小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

摘要

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。

摘要

星形胶质细胞是哺乳动物大脑中数量丰富的细胞类型，但其分子和功能特性仍有许多有待阐明之处。体外星形胶质细胞培养系统可用于深入研究这些胶质细胞的生物学功能。本视频实验方案展示了如何通过分离和培养新生小鼠大脑皮层混合细胞来获得高纯度的星形胶质细胞。该方法基于在培养过程中去除存活的神经元，并将星形胶质细胞与少突胶质细胞和小胶质细胞（中枢神经系统中的三种主要胶质细胞群体）分离开来。培养初期的代表性图像展示了混合细胞群体的存在，并指出了星形胶质细胞达到汇合状态、应与小胶质细胞和少突胶质细胞分离的时间点。此外，我们通过免疫细胞化学染色检测了已确立及新近描述的星形胶质细胞标志物，以验证培养所得细胞的纯度及典型的星形胶质细胞形态。该培养系统可简便地用于获取高纯度的小鼠星形胶质细胞及其条件培养基，从而研究星形胶质细胞生物学的多个方面。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量极为丰富的细胞类型。在小鼠和大鼠的大脑皮层中，星形胶质细胞与神经元的比例为1:3，而在人类大脑皮层中，每个神经元对应约1.4个星形胶质细胞¹。近年来，人们对星形胶质细胞功能的兴趣显著增加。星形胶质细胞的一个关键功能是为神经元提供结构和代谢支持^2,3。新近发现的星形胶质细胞功能涵盖广泛，包括在发育过程中引导轴突和某些成神经细胞的迁移^4-6，参与突触传递、突触强度调节以及神经环路的信息处理^7-9，参与血脑屏障（BBB）的形成¹⁰及其完整性维持^11-13，以及调节脑血管张力¹⁴。星形胶质细胞的另一重要特征是其对损伤的反应。在病理条件下，星形胶质细胞会转变为反应性状态，并进一步上调中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抑制性细胞外基质（ECM）蛋白的表达^15,16。反应性星形胶质细胞通过形成胶质瘢痕，将损伤区域与健康组织分隔开来；该胶质瘢痕主要由星形胶质细胞分泌的硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）家族的ECM蛋白构成，这些蛋白是中枢神经系统损伤后抑制轴突再生的主要因素^15-17。

星形胶质细胞在胚胎发育晚期和出生后早期由放射状胶质（RG）细胞产生。星形胶质细胞命运确定后，其前体细胞会迁移至最终位置，并开始终末分化过程。在体条件下，星形....

方案

1. 混合皮层细胞的分离与接种

使用出生后第1至第4天的小鼠幼崽可进行混合皮层细胞的分离，以培养星形胶质细胞。为获得适当的星形胶质细胞密度，每T75组织培养瓶需使用4只小鼠幼崽的皮层组织。因此，以下实验方案中的体积均按4只小鼠幼崽的细胞制备量进行计算。

1. 开始解剖操作前，将30 ml星形胶质细胞培养基（DMEM，高糖 + 10% 灭活胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素；见表格）预热至37 °C。在CO₂培养箱中，用20 ml浓度为50 μg/ml的多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液（溶于细胞培养级水中）包被一个T75培养瓶，37 °C孵育1小时。
2. 进行解剖操作时，准备好所有必需的试剂和材料。所需物品包括：手术剪、光滑精细镊子、平头镊、纸巾、废液袋、70%乙醇，以及两个置于冰上的解剖皿（直径3.5 cm），每个解剖皿中加入2 ml HBSS。
3. 轻轻握住幼鼠头部和颈部，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀进行断头处死。
4. 沿头皮从前向后做正中切口，暴露颅骨。
5. 小心地从颈部向鼻部剪开颅骨。再进行两个附加切口以更好地暴露脑组织：第一个切口位于嗅球前方，第二个切口位于小脑下方，以使颅骨与颅底分离。
6. 使用平头镊将颅骨瓣轻轻掀向两侧，取出脑组织并放入第一个盛有HBSS的解剖皿中。将解剖皿放回冰上，并继续采集其余3个脑组织。
7. 后续解剖操作在体视....

结果

分离出完整的小鼠脑组织后（图1A），需去除小脑和嗅球（图1B）。将大脑皮层从脑干上剥离（图1C），并仔细去除单个皮层表面的脑膜（图1D'）（图1E）。脑膜可通过其动脉系统清晰辨认，若去除不完全，会导致最终星形胶质细胞培养物被脑膜细胞和成纤维细胞污染。

接种混合皮层细胞悬液后，部分星形胶质细胞在24小时内已贴附于培养瓶上（图2A）。然而，在培养的最初3至5天内，细胞培养上清液中仍含有细胞碎片和正在死亡的神经元（图2A-C），因为培养基环境更有利于胶质细胞的存活与生长。通常在分离混合皮层细胞后的第7天，当星形胶质细胞达到汇合状态且小胶质细胞暴露于星形胶质细胞层表面时，应通过震荡法将星形胶质细胞与小胶质细胞及少突胶质前体细胞（OPCs）分离（图2D）。首次传代后约2天，细胞呈现星形胶质细胞形态。此时星形胶质细胞密度较低，.......

讨论

本文所述方法基于从啮齿类动物新生脑组织中制备星形胶质细胞培养物的技术，该技术最初由 McCarthy 和 de Vellis 于 1980 年建立。 ²⁷. 本文所介绍的从出生后P1至P4天小鼠脑组织中分离和培养皮层星形胶质细胞的改良方法快速、可获得高纯度的原代星形胶质细胞，且具有高度可重复性。该技术可轻松拓展用于分离其他物种（如大鼠或猪）以及其他脑区（如脊髓）的星形胶质细胞。尽管采用McCarthy和deVellis方法从新生鼠脑中分离星形胶质前体细胞可获得高度增殖的细胞，但从出生后P1-P4天小鼠脑中分离的星形胶质细胞其增殖与传代能力有限。在培养7天后对星形胶质细胞进行一次传代 体外 （体外培养天数），它们将生长至汇合状态并成熟。 体内，大多数星形胶质细胞的增殖在出生后第14天（P14）基本完成 ³²建议在体外培养第21至28天（DIV）之间使用星形胶质细胞进行实验（图2F），以确保分离得到的星形胶质细胞具有成熟的表型。由于星形胶质细胞固有的增殖能力受限，培养过程中传代次数不应超过3次。

所述分离.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>星形胶质细胞培养基
DMEM，高糖	Life Technologies	31966-021
FBS，热灭活	Life Technologies	10082-147	终浓度：10%
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122	终浓度：1%
<强>脑组织消化液
HBSS	Life Technologies	14170-088
2.5% 胰蛋白酶	Life Technologies	15090-046	终浓度：0.25%
<强>其他
70%（体积/体积）乙醇	罗斯	9065.2
聚-D-赖氨酸	Millipore	A-003-E	50 μg/ml
水	PAA	S15-012	细胞培养级
PBS	聚丙烯酸	H15-002	细胞培养级
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-062
0.45 μm 无菌滤器	赛多利斯	16555
3.5 cm 培养皿	BD Falcon	353001
15 ml Falcon管	BD Falcon	352096
50 ml Falcon管	BD Falcon	352070
75 cm2 组织培养瓶	BD Falcon	353136
精细镊子	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c；# 5
镊子，平头	KLS Martin	12-120-11
13 cm 外科剪刀	Aesculap	BC-140-R
体视显微镜	Leica		MZ7.5
体视显微镜 + 相机	Leica		MZ16F；DFC320
显微镜 + 相机	蔡司；佳能		Primo Vert；PowerShot A650 IS
离心	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
轨道摇床	赛默飞世尔科技	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
水浴锅	Julabo		SW20；37 °C