简单和高效的睾丸细胞悬液的制备技术

摘要

睾丸细胞悬浮液从啮齿动物材料，避免酶和洗涤剂，机械制备一种新的协议进行说明。方法很简单，速度快，重复性好，并呈现良好的品质，这是适合流式分选和RNA提取的细胞悬液。

摘要

哺乳动物睾丸是非常复杂的器官，包含超过30种不同类型的细胞，包括体睾丸细胞和生殖细胞的不同阶段。这种异质性是一个重要的缺点，关于哺乳动物精子发生的研究的基础，作为纯的或富集的细胞群，在精子发育的某些阶段需要¹分子分析。

各种策略，如Staput离心淘洗^1，2,3，和流式细胞仪^{（FC）4,5，}为了使基因差异表达的研究已获得丰富或纯化睾丸细胞群。

它是必需的细胞是在悬浮液中大多数浓缩/净化方法。理想的情况下，将细胞悬浮液，将代表原始组织，具有高比例的活细胞和少数多核 - 这往往会形成，因为合胞性质的生精上皮^6,7 -和缺乏细胞团块。以前的报告已经证明，由一个专门的机械方法编制的睾丸细胞悬液成群更容易比胰酶消化^1。另一方面，酶的RNA酶处理的和/或分解的酶，如胰蛋白酶和胶原酶导致特定的大分子的降解，这是不希望的目标的下游应用。理想的过程中应尽可能短，涉及最少的操作，从而实现了良好的保存大分子的利益，如基因。目前的协议，从固体组织细胞悬液的制备通常费时，高度取决于运营商，并且可以选择性地破坏某些类型的细胞^1,8。

这里介绍的协议结合了高度重复性和极其短暂的机械分解的优势酶处理bsence，导致以良好的品质，可以用于流式细胞仪分析和分选^4，不可告人的基因表达研究^9的细胞悬浮液。

方案

1。细胞悬液的制备

1. IACUC或同等专业委员会（乌拉圭全国委员会动物实验的建议使用牺牲标本[CNEA）。在我们的情况下，过量的巴比妥给药。
2. 解剖睾丸标准批准程序后，将它们放置在一个96毫米的玻璃培养皿上冰，冰冷的DMEM含10毫升辅以10％胎牛血清。
3. 删除白膜和削减解封的睾丸，每侧的2 - 3毫米见方的小块。
4. 然后，这些碎片被处理在Medimachine，自动机械粉碎机组织里面含有穿孔的不锈钢屏幕和金属转子一次性单位分类。要做到这一点，将1毫升冷补充DMEM和4 - 5这些作品在一个50微米的可支配单位，开关disaggregator，和过程 50秒后，从制造商的简单说明。
5. 回收得到的细胞悬浮液从分解单元，使用3 - 5毫升注射器不带针。
6. 过滤50微米的尼龙网，用0.5毫升浸泡补充DMEM。
7. 再次过滤悬浮液浸泡25微米尼龙网，置于冰上。
8. 计数在纽鲍室，并调节细胞浓度为1 - 2×10 ⁷个细胞/ ml的DMEM培养液补充。至少为4×10 ⁷个细胞/克睾丸材料是通常获得。
9. 最后，添加NDA（2 - 萘酚-6,8 - 二磺酸二钾盐）至终浓度为0.2％，以防止细胞聚集。
10. 与市售的动物细胞的生存能力套件可选：检查睾丸细胞悬液的细胞活力，按照制造商的说明。

2。流式细胞仪分析

ve_content“>我们已经使用了流式细胞 - 迪金森FACSVantage流式细胞仪配备调谐发射波长为488 nm的用于分析的细胞与高浓度的碘化丙啶（PI）染色与相干的氩离子激光（未定影的PI的入口进入的问题。细胞在压力下已经解决别处^9,10）。

1. PI染色，在终浓度为50μg/ ml的细胞悬浮液中添加荧光染料，孵育10分钟，在0℃下在黑暗中。
2. 激光功率设定为100毫瓦和一个26分之575的带通滤波器是用来收集PI发出的荧光在丙级。
3. 我们执行FC测量一个70微米的喷嘴。排序精母细胞群体，在正常-R或-C正常排序模式，使用3排序滴在信封。样品和收集管保持在3 - 4℃，使用制冷机组。调整样品的差来分析细胞的速度为500〜1500，每秒。
4. 使用分析应用CellQuest软件（BD）以下参数：前向散射（FSC-H），侧向散射光（SSC-H），总发射的荧光或脉冲面积（FL2-A）和荧光发射的持续时间或脉冲宽度（FL2-W）。

或者，我们所采用的重要染料Hoechst 33342至终浓度为5微克/毫升，并温育10分钟，在37℃下在黑暗中。进行细胞分析装置的一个：流式细胞仪MoFlo（DakoCytomation）配备在25毫瓦的UV激发波长激光器的工作，使用70微米的喷嘴。数据操作进行与峰会V4.3的软件（DakoCytomation）。

结果

以及分列的细胞悬浮液从大鼠睾丸制备与这里描述的协议的一个例子是图1中所示。

在酶处理^6,8和前面描述的机械分解方法²相比，这里介绍的是速度更快，处理涉及较少，很容易重现（取决于运营商），并呈现稀缺的细胞碎片（特别是相对于其它机械方法）和非常少的多核（已经描述了形成作为广泛的组织操纵^1,2的结果）。此外，由于相对于酶处理，它避免了使用RNA酶，胰蛋白酶和胶原酶，可能有利于大分子降解。

另一方面，虽然以前的报告已经证明，由一个专门的机械方法编制的睾丸细胞悬液成群更容易比胰酶消化上课^1，应用本发明方法所提供的非常小的聚集的细胞悬浮液中，在图1中可以看出。在这个意义上说，我们已经发现NDA列入非常有效的防止细胞聚集，并避免在随后的流的研究喷嘴堵塞， 图1还表明细胞碎片的稀缺性，这也是明显的，在图2中所示的FC直方图...

讨论

这里描述的优化方法使细胞悬液的制备从啮齿动物睾丸组织在一个非常快速和可重复的方式，避免了酶和洗涤剂处理和维护良好的细胞的完整性和类型比例。的简洁的程序（跨度15分钟包括睾丸切除，组织切割和处理），涉及最少的处理，酶处理的情况下的一些主要优点。所有这些将占短暂的生命大分子保存好，这是关键的时候，具有代表性的化合物存在于原始细胞人口需要。

关于使用PI或赫斯特33342，流式细胞仪分析睾丸细胞悬液的就业或其他染料产生的配置文件中，我们已经观察无明显差异。染料的选择，更取决于用户的喜好和空房，计划进一步利用。的一侧上，PI是便宜的，广泛的应用，不要求使用流式细胞仪和分选机，具有紫外激光。另一方面，虽然我们已经成功地使用PI染色细胞不可告人的排序和基因差异表达的研究（ 图4），赫斯特33342或低毒性水平的另一个重要的染料，可能是最好的选择，应用全细胞活力，如生殖细胞培养和/或移植^4。

我们已经能够实现超过95％的纯度，或者与不同的DNA含量^4（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Medimachine 系统	BD	340587
Medicon 单元 （50 μm）	BD	340591
Filcon 单元 （50 μm）	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
胎牛血清	PAA	A11-151
NDA	化疗 BmbH	277081
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	储备液 5 mg/ml;终浓度为 5 μ;g/ml
碘化丙	Sigma-Aldrich	287075	储备液 1 mg/ml;以 50 μ 的最终浓度使用;克/毫升