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方法文章

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

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DOI：

10.3791/50079

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2013年1月19日

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , 2Centre of Chronic Immunodeficiency (CCI), University Medical Centre Freiburg, University of Freiburg

本文内容

摘要

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。

摘要

星形胶质细胞是哺乳动物大脑中数量丰富的细胞类型，但其分子和功能特性仍有许多有待阐明之处。体外星形胶质细胞培养系统可用于深入研究这些胶质细胞的生物学功能。本视频实验方案展示了如何通过分离和培养新生小鼠大脑皮层混合细胞来获得高纯度的星形胶质细胞。该方法基于在培养过程中去除存活的神经元，并将星形胶质细胞与少突胶质细胞和小胶质细胞（中枢神经系统中的三种主要胶质细胞群体）分离开来。培养初期的代表性图像展示了混合细胞群体的存在，并指出了星形胶质细胞达到汇合状态、应与小胶质细胞和少突胶质细胞分离的时间点。此外，我们通过免疫细胞化学染色检测了已确立及新近描述的星形胶质细胞标志物，以验证培养所得细胞的纯度及典型的星形胶质细胞形态。该培养系统可简便地用于获取高纯度的小鼠星形胶质细胞及其条件培养基，从而研究星形胶质细胞生物学的多个方面。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量极为丰富的细胞类型。在小鼠和大鼠的大脑皮层中，星形胶质细胞与神经元的比例为1:3，而在人类大脑皮层中，每个神经元对应约1.4个星形胶质细胞1。近年来，人们对星形胶质细胞功能的兴趣显著增加。星形胶质细胞的一个关键功能是为神经元提供结构和代谢支持2,3。新近发现的星形胶质细胞功能涵盖广泛，包括在发育过程中引导轴突和某些成神经细胞的迁移4-6，参与突触传递、突触强度调节以及神经环路的信息处理7-9，参与血脑屏障（BBB）的形成10及其完整性维持11-13，以及调节脑血管张力14。星形胶质细胞的另一重要特征是其对损伤的反应。在病理条件下，星形胶质细胞会转变为反应性状态，并进一步上调中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抑制性细胞外基质（ECM）蛋白的表达15,16。反应性星形胶质细胞通过形成胶质瘢痕，将损伤区域与健康组织分隔开来；该胶质瘢痕主要由星形胶质细胞分泌的硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）家族的ECM蛋白构成，这些蛋白是中枢神经系统损伤后抑制轴突再生的主要因素15-17。

星形胶质细胞在胚胎发育晚期和出生后早期由放射状胶质（RG）细胞产生。星形胶质细胞命运确定后，其前体细胞会迁移至最终位置，并开始终末分化过程。在体条件下，星形胶质细胞在出生后三到四周表现出成熟特征，这以其典型形态为标志18,19。一部分RG细胞转化为脑室下区的星形胶质细胞（B型细胞）。RG细胞和B型细胞分别在发育期和成年期发挥类似星形胶质细胞的神经干细胞（NSCs）功能。与星形胶质细胞类似，RG细胞和B型细胞也表达星形胶质细胞特异性的谷氨酸转运体（GLAST）、脑脂结合蛋白（BLBP）和GFAP，表明这些标志物不能专一地用于标记成年星形胶质细胞。与健康脑组织中不分裂的成年实质星形胶质细胞不同，RG细胞和B型细胞具有干细胞潜能，例如自我更新能力。星形胶质细胞功能失调已被认为与多种病理过程相关，包括阿尔茨海默病20,21、亨廷顿病22、帕金森病23、Rett综合征24和Alexander病25。此外，星形胶质细胞会对中枢神经系统的所有损伤产生反应，导致星形胶质细胞活化及星形胶质瘢痕的形成16,26。脑外伤或脊髓损伤后形成的星形胶质瘢痕被认为是阻碍神经元再生的主要屏障15。

建立可靠的方法以分离和维持纯化的细胞群体，对于我们理解神经系统至关重要。McCarthy 和 de Vellis 的开创性工作使研究者至今能够从新生大鼠组织中制备近乎纯的星形胶质细胞培养物27。利用该方法，人们对星形胶质细胞生物学已有了大量认识，本文以稍作修改的形式介绍该方法用于分离小鼠皮层星形胶质细胞。in vivo 研究的补充手段包括星形胶质细胞本身以及通过所述 in vitro 培养获得的条件培养基，这些工具对于进一步深入了解星形胶质细胞功能具有重要价值。

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方案

1. 混合皮层细胞的分离与接种

使用出生后第1至第4天的小鼠幼崽可进行混合皮层细胞的分离，以培养星形胶质细胞。为获得适当的星形胶质细胞密度，每T75组织培养瓶需使用4只小鼠幼崽的皮层组织。因此，以下实验方案中的体积均按4只小鼠幼崽的细胞制备量进行计算。

  1. 开始解剖操作前，将30 ml星形胶质细胞培养基（DMEM，高糖 + 10% 灭活胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素；见表格）预热至37 °C。在CO2培养箱中，用20 ml浓度为50 μg/ml的多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液（溶于细胞培养级水中）包被一个T75培养瓶，37 °C孵育1小时。
  2. 进行解剖操作时，准备好所有必需的试剂和材料。所需物品包括：手术剪、光滑精细镊子、平头镊、纸巾、废液袋、70%乙醇，以及两个置于冰上的解剖皿（直径3.5 cm），每个解剖皿中加入2 ml HBSS。
  3. 轻轻握住幼鼠头部和颈部，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀进行断头处死。
  4. 沿头皮从前向后做正中切口，暴露颅骨。
  5. 小心地从颈部向鼻部剪开颅骨。再进行两个附加切口以更好地暴露脑组织：第一个切口位于嗅球前方，第二个切口位于小脑下方，以使颅骨与颅底分离。
  6. 使用平头镊将颅骨瓣轻轻掀向两侧，取出脑组织并放入第一个盛有HBSS的解剖皿中。将解剖皿放回冰上，并继续采集其余3个脑组织。
  7. 后续解剖操作在体视显微镜下进行。首先使用精细解剖镊去除嗅球和小脑（图1B）。
  8. 为获取皮层组织，用精细镊夹住脑组织后端，沿半球间做正中切口，将第二把镊子插入切开的沟槽中，将板状的皮层结构从脑组织上剥离下来。
  9. 使用精细镊轻轻牵拉，将软脑膜从皮层半球上剥离（图1D'）。此步骤可避免脑膜细胞和成纤维细胞污染最终的星形胶质细胞培养物。将处理好的皮层半球转移至第二个盛有HBSS的解剖皿中，并放回冰上。依同样方法处理全部4个皮层。
  10. 最后，使用锋利刀片将每个皮层半球切成小块（约4至8次切割）。
  11. 在无菌条件下，将皮层组织块转移至一个50 ml Falcon离心管中，并加入HBSS至总体积为22.5 ml。
  12. 加入2.5 ml 2.5%胰蛋白酶溶液，混匀后于37 °C水浴中孵育30分钟。每隔10分钟轻轻摇动混合一次。
  13. 以300 × g离心5分钟，沉淀皮层组织块。
  14. 小心倾去上清液。为避免损失组织沉淀，可用移液器机械性保留沉淀。加入10 ml星形胶质细胞接种培养基，使用10 ml塑料移液管剧烈吹打20至30次，使组织块解离为单细胞悬液。用星形胶质细胞接种培养基调整终体积至20 ml。可通过血细胞计数板计数验证皮层组织是否已充分解离为单细胞。4只幼鼠皮层组织一次制备应可获得10–15 × 106个单细胞。
  15. 吸除T75培养瓶中的PDL溶液，接种单细胞悬液，并在CO2培养箱中37 °C孵育。

2. 获得富集的星形胶质细胞培养物

  1. 混合皮层细胞接种后第2天更换培养基，此后每3天更换一次培养基。
  2. 接种后7至8天，当星形胶质细胞达到汇合状态，小胶质细胞暴露于星形胶质细胞层表面或已从星形胶质细胞层脱落时（图2），将T75培养瓶置于摇床上，以180 rpm振荡30分钟，以去除小胶质细胞。弃去含有小胶质细胞的上清液；若需培养和研究小胶质细胞，可将上清液离心后接种培养28,29。
  3. 加入20 ml新鲜星形胶质细胞培养基，随后将培养瓶以240 rpm在摇床上振荡6小时，以去除少突胶质前体细胞（OPC）。由于部分OPC可能未完全从星形胶质细胞层脱落，需再用手剧烈振荡1分钟，以防止OPC污染。弃去上清液；若需培养OPC，可将上清液离心后接种培养29。
  4. 用PBS冲洗残留的汇合星形胶质细胞层两次，吸除PBS，加入5 ml胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C的CO2培养箱中孵育。每5分钟检查一次星形胶质细胞的脱落情况，并通过将培养瓶轻击手掌2-3次促进细胞脱落。
  5. 待星形胶质细胞完全脱落后，加入5 ml星形胶质细胞培养基终止消化，以180 × g离心5分钟，吸除上清液，加入40 ml新鲜星形胶质细胞接种培养基。一个T75培养瓶在首次传代后应可获得约1×106个细胞。将细胞接种至两个T75培养瓶中，在37 °C的CO2培养箱中培养，每2至3天更换一次培养基。
  6. 首次传代后12至14天，将星形胶质细胞以适当浓度接种，用于实验前24至48小时的准备。一个T75培养瓶在第二次传代后应可获得约1.5–2×106个细胞。

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结果

分离出完整的小鼠脑组织后（图1A），需去除小脑和嗅球（图1B）。将大脑皮层从脑干上剥离（图1C），并仔细去除单个皮层表面的脑膜（图1D'）（图1E）。脑膜可通过其动脉系统清晰辨认，若去除不完全，会导致最终星形胶质细胞培养物被脑膜细胞和成纤维细胞污染。

接种混合皮层细胞悬液后，部分星形胶质细胞在24小时内已贴附于培养瓶上（图2A）。然而，在培养的最初3至5天内，细胞培养上清液中仍含有细胞碎片和正在死亡的神经元（图2A-C），因为培养基环境更有利于胶质细胞的存活与生长。通常在分离混合皮层细胞后的第7天，当星形胶质细胞达到汇合状态且小胶质细胞暴露于星形胶质细胞层表面时，应通过震荡法将星形胶质细胞与小胶质细胞及少突胶质前体细胞（OPCs）分离（图2D）。首次传代后约2天，细胞呈现星形胶质细胞形态。此时星形胶质细胞密度较低，...

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讨论

本文所述方法基于从啮齿类动物新生脑组织中制备星形胶质细胞培养物的技术，该技术最初由 McCarthy 和 de Vellis 于 1980 年建立。 27. 本文所介绍的从出生后P1至P4天小鼠脑组织中分离和培养皮层星形胶质细胞的改良方法快速、可获得高纯度的原代星形胶质细胞，且具有高度可重复性。该技术可轻松拓展用于分离其他物种（如大鼠或猪）以及其他脑区（如脊髓）的星形胶质细胞。尽管采用McCarthy和deVellis方法从新生鼠脑中分离星形胶质前体细胞可获得高度增殖的细胞，但从出生后P1-P4天小鼠脑中分离的星形胶质细胞其增殖与传代能力有限。在培养7天后对星形胶质细胞进行一次传代 体外 （体外培养天数），它们将生长至汇合状态并成熟。 体内，大多数星形胶质细胞的增殖在出生后第14天（P14）基本完成 32建议在体外培养第21至28天（DIV）之间使用星形胶质细胞进行实验（图2F），以确保分离得到的星形胶质细胞具有成熟的表型。由于星形胶质细胞固有的增殖能力受限，培养过程中传代次数不应超过3次。

所述分离...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究得到Fazit基金会研究生奖学金（授予S.S.）、德国联邦教育与研究部（BMBF 01 EO 0803，授予K.B.）、欧盟第七框架计划资助项目PIRG08-GA-2010-276989 NEUREX以及德国研究基金会资助项目SCHA 1442/3-1（授予C.S.）的支持。作者声明无利益冲突。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>星形胶质细胞培养基
DMEM，高糖Life Technologies31966-021
FBS，热灭活Life Technologies10082-147终浓度：10%
青霉素-链霉素Life Technologies15140-122终浓度：1%
<强>脑组织消化液
HBSSLife Technologies14170-088
2.5% 胰蛋白酶Life Technologies15090-046终浓度：0.25%
<强>其他
70%（体积/体积）乙醇罗斯9065.2
聚-D-赖氨酸 MilliporeA-003-E50 μg/ml
水PAAS15-012细胞培养级
PBS聚丙烯酸H15-002细胞培养级
0.05% 胰蛋白酶-EDTA Life Technologies25300-062
0.45 μm 无菌滤器 赛多利斯16555
3.5 cm 培养皿BD Falcon353001
15 ml Falcon管BD Falcon352096
50 ml Falcon管BD Falcon352070
75 cm2 组织培养瓶BD Falcon353136
精细镊子 Dumont2-1032; 2-1033# 3c；# 5
镊子，平头KLS Martin12-120-11
13 cm 外科剪刀AesculapBC-140-R
体视显微镜LeicaMZ7.5
体视显微镜 + 相机LeicaMZ16F；DFC320
显微镜 + 相机蔡司；佳能Primo Vert；PowerShot A650 IS
离心Eppendorf5805000.017Centrifuge5804R
轨道摇床赛默飞世尔科技SHKE 4450-1CEMaxQ 4450
水浴锅JulaboSW20；37 °C

参考文献

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