功能性核糖体和翻译的情况下仍与内质网保持关联（图1, 3）。此外，我们先前还发现，在用嘌呤霉素处理的COS-7细胞中，ALPP mRNA仍与内质网保持关联¹¹。由于这些...