我们介绍一种活细胞成像方法，可揭示T细胞活化过程中蛋白质的动态变化。我们展示了T细胞铺展实验、共聚焦显微镜与成像分析相结合的使用方法，以获得定量结果，用于追踪T细胞活化全过程中的信号复合物形成。
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本文内容
摘要
摘要
对传染病的防护由免疫系统介导1,2。T淋巴细胞是免疫系统的中枢协调者，调控多种免疫细胞的活化与应答3,4。T细胞的活化依赖于其对由抗原呈递细胞（APC）所展示的特异性抗原的识别。T细胞抗原受体（TCR）在每个T细胞克隆中具有特异性，并决定抗原识别的特异性5。TCR与抗原结合后，会诱导TCR复合物组分的磷酸化。为了促进T细胞活化，该信号必须从细胞膜传导至细胞质和细胞核，从而启动一系列关键反应，包括信号蛋白在TCR与APC接触部位（即免疫突触）的募集、分子活化、细胞骨架重排、胞内钙离子浓度升高以及基因表达的改变6,7。激活信号的正确起始与终止对于T细胞产生适当应答至关重要。信号蛋白的活性依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的形成与解除、翻译后修饰（如蛋白质磷酸化）、蛋白质复合物的形成、蛋白质泛素化以及蛋白质向细胞内不同位点的募集8。深入理解T细胞活化过程的内在机制，对于免疫学研究和临床应用均具有重要意义。
为了研究蛋白质-蛋白质相互作用，已开发出多种检测方法；然而，诸如广泛使用的共免疫沉淀法等生化检测无法分辨蛋白质的定位，从而阻碍了对细胞机制动态过程的深入观察。此外，这些群体性检测通常会混合来自许多不同细胞的蛋白质，而这些细胞可能处于所研究细胞过程的不同阶段，这会对时间分辨率产生不利影响。利用活细胞实时成像技术，既可以实现对蛋白质空间位置的追踪，又能够区分信号事件的时间顺序，从而揭示该过程的动态特征9,10。本文介绍一种在T细胞活化过程中对信号复合物形成进行实时成像的方法。将编码目的蛋白与单体荧光蛋白融合的质粒转染至原代T细胞或Jurkat等T细胞系中，以避免非生理性的寡聚化11。将活的T细胞滴加到预先包被有T细胞激活抗体的盖玻片上8,9，该抗体可结合CD3/TCR复合物，诱导T细胞活化，且无需特异性激活抗原。利用共聚焦显微镜对活化的细胞进行持续成像。通过分析成像数据，获得信号蛋白的共定位系数等定量结果。
方案
1. T细胞转染
- 通过将试剂盒中的“补充液”加入Nucleofector溶液中，配制活化的Amaxa Nucleofector溶液。活化后的溶液可在4 °C保存最多三个月。
- 在培养基中培养Jurkat T细胞 [RPMI中含10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素溶液和2 mM L-谷氨酰胺]。最佳情况下，细胞应在解冻后1-2周内使用。使用处于对数生长期的细胞对于实现高转染效率和细胞存活至关重要。此外，经过少量修改，本方案也可用于原代T细胞，如先前所述8。需要强调的是，由于原代T细胞的活化过程比Jurkat T细胞更长（约30分钟），在整个活化过程中必须使用显微镜载物台培养系统以维持CO2浓度、湿度和温度。
- 每项转染实验收集5 × 106个对数生长期的T细胞至15 ml离心管中。
- 室温下以400 × g离心7分钟。
- 离心期间，准备一块6孔板。每项转染实验向一个孔中加入5 ml培养基，并在37 °C预孵育。
- 从离心机中取出离心管，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1 ml RPMI培养基中。
- 室温下以400 × g再次离心7分钟。
- 离心期间，配制转染溶液。在96孔板的一个孔中，将步骤1中制备的100 μl活化Amaxa Nucleofector溶液与5 μg编码荧光标记蛋白的目的质粒DNA混合。为避免稀释转染....
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结果
我们展示了活体T细胞成像与分析的一个实例。在成像实验之前，使用流式细胞术（FACS）分析SLP76缺陷型T细胞（J14），以确定荧光蛋白的表达情况（图1）。将转染了标记信号蛋白mCFP-Nck和SLP76-mYFP的T细胞置于活化载玻片上，在T细胞铺展过程中进行成像（图2）。所采集的图像展示了蛋白质在活化和铺展全过程中的定位动态（图3）。计算机化的图像处理从可视化细胞中提供了新的见解和定量信息，同时最大限度地减少了人为偏差。为了研究两种蛋白在整个细胞活化过程中的共定位情况，我们使用了Imaris软件（Bitplane AG, Zurich Switzerland）的共定位分析工具。通过比较不同时间点成像细胞之间的共定位系数，我们确定Nck与SLP76在T细胞活化过程中共定位程度无显著变化（p > 0.3）（图4）。
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讨论
多种细胞过程的调控与功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的形成与终止。显微成像技术能够对活细胞中荧光标记的蛋白质进行实时追踪。标记蛋白质的共定位可能提示这些蛋白质之间存在直接或间接的相互作用，并可用于加强免疫共沉淀等生物化学方法所获得的结果。与生物化学方法不同，活细胞成像能够在空间和时间维度上观察蛋白质间的相互作用，从而便于在生理过程发生时对其进行监测，并揭示蛋白质在细胞内的分布情况。目前已开发出多种用于共定位定量分析的工具，其中皮尔逊相关系数（Pearson's correlation coefficient）仍是一种极具吸引力且广泛可用的两种蛋白质共定位程度的量化方法12。荧光共振能量转移（FRET）实验虽可检测蛋白质间近距离（10 nm）相互作用，但该方法需要专门的设备条件（仪器及荧光标记的兼容性）以及复杂的数据处理流程。在大多数应用中，共定位分析结合生物化学方法，构成了一种简便、直接的随时间观察蛋白质-蛋白质相互作用的方法。
在进行共定位分析时，为分析的像素设定荧光强度阈值，并忽略任一通道中低于该强度阈值的像素，对于实现准确且灵敏的分析至关重要。目前常用.......
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披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
作者感谢 Sophia Fried 提供的技术支持。MBS 感谢以下机构对本研究的资助：以色列科学基金会（资助编号 1659/08、971/08、1503/08 和 491/10），卫生部与科学部（资助编号 3-4114 和 3-6540），以色列癌症协会（通过已故 Alexander Smidoda 先生遗产捐赠），以及陶本布拉特家族基金会（生物医学卓越研究资助）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| Amaxa 人 T 细胞核转染试剂盒 | Lonza | VCA-1002 | |
| 抗 CD3 抗体（UCHT1 克隆） | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS 管 | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| 德国盖玻片系统 4 孔载片 | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| 潮霉素 | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P0781 | |
| 聚-L-赖氨酸 0.1% (w/v) 水溶液 | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| 仪器 | |||
| Accublock 数字干浴器 | Labnet | D1105A | |
| 离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| 可加热安装框 - 加热插件 P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S（用于可加热安装框） | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| 电穿孔仪 | Amaxa | Nucleofector I | |
| 荧光激活细胞分选仪 | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| 图像分析软件 | Bitplane | 7.0.0 |
参考文献
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C.
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重印与许可
