介绍了一种利用斑马鱼原位肿瘤模型快速筛选黑色素瘤调控因子的方法。该方法利用miniCoopR载体，可在黑色素细胞中表达候选黑色素瘤基因。文中描述了获取无黑色素瘤生存曲线的方法、侵袭实验、鳞片黑色素细胞的抗体染色方案以及黑色素瘤移植实验。
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摘要
摘要
人类癌症的基因组学研究已提供了大量关于肿瘤中发生改变的基因的信息1,2,3这些研究面临的一个挑战在于，许多基因发生了改变，难以区分哪些基因改变是驱动肿瘤发生的，哪些是在转化过程中偶然出现的。为了做出这一区分，有必要采用一种能够定量测量基因改变对肿瘤起始以及其他促进肿瘤持续存在和扩散过程的影响的检测方法。本文介绍了一种利用同源性肿瘤模型在斑马鱼中快速筛选大量候选黑色素瘤修饰基因的方法。4 涵盖黑色素瘤起始与维持所需的各个步骤。该实验中的关键试剂是 miniCoopR 载体，其结合了一个野生型拷贝的 mitfa 黑色素细胞特化因子的Gateway重组盒，候选黑色素瘤基因可重组进入该盒5miniCoopR 载体具有 mitfa 包含野生型启动子、开放阅读框和3'-非翻译区的拯救型微型基因 mitfa 基因。它使我们能够利用候选黑色素瘤调控因子的全长开放阅读框构建表达载体。随后可将这些单个克隆注射到单细胞中 Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)斑马鱼胚胎。miniCoopR 载体通过 Tol2介导的转基因技术6 并挽救黑素细胞。由于它们在物理上与 mitfa 通过拯救微型基因，候选基因在被拯救的黑素细胞中表达，其中部分细胞将发生转化并发展为肿瘤。可利用无黑色素瘤生存曲线、侵袭实验、抗体染色及移植实验来评估候选基因对黑色素瘤启动及黑色素瘤细胞特性的影响。
方案
1. 黑色素瘤发病调控因子的筛选
- 通过PCR扩增目的基因（GOI）的全长开放阅读框，并利用BP Clonase II酶（Invitrogen）将其重组至pDONR 221载体中，构建Gateway中间入门克隆。使用Multisite Gateway技术（Invitrogen）将p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA6和miniCoopR5进行重组，使目的基因置于miniCoopR载体中的mitfa启动子下游（图1A）。
- 将每种克隆的25皮克与25皮克Tol2转座酶mRNA共同注射到单细胞期的Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)三重纯合斑马鱼胚胎中，操作方法如前所述7。将注射后的胚胎在28.5 °C条件下孵育。在24 hpf时移除死亡胚胎。
- 在72 hpf时，通过将含有注射胚胎的培养皿置于解剖显微镜下，在白色背景上使用透射光观察，筛选出黑色素细胞表型得到恢复的转基因个体（图1A）。
- 在4 dpf时，将筛选出的个体转移至斑马鱼饲养设施的育苗区3 L水箱中，操作方法如前所述8。
- 在2个月龄时，选择至....
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结果
将含有黑色素瘤癌基因 SETDB15 或 EGFP 的 miniCoopR 载体（均受 mitfa 启动子调控）显微注射到单细胞 Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf) 斑马鱼胚胎中。筛选出黑色素细胞恢复的胚胎并使其发育成熟。选取2月龄时黑色素细胞恢复面积大于4 mm2的个体。每周对动物进行黑色素瘤筛查。成年鱼的肿瘤发生率曲线显示，与 EGFP 对照组相比，SETDB1 癌基因显著加速了黑色素瘤的发生（图1）。选取肿瘤位于后脑后边界与背鳍前边界之间的个体（图2A）进行后续实验。在黑色素瘤发生两周后，将动物用4%多聚甲醛固定，切片并进行苏木精-伊红染色，以评估黑色素瘤向深层组织的侵袭情况。SETDB1 表达的黑色素瘤比 EGFP 对照组黑色素瘤具有更强的局部侵袭性（图2C）。为检测候选基因的表达，从野.......
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讨论
miniCoopR 方法能够在斑马鱼黑色素细胞中表达目的基因。该方法利用了斑马鱼mitfa基因具有细胞自主性这一特性。因此，通过 miniCoopR 载体挽救的黑色素细胞必定含有该微型基因以及与其物理连接的任何目的基因。被挽救的黑色素细胞清晰可见，并可在单细胞胚胎时期注射后获得的个体中观察到。通过选择特定程度的嵌合状态，可对超过该阈值的个体进行肿瘤发生或其他表型特征的评分。miniCoopR 方法的一个主要优势在于，无需为每个测试的目的基因建立稳定的转基因品系，即可快速识别并评分具有足够嵌合程度的个体。所节省的时间、人力和成本与待检测目的基因的数量成正比。
如先前报道5，基于miniCoopR的方法使我们能够筛选人类黑色素瘤中染色体1上反复扩增区域内的众多候选癌基因。其他染色体区段也可采用类似方法进行筛选。此外，该方法可用于在黑色素细胞中表达任意基因，并可监测这些细胞的任何特征。更广泛地说，将目的基因与拯救型微型基因耦合的原理可应用于其他组织类型。对于此类应用，需要有组织特异性的遗传突变体以及相应的细胞自主发挥作用的拯救基因。在斑马鱼及其他.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Leonard I. Zon博士，这些技术最初是在他的实验室中开发的；感谢Kristen Kwan和已故的Chi-Bin Chien惠赠本研究中使用的质粒；感谢James Lister和David Raible在抗体染色方面的协助；感谢James Neiswender提供显微注射视频。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R00AR056899-03支持，项目负责人为C.J.C。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Gateway 重组试剂 | Invitrogen | ||
| miniCoopR | 参考文献5 | ||
| Mitfa 抗体 | 参考文献5 | ||
| FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体 | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper 斑马鱼 | 参考文献9 | ||
| 701N 10 μl 注射器 | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM 滤膜 | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
参考文献
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M.,
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