以人血红蛋白作为铁源培养Staphylococcus aureus

摘要

本文介绍了一种利用血红蛋白作为唯一可利用铁营养来源的Staphylococcus aureus生长实验方法。该实验可确定细菌因子在血红蛋白来源铁获取过程中的作用。

摘要

S. aureus 是一种致病性细菌，需要铁来执行重要的代谢功能并引发疾病。人体宿主内最丰富的铁储存形式是血红素，它是血红蛋白的辅因子。为了从血红蛋白中获取铁， S. aureus 利用一种称为铁调控表面决定簇（Isd）系统的复杂机制¹Isd 系统组分首先结合宿主血红蛋白，随后提取并导入血红素，最终在细菌胞质中将铁从血红素中释放出来^2,3。该通路已通过大量研究被解析 体外 研究^4-9此外，Isd系统在感染中的作用已在小鼠模型中多次得到证实。^8,10-14建立 Isd 系统在血红蛋白来源铁获取及细菌生长中所起作用的研究已被证明更具挑战性。以血红蛋白作为唯一铁源的生长实验常受到市售血红蛋白不稳定、培养基中游离铁污染以及铁螯合剂相关毒性的干扰。本文介绍一种可克服上述局限性的方法。高质量血红蛋白由新鲜血液制备，并储存于液氮中。纯化的血红蛋白被添加至去铁培养基中，以模拟病原体在脊椎动物宿主体内所遭遇的贫铁环境。通过铁饥饿处理 S. aureus 通过提供游离铁并补充一种经最小程度修饰的血红蛋白形式，我们诱导细菌生长，该生长完全依赖于细菌结合血红蛋白、提取血红素、将血红素穿过细菌细胞包膜并在细胞质中降解血红素的能力。该检测方法将有助于研究人员阐明细菌从血红蛋白/血红素获取铁的机制 S. aureus 以及可能的其他细菌病原体。

方案

1. 从新鲜血液中纯化血红蛋白

1. 采集添加抗凝剂的新鲜人血。在整个纯化过程中将血液置于冰上或 4 °C 保存。
2. 在 1,500 × g 条件下离心血液 20 分钟。红细胞（RBCs）将沉淀于管底。小心吸除上清液，并用冰预冷的 0.9%（w/v）NaCl 溶液轻柔重悬沉淀。重复离心和洗涤 3 次。
3. 将沉淀重悬于 1 体积的冰预冷 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液中。由于渗透压作用，这将导致红细胞裂解。加入甲苯至终浓度约 20%（v/v）。
4. 在 4 °C 下旋转孵育过夜。
5. 在 20,000 × g 条件下离心裂解液 1 小时。收集中间的溶血液组分，保留顶部的甲苯层和底部沉淀不扰动。使用长颈移液管收集中间层。
6. 通过 0.44 μm 注射式滤器过滤。若溶液含有颗粒物而无法过滤，则重复步骤 1.5。
7. 使用高效液相色谱阴离子交换柱（Varian, PL-SAX 1,000 Å 8 μm, 150 mm × 4.6 mm）纯化血红蛋白（Hb）。流动相 A 为 10 mM Tris-HCl（pH 8.0），流动相 B 为 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）+ 0.5 M NaCl。以 2.0 ml/min 流速在 2 分钟内执行 0%–100% 的 B 相梯度洗脱。通过吸收度（λ：410 nm 和 280 nm）监测洗脱过程。仅收集呈鲜红色且具有显著吸收峰的组分（图 1）。
8. 将洗脱液在磷酸盐缓冲液（PBS）中透析过夜，随后再继续透析数小时。通过 0.22 μm 注射式滤器过滤以实现无菌处理。
9. 为测定 Hb 浓度，使用 PBS 配制已知浓度的标准 Hb 溶液。通过将标准溶液（参见所用试剂表格）或样品溶液与 2× Drabkin 试剂（由粉末配制）按 1:1 比例混合来测定样品中 Hb 浓度。例如，在 96 孔板中混合 100 μl Hb 溶液与 100 μl 2× Drabkin 试剂。孵育 15 分钟后，在 540 nm 处测定吸光度。绘制标准曲线并据此确定样品中 Hb 浓度。典型产量为 5–15 mg/ml。
10. 取 15–20 μg 纯化的血红蛋白，在 15% SDS-PAGE 凝胶上进行双份电泳。染色其中一块凝胶；将另一块凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并进行血红蛋白免疫印迹检测（图 2）。
11. 将 1 ml 血红蛋白分装液在液氮中速冻并储存。

2. 铁耗尽培养基的制备

1. 通过将RPMI粉末溶解于水中，按制造商建议加入碳酸氢钠和1%（w/v）的酪蛋白氨基酸（CA），配制RPMI培养基。使用0.2 μm滤器过滤除菌，冷藏保存。
2. 通过加入7%（w/v）Chelex 100并置于搅拌器上过夜混合，制备去金属RPMI（NRPMI）。用0.2 μm滤器过滤去除Chelex 100，冷藏保存。补充培养基中必需的非铁金属：预先配制无菌1,000倍浓缩液，包括25 μM ZnCl₂、25 μM MnCl₂、100 mM CaCl₂和1 mM MgCl₂。此步骤使用一次性塑料容器，以避免可重复使用器皿带来的铁污染。

3. 以血红蛋白作为唯一铁源培养Staphylococcus aureus

1. 从冻存菌种中将S. aureus划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板进行分离培养。在37 °C下孵育20-24小时。
2. 将乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯基乙酸)（EDDHA）重悬于无水乙醇中，配制成100 mM溶液。EDDHA不会完全溶解，但可通过乙醇实现灭菌。
3. 将EDDHA加入RPMI培养基中，使其终浓度为0.5 mM。在进行下一步操作前，需让EDDHA至少溶解30分钟。由于不同批次之间存在差异，可能需要将EDDHA终浓度降低至0.25 mM，以允许细菌正常生长。
4. 挑取单个S. aureus菌落接种至含有EDDHA的5 ml RPMI培养基中，置于15 ml螺口锥形管内。在37 °C、180转/分钟（rpm）振荡条件下孵育16-20小时。
5. 将过夜培养物在7,500 × g条件下离心5分钟，弃上清后用含0.5 mM EDDHA的NRPMI培养基重悬菌体沉淀。调节菌液OD₆₀₀至约3。
6. 配制含有每毫升2.5 μg血红蛋白（Hb）和0.1-1.0 mM EDDHA的NRPMI培养基。由于不同批次间的差异，螯合NRPMI中游离铁所需的EDDHA浓度可能会有所变化。
7. 取第3.5步中的细菌悬液10 μl，转接至含EDDHA和Hb的1 ml NRPMI培养基中，置于15 ml螺口锥形管内。
8. 将培养物在37 °C下孵育最多48小时，同时以180 rpm振荡或使用滚轴仪进行培养。
9. 每隔6-12小时，取50 μl培养物与150 μl PBS混合于96孔板中，测定OD₆₀₀值。

结果

我们通过高效液相色谱法（HPLC）从溶血液中纯化了人血红蛋白（实验方案步骤 1.7）。图1展示了在 280 和 410 nm 波长下洗脱液的吸光度记录。收集第 5 馏分，其余馏分弃去。通常每毫升洗脱液可获得 5 至 15 毫克的血红蛋白产量。纯化的血红蛋白通过 SDS-PAGE 进行重复分析，凝胶或进行蛋白质染色，或转移至硝酸纤维素膜并进行免疫印迹（实验方案步骤 1.10，图2）。

我们评估了纯化的人血红蛋白支持野生型S. aureus和缺乏Isd系统IsdB组分的S. aureus（ΔisdB）生长的能力。IsdB是一种血红蛋白受体，对于血红蛋白来源的铁获取至关重要¹²。根据方案第3节所述，在添加人血红蛋白的缺铁培养基（NRPMI + EDDHA + Hb）中培养野生型和ΔisdB菌株。在NRPMI + EDDHA + Hb培养基中生长时，野生型菌株能够增殖，表现为培养物的光密度随时间增加，而ΔisdB...

讨论

铁是所有生命领域生物体所需的一种必需营养素¹⁵在脊椎动物中，铁元素会被隔离以避免其毒性作用。这种隔离作用还会在一种称为营养免疫的过程中，使入侵的微生物无法获取铁元素。¹⁶作为应对，病原体已进化出多种策略以规避营养免疫。其中一种机制依赖于血红蛋白，后者是宿主内最丰富的铁来源。¹⁷血红蛋白存在于红细胞内。红细胞受损后释放的血红蛋白会被宿主结合珠蛋白（haptoglobin）结合，形成的结合珠蛋白-血红蛋白复合物可被巨噬细胞迅速清除。¹⁸为了获得血红蛋白， S. aureus 表达溶血素，可裂解红细胞¹⁹血红蛋白结合珠蛋白诱导的血红蛋白清除作用被细胞表面受体对血红蛋白的高亲和力结合所抵消 金黄色葡萄球菌。S. aureus 从血红蛋白的肽组分中提取血红素，并通过细胞壁蛋白向膜蛋白传递的方式将血红素转运至细胞质。在细胞质中，血红素被加氧酶降解以释放游离铁，或作为完整分子被用于电子传递链²⁰.

大量研究已证实 Isd 系统在感...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高效液相色谱阴离子交换柱	Varian	PL1551-3802
Drabkin 试剂	Sigma	D5941-6VL
血红蛋白标准品	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI 培养基	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 钠型	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
血红蛋白 a 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
胰蛋白胨大豆琼脂	BD	236920