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方法文章

T细胞信号复合体形成的实时活体成像

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DOI：

10.3791/50076

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2013年6月23日

 ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种活细胞成像方法，可揭示T细胞活化过程中蛋白质的动态变化。我们展示了T细胞铺展实验、共聚焦显微镜与成像分析相结合的使用方法，以获得定量结果，用于追踪T细胞活化全过程中的信号复合物形成。

摘要

对传染病的防护由免疫系统介导1,2。T淋巴细胞是免疫系统的中枢协调者，调控多种免疫细胞的活化与应答3,4。T细胞的活化依赖于其对由抗原呈递细胞（APC）所展示的特异性抗原的识别。T细胞抗原受体（TCR）在每个T细胞克隆中具有特异性，并决定抗原识别的特异性5。TCR与抗原结合后，会诱导TCR复合物组分的磷酸化。为了促进T细胞活化，该信号必须从细胞膜传导至细胞质和细胞核，从而启动一系列关键反应，包括信号蛋白在TCR与APC接触部位（即免疫突触）的募集、分子活化、细胞骨架重排、胞内钙离子浓度升高以及基因表达的改变6,7。激活信号的正确起始与终止对于T细胞产生适当应答至关重要。信号蛋白的活性依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的形成与解除、翻译后修饰（如蛋白质磷酸化）、蛋白质复合物的形成、蛋白质泛素化以及蛋白质向细胞内不同位点的募集8。深入理解T细胞活化过程的内在机制，对于免疫学研究和临床应用均具有重要意义。

为了研究蛋白质-蛋白质相互作用，已开发出多种检测方法；然而，诸如广泛使用的共免疫沉淀法等生化检测无法分辨蛋白质的定位，从而阻碍了对细胞机制动态过程的深入观察。此外，这些群体性检测通常会混合来自许多不同细胞的蛋白质，而这些细胞可能处于所研究细胞过程的不同阶段，这会对时间分辨率产生不利影响。利用活细胞实时成像技术，既可以实现对蛋白质空间位置的追踪，又能够区分信号事件的时间顺序，从而揭示该过程的动态特征9,10。本文介绍一种在T细胞活化过程中对信号复合物形成进行实时成像的方法。将编码目的蛋白与单体荧光蛋白融合的质粒转染至原代T细胞或Jurkat等T细胞系中，以避免非生理性的寡聚化11。将活的T细胞滴加到预先包被有T细胞激活抗体的盖玻片上8,9，该抗体可结合CD3/TCR复合物，诱导T细胞活化，且无需特异性激活抗原。利用共聚焦显微镜对活化的细胞进行持续成像。通过分析成像数据，获得信号蛋白的共定位系数等定量结果。

方案

1. T细胞转染

  1. 通过将试剂盒中的“补充液”加入Nucleofector溶液中，配制活化的Amaxa Nucleofector溶液。活化后的溶液可在4 °C保存最多三个月。
  2. 在培养基中培养Jurkat T细胞 [RPMI中含10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素溶液和2 mM L-谷氨酰胺]。最佳情况下，细胞应在解冻后1-2周内使用。使用处于对数生长期的细胞对于实现高转染效率和细胞存活至关重要。此外，经过少量修改，本方案也可用于原代T细胞，如先前所述8。需要强调的是，由于原代T细胞的活化过程比Jurkat T细胞更长（约30分钟），在整个活化过程中必须使用显微镜载物台培养系统以维持CO2浓度、湿度和温度。
  3. 每项转染实验收集5 × 106个对数生长期的T细胞至15 ml离心管中。
  4. 室温下以400 × g离心7分钟。
  5. 离心期间，准备一块6孔板。每项转染实验向一个孔中加入5 ml培养基，并在37 °C预孵育。
  6. 从离心机中取出离心管，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1 ml RPMI培养基中。
  7. 室温下以400 × g再次离心7分钟。
  8. 离心期间，配制转染溶液。在96孔板的一个孔中，将步骤1中制备的100 μl活化Amaxa Nucleofector溶液与5 μg编码荧光标记蛋白的目的质粒DNA混合。为避免稀释转染溶液，DNA浓度应大于1 μg/ml。
  9. 轻轻吹打混匀。
  10. 细胞离心结束后，小心吸除所有上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  11. 用移液器将DNA/转染混合液吹打两次。
  12. 将DNA/转染混合液加入细胞沉淀中。
  13. 将细胞转移至Amaxa电穿孔杯中。
  14. 将电穿孔杯插入Amaxa Nucleofector仪器中。
  15. 使用H-10 Amaxa转染程序进行电穿孔（适用于Jurkat细胞）或T-23程序（适用于原代T细胞）。
  16. 从培养箱中取出6孔板。
  17. 电穿孔后，使用巴斯德吸管小心将含有细胞悬液的上清液转移至6孔板中。可能会形成由细胞碎片组成的沉淀物，请避免转移该沉淀物。
  18. 将细胞在37 °C孵育24小时。
  19. 从每个孔中转移2.5 ml细胞悬液至新的孔中，并向每个孔中加入2.5 ml预热的培养基（如步骤2所述）。
  20. 72小时后，将细胞转移至无菌离心管中，室温下以400 × g离心7分钟。弃去上清液，替换为含有适用于所用质粒的哺乳动物细胞筛选抗生素的培养基（根据所用抗生素选择适当浓度；我们使用G418和/或潮霉素，浓度分别为1.3 mg/ml和/或0.2 mg/ml）。将细胞悬液接种至新的孔中继续培养。或者，细胞也可进行瞬时转染，并在转染后48小时进行成像。若要制备瞬时转染细胞，在步骤8中同时共转染两种质粒，正常继续至步骤20，然后直接跳至步骤23。请注意，在此情况下，细胞应立即使用，且其荧光强度通常呈异质性，不一定很强。
  21. 使用添加了适当筛选抗生素的培养基继续培养细胞。根据需要对细胞进行传代，并补充含抗生素的培养基。
  22. 两周后，通过FACS（荧光激活细胞分选）验证转染是否成功，步骤如下：
  23. 分别收集106个转染细胞、106个模拟转染细胞（阴性对照）以及106个已知稳定表达荧光标记蛋白的细胞。如果细胞被转染了不止一种荧光蛋白（见步骤27），应使用多个单一标记的细胞系作为阳性对照。
  24. 室温下以400 × g离心7分钟。
  25. 弃去上清液。将细胞重悬于500 μl FACS缓冲液中（不含Ca2+和Mg2+的PBS，含5% FCS和0.05%叠氮化钠）。
  26. 使用分析型FACS检测细胞荧光，将转染细胞的荧光信号与阴性和阳性对照进行比较。
  27. 若需用另一种荧光标记蛋白转染细胞，请使用已转染的细胞重复步骤3-26。
  28. 应选用荧光强度高的细胞。理想情况下，培养物中至少50%的细胞应具有强荧光。可通过FACS细胞分选提高细胞荧光强度。

任何其他标记蛋白必须与不同的荧光染料融合，并且编码在携带不同筛选抗生素抗性基因的质粒上。对于转染了多个质粒的细胞，筛选培养基应添加所有相应的抗生素。

2. T细胞铺展实验准备

  1. 使用 Lab-Tek II 德国盖玻片系统 4 孔板。注意勿意外刮伤孔内表面， 例如 使用移液器吸头时，注意在制备或使用过程中。
  2. 配制50 ml载玻片预处理溶液：取4.6 ml 12 M（37%）HCl，加入38.5 ml 100%乙醇和6.9 ml双蒸水。
  3. 向载玻片的每个腔室中加入 500 μl 载玻片预处理溶液。
  4. 室温孵育10分钟。
  5. 吸净腔室，使其完全干燥。
  6. 将未加盖的载玻片在 45 °C 下孵育 1 小时，直至完全干燥。
  7. 通过将0.1%的聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich）溶于双蒸水中，配制0.01%的聚-L-赖氨酸溶液。
  8. 向每个腔室中加入 500 μl。
  9. 室温孵育载玻片15分钟。
  10. 吸净各室，彻底干燥。
  11. 在45 °C下孵育3小时，直至完全干燥。
  12. 包被的载玻片可在室温下干燥保存数月。
  13. 制备激活抗体溶液。使用抗CD3抗体：HIT3a（BD Pharmingen，#555337）或UCHT1（BD Pharmingen，#555330），以10 μg/ml浓度溶于400 μl PBS中，每室使用此体积。该溶液应在载玻片制备前短时间内配制。
  14. 向每个腔室中加入400 μl激活抗体溶液。
  15. 在37 °C下孵育载玻片2小时，或更优方案为在4 °C下孵育过夜。
  16. 移除激活抗体溶液，并立即用 300 μl PBS 洗涤腔室两次。从此步骤开始，确保腔室始终充满缓冲液。
  17. 将装有 PBS 的载玻片置于 4 °C 保存。建议在 1 周内使用制备好的载玻片腔室。

3. T细胞激活与成像

  1. 配制成像缓冲液 [1.25 ml HEPES (1 M)、10 ml FCS、38.75 ml 不含酚红的 RPMI]。过滤后，成像缓冲液可在 4 °C 下保存。
  2. 启动 Zeiss LSM 510 Meta 显微镜。将显微镜可加热载物架预热至 37 °C。选择“专家模式”。
  3. 点击“采集”选项卡，并打开以下选项卡：激光器；显微镜；配置；扫描；时间序列。
  4. 激活所需激光器。为激发 mCFP 和 mYFP，将 Argon/2 激光器设置为“待机”5 分钟，然后设为“开启”。
  5. 如果此前已使用相同荧光染料进行过该活细胞成像实验，请打开相应的 LSM 文件，点击“重用”图标，并从第 9 步继续操作。否则从第 6 步继续。
  6. 使用适用于所用荧光蛋白激发和发射波长的滤光片定义通道。
  7. 在“扫描控制”窗口中，选择 Z 轴堆叠（Z stack）选项。
  8. 输入以下扫描参数：切片数量：5；间隔：0.5 μm；当前切片：3。
  9. 在显微镜附近准备一个预热至 37 °C 的 Accublock Digital Dry Bath（Labnet）。
  10. 将成像缓冲液预热至 37 °C。
  11. 通过吸除 PBS 并替换为 600 μl 预热的成像缓冲液，准备储存的载玻片。
  12. 将载玻片在 37 °C 下孵育。从第 13 步开始，至少孵育 15 分钟，期间保持载玻片在孵育器中。
  13. 收集 5 × 105 个转染的 T 细胞。
  14. 以 400 × g 离心 2 分钟。
  15. 弃去上清液。
  16. 用 1 ml 预热的成像缓冲液重悬细胞，并转移至 1.5 ml Eppendorf 管中。
  17. 将离心管置于 Accublock Digital Dry Bath 上。
  18. 从孵育器中取出预热的载玻片，并将其安装到预热的显微镜载物架上。
  19. 点击“VIS”图标。
  20. 混匀细胞悬液，并取出 1–2 μl。
  21. 将移液器吸头插入载玻片底部上方的成像缓冲液中。避免刮伤载玻片。
  22. 将细胞接种在物镜孔径范围内。
  23. 立即开始视觉追踪荧光细胞的下沉过程。选择在两个通道中均显示强荧光的细胞。
  24. 在细胞接触载玻片表面之前，启动 LSM 模式。
  25. 仅切换一个激发激光器。选择一个具有 DIC 通道的激光器。
  26. 将缩放倍数设为 1。点击“快速 XY”图标，再点击“停止”图标。使用裁剪工具，选择以细胞为中心的感兴趣区域（ROI）。
  27. 将缩放倍数设为 3。点击“快速 XY”图标，然后手动调节焦距以获得最佳细胞图像。点击“停止”图标。
  28. 切换所有所需的激发激光器。
  29. 点击“StartT”图标开始记录。对细胞整个铺展过程进行成像（通常为 5 分钟）。完成后，点击“停止”图标。
  30. 保存文件。
  31. 如需采集更多细胞，点击“VIS”图标。若仍有未接触载玻片底部的细胞，从第 23 步继续操作。避免对已经开始铺展过程的细胞进行成像。否则进入第 32 步。
  32. 若观察区域中细胞稀少，可添加另一份细胞样品（从第 20 步继续）。否则进入第 33 步。
  33. 如需采集更多细胞，移动载玻片，使物镜孔径上方区域无细胞。
  34. 添加另一份细胞样品（并从第 20 步继续）。
  35. 完成所有期望的成像后，打开一个已保存的 LSM 文件。
  36. 点击“Gallery”、“Time+Z”和“Subset”。
  37. 选择相关的时间范围和 Z 轴堆叠。
  38. 保存新文件。
  39. 对所有成像文件执行步骤 35–38。

4. 成像数据分析

  1. 使用 Imaris 软件（Bitplane AG，苏黎世，瑞士）打开 LSM 文件。
  2. 点击“Surpass”，然后点击“Image Processing”菜单，并选择“Swap Time and Z”。这将有助于正确裁剪图像。
  3. 点击“Edit”工具栏，并在下拉菜单中选择“Crop 3D”选项。裁剪图像以仅包含细胞周围的区域。建议裁剪一个以细胞为中心的 300 × 300 像素的正方形区域。请注意，细胞的形状和位置可能随时间发生变化。观察 t 轴，确保在所有时间点上细胞均位于裁剪区域内。
  4. 点击“Image Processing”菜单，并选择“Swap Time and Z”，以恢复图像原始的时间顺序。
  5. 在主工具栏上按下“Coloc”按钮，然后选择“Build Time Dep. Coloc”。Imaris 将自动计算每个通道在每个时间点的强度阈值。
  6. 通过选择“Channel Statistics”查看共定位分析结果。点击“Export”导出数据。
  7. 对每一张成像的细胞重复步骤 1 至 6。我们建议以这种方式分析至少 50 个细胞。
  8. 计算平均 Pearson 共定位系数及其标准误差或标准差。

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结果

我们展示了活体T细胞成像与分析的一个实例。在成像实验之前，使用流式细胞术（FACS）分析SLP76缺陷型T细胞（J14），以确定荧光蛋白的表达情况（图1）。将转染了标记信号蛋白mCFP-Nck和SLP76-mYFP的T细胞置于活化载玻片上，在T细胞铺展过程中进行成像（图2）。所采集的图像展示了蛋白质在活化和铺展全过程中的定位动态（图3）。计算机化的图像处理从可视化细胞中提供了新的见解和定量信息，同时最大限度地减少了人为偏差。为了研究两种蛋白在整个细胞活化过程中的共定位情况，我们使用了Imaris软件（Bitplane AG, Zurich Switzerland）的共定位分析工具。通过比较不同时间点成像细胞之间的共定位系数，我们确定Nck与SLP76在T细胞活化过程中共定位程度无显著变化（p > 0.3）（图4）。

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讨论

多种细胞过程的调控与功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的形成与终止。显微成像技术能够对活细胞中荧光标记的蛋白质进行实时追踪。标记蛋白质的共定位可能提示这些蛋白质之间存在直接或间接的相互作用，并可用于加强免疫共沉淀等生物化学方法所获得的结果。与生物化学方法不同，活细胞成像能够在空间和时间维度上观察蛋白质间的相互作用，从而便于在生理过程发生时对其进行监测，并揭示蛋白质在细胞内的分布情况。目前已开发出多种用于共定位定量分析的工具，其中皮尔逊相关系数（Pearson's correlation coefficient）仍是一种极具吸引力且广泛可用的两种蛋白质共定位程度的量化方法12。荧光共振能量转移（FRET）实验虽可检测蛋白质间近距离（10 nm）相互作用，但该方法需要专门的设备条件（仪器及荧光标记的兼容性）以及复杂的数据处理流程。在大多数应用中，共定位分析结合生物化学方法，构成了一种简便、直接的随时间观察蛋白质-蛋白质相互作用的方法。

在进行共定位分析时，为分析的像素设定荧光强度阈值，并忽略任一通道中低于该强度阈值的像素，对于实现准确且灵敏的分析至关重要。目前常用...

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披露

我们没有需要披露的利益冲突。

致谢

作者感谢 Sophia Fried 提供的技术支持。MBS 感谢以下机构对本研究的资助：以色列科学基金会（资助编号 1659/08、971/08、1503/08 和 491/10），卫生部与科学部（资助编号 3-4114 和 3-6540），以色列癌症协会（通过已故 Alexander Smidoda 先生遗产捐赠），以及陶本布拉特家族基金会（生物医学卓越研究资助）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料
Amaxa 人 T 细胞核转染试剂盒LonzaVCA-1002
抗 CD3 抗体（UCHT1 克隆）BioLegend300432
Falcon FACS 管Becton Dickinson352058
FCSHyCloneSV30160.03
G418Calbiochem345810
德国盖玻片系统 4 孔载片Lab-Tek II155382
HClBio Lab8410501
HepesBiological Industries03-025-1B
潮霉素EnzoALX-380-306
L-谷氨酰胺SigmaG7513
PBS (10X)SigmaD1408
青霉素-链霉素SigmaP0781
聚-L-赖氨酸 0.1% (w/v) 水溶液SigmaP8920
RPMISigmaR87589
叠氮化钠SigmaS2002
仪器
Accublock 数字干浴器LabnetD1105A
离心机EppendorfCentrifuge 5810 R
共聚焦显微镜ZeissLSM 510 Meta
可加热安装框 - 加热插件 P SPeCon130-800-031
TempModule S（用于可加热安装框）Zeiss411860-9010-000
电穿孔仪AmaxaNucleofector I
荧光激活细胞分选仪Becton DickinsonFACSVantage SE
图像分析软件Bitplane7.0.0

参考文献

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