转基因小鼠或病毒载体已被用于增加肺组织内的蛋白表达。然而，这些技术耗时较长，技术难度较高，且存在脱靶效应，可能干扰实验结果。我们的蛋白转染方案采用基于脂质的转染试剂和超细雾化微喷器，可将活性蛋白均匀递送至肺细胞。
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摘要
摘要
提高蛋白质表达水平可使研究人员更深入地理解该蛋白质在调控关键生物学过程中的功能作用1。在肺组织中，这一目标通常通过基因手段实现，例如使用转基因小鼠2,3，或利用病毒及非病毒载体通过增强基因表达来提升蛋白质水平4。然而，转基因小鼠的制备成本高且耗时较长，外源基因的随机插入或长期持续表达可能干扰正常的肺发育，从而限制模型的应用价值5。尽管条件性转基因技术可避免长期基因表达带来的问题6，但用于实现条件性表达的反向四环素调控转录激活因子（rtTA）小鼠会出现自发性肺泡腔扩大现象7。与转基因模型类似，病毒和非病毒载体的使用同样成本较高8，并可能引发剂量依赖性的炎症反应，干扰实验结果9并抑制目标蛋白的表达10。此外，重复给药的效果会因机体对载体的免疫应答增强而受到限制11,12。目前，研究人员正在开发腺相关病毒（AAV）载体，这类载体引发的炎症反应较轻，并可在肺组织中实现更持久的表达13。
利用β-半乳糖苷酶，我们介绍一种通过直接蛋白转染技术快速有效地提高肺内蛋白表达的方法。该方案将固定量的纯化蛋白与20 μl基于脂质的转染试剂（Pro-Ject，Pierce Bio）混合，以促进其穿透肺组织。随后，通过气管将脂质体-蛋白混合物使用微雾化喷雾器（Penn Century，Philadelphia，PA）注入小鼠肺部。微雾化喷雾器可在整个肺内产生精细的液态气溶胶喷雾。利用该技术，我们已证明注射的蛋白可均匀沉积于小鼠的气道和肺泡中14。脂质转染技术可使用少量蛋白即达到效应，从而限制了高剂量蛋白给药可能引发的炎症反应。事实上，我们已发表的研究表明，利用该技术可显著提高肺组织中PP2A的活性，同时不影响支气管肺泡灌洗液中的细胞数量15。在刺激后24小时采集的肺灌洗液细胞数与对照组相当（对照组27±4 vs. 转染白蛋白组31±5；每组N=6）。此外，该方法可在不诱导肺发育改变或转基因模型中可能出现的肺结构改变的情况下提高蛋白水平。然而，由于需要重复给药，该技术在研究长期蛋白表达升高效应的研究中可能不具优势，对于半衰期较短的蛋白尤其如此。
方案
1. 蛋白转染试剂的制备
- 向含有干膜的试管中加入 250 μl 甲醇或氯仿，溶解 Pro-Ject 试剂。
- 涡旋振荡 10–20 秒，速度调至最高。
- 将 20 μl Pro-Ject 试剂分别移入不同的微量离心管中。
- 将含有 Pro-Ject 试剂的微量离心管置于室温下的层流罩中，蒸发溶剂至少 6 小时，确保完全干燥。或者，可使用真空干燥器干燥 Pro-Ject 试剂。
- 将试管储存于 -20 °C。在此温度下可稳定保存一年。
2. 将蛋白质加入Pro-Ject试剂
- 用移液器将含有2.0 μg目标蛋白的50 μl PBS加入含有20 μl干燥的Pro-Ject转染试剂的离心管中。
- 加入蛋白后，低速涡旋混匀3–5秒，然后在室温下孵育30分钟。
3. 蛋白质的气管内给药
- 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（100 mg/kg 和 10 mg/kg）使小鼠麻醉。
- 待小鼠进入镇静状态后，使用特制平台将其上切牙悬挂固定（图1）。
- 用镊子和回形针作为喉镜打开小鼠口咽部，以便插入导管（图2）。将光源置于小鼠气管处，以观察声带。
- 使用Penn Century Microsprayer通过气管注入蛋白/ProJect试剂混合液（50 μl）。
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结果
为了证明本技术的有效性，我们使用微喷雾器（Penn Century）向小鼠气管内注射含有20 μl Pro-Ject转染试剂的50 μl PBS溶液，该溶液中溶解了2 μg小鼠白蛋白（Sigma）。将白蛋白处理的小鼠与以相同方式处理但注射2 μg β-半乳糖苷酶蛋白（Pierce Bio）的小鼠进行比较。24小时后，处死小鼠并取肺组织进行组织学分析。对经白蛋白和β-半乳糖苷酶处理的小鼠的福尔马林固定肺组织切片进行β-半乳糖苷酶免疫组织化学染色。即使在蛋白转染24小时后，我们仍可在β-半乳糖苷酶处理小鼠的气道（大箭头）中检测到强烈的染色信号，而在白蛋白处理小鼠中则未见此信号（图3A和3B）。
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讨论
该技术相较于其他方法的优势在于，它能够直接在肺组织内部提高蛋白质水平和活性。此外，该技术可渗透至肺的最远端区域，而不仅局限于气道内。即使使用生理盐水灌洗气道后，我们仍能检测到注射物的蛋白质活性升高15。组织活性分析表明，该蛋白质已进入细胞内部，而不仅仅停留在小鼠肺部的气腔中。免疫组织化学结果进一步证实了这一点，显示注射的蛋白质在小鼠肺泡和气道中呈现弥散性染色（图3）。重要的是，该实验方案不会引发肺部炎症或蛋白酶的表达。因此，所观察到的任何变化均可归因于所给予蛋白质的作用。由于缺乏炎症反应，该方法可用于多次重复注射，以研究蛋白质在较长时间内的效应。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（7R01HL098528-03）和FAMRI临床创新者奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| 微型喷雾器 | Penn Century | FMJ-250 | |
| β-半乳糖苷酶 | Pierce Bio | 89850 | |
| β-半乳糖苷酶抗体 | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| 小鼠血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A3139 | |
| 氯胺酮/赛拉嗪 | Sigma Aldrich | K113 |
参考文献
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