制备睾丸细胞悬液的简易高效技术

摘要

本文介绍了一种新型的啮齿类动物睾丸细胞悬液机械制备方案，该方法无需使用酶和去污剂。该技术操作简便、快速、可重复性强，所获得的细胞悬液质量良好，适用于流式分选和RNA提取。

摘要

哺乳动物的睾丸是极为复杂的器官，包含超过30种不同的细胞类型，包括体细胞性腺细胞以及处于不同发育阶段的生殖系细胞。这种异质性对研究哺乳动物精子发生的基础构成了重要障碍，因为在进行大多数分子分析时，需要获得特定精子发育阶段的纯化或富集的细胞群体¹。

为了进行差异基因表达研究，已采用多种策略来获得富集或纯化的睾丸细胞群体，例如Staput^2,3、离心淘析¹和流式细胞术（FC）^4,5。

大多数富集或纯化方法要求细胞处于悬浮状态。理想情况下，细胞悬液应能代表原始组织，具有较高比例的活细胞，较少的多核细胞（多核细胞的形成通常是由于生精上皮的合胞体特性^6,7），且无细胞团块¹。已有研究表明，仅通过机械法制备的睾丸细胞悬液比经胰蛋白酶处理的更易形成团块¹。另一方面，使用RNase和/或解离酶（如胰蛋白酶和胶原酶）进行酶消化处理会导致特定大分子的降解，这对于某些后续应用是不利的。理想的操作过程应尽可能短，并尽量减少操作步骤，以良好地保存目标大分子（如mRNA）。目前从实体组织制备细胞悬液的常规方案通常耗时较长，高度依赖操作者技术，且可能选择性地损伤某些细胞类型^1,8。

本文所述方案结合了高度可重复且极为快速的机械解离优势，无需酶处理，即可获得高质量的细胞悬液，适用于流式细胞术分析与分选⁴，以及后续的基因表达研究⁹。

方案

1. 细胞悬液的制备

1. 根据专业委员会（如IACUC或同等机构，在乌拉圭为国家动物实验委员会[CNEA]）的建议处死待用标本。在本实验中，采用戊巴比妥过量注射的方式。
2. 按照标准批准的操作程序解剖睾丸，并将其置于含有10 ml冰冷DMEM（添加10%胎牛血清）的96 mm玻璃培养皿中，冰上保存。
3. 去除白膜，将去被膜的睾丸切成每边2–3 mm的方形小块。
4. 随后将组织块放入Medimachine（一种自动机械研磨器）中进行处理，该仪器通过一次性处理单元内的不锈钢筛网和金属转子实现组织解离。操作时，将1 ml冷的含血清DMEM和4–5块组织放入50 μm的一次性处理单元中，开启解离仪，按照制造商的简单说明处理50秒。
5. 使用3–5 ml无针头注射器从解离单元中回收所得的细胞悬液。
6. 用预先用0.5 ml含血清DMEM浸润的50 μm尼龙滤网过滤细胞悬液。
7. 再用浸润过的25 μm尼龙滤网进行二次过滤，随后置于冰上保存。
8. 在Neubauer计数板中进行细胞计数，并用含血清DMEM调整细胞浓度至1–2 × 10⁷ 个细胞/ml。通常每克睾丸组织可获得至少4 × 10⁷ 个细胞。
9. 最后，加入NDA（2-萘酚-6,8-二磺酸二钾盐），使其终浓度为0.2%，以防止细胞聚集。
10. 可选步骤：按照制造商说明书，使用 commercially available 动物细胞活力检测试剂盒检测睾丸细胞悬液的细胞活力。

2. 流式细胞术分析

我们使用配备有Coherent氩离子激光器（调谐至488 nm发射）的BD FACSVantage流式细胞仪，对用高浓度碘化丙啶（PI）染色的细胞进行分析。（关于PI在应激条件下进入未固定细胞的问题，已在其他文献中讨论过^9,10）。

1. 进行碘化丙啶（PI）染色时，将荧光染料以终浓度50 μg/ml加入细胞悬液中，于0 °C避光孵育10分钟。
2. 激光功率设定为100 mW，使用575/26带通滤光片收集FL2通道中的PI发射荧光。
3. 我们采用70 μm喷嘴进行流式细胞术检测。分选精母细胞群体时，分选模式设为Normal-R或Normal-C，包络设置为3个分选液滴。使用制冷装置将样品管和收集管保持在3 - 4 °C。调节样品压差，使细胞分析速率为每秒500至1,500个。
4. 使用CellQuest软件（BD）分析以下参数：前向散射光（FSC-H）；侧向散射光（SSC-H）；总发射荧光或脉冲面积（FL2-A）；以及荧光发射持续时间或脉冲宽度（FL2-W）。

或者，我们使用活体染料Hoechst 33342，使其终浓度为5 μg/ml，在37 °C避光孵育10分钟。细胞分析采用配备紫外激发波长激光器（功率25 mW）和70 μm喷嘴的MoFlo流式细胞仪（DakoCytomation）进行。数据处理使用Summit v4.3软件（DakoCytomation）完成。

结果

此处所示为采用本方案制备的大鼠睾丸组织单细胞悬液的良好解离示例 图1.

与酶处理方法^6,8以及先前描述的机械解离方法²相比，本文所介绍的方法速度更快、操作步骤更少、易于重复（不依赖操作者），且产生的细胞碎片极少（尤其是与其他机械方法相比），多核细胞也极少（多核细胞的形成曾被报道是组织过度操作所致^1,2）。此外，与酶处理方法不同，该方法避免了RNA酶、胰蛋白酶和胶原酶的使用，从而防止大分子降解。

另一方面，尽管先前的报道表明，仅通过机械方法制备的睾丸细胞悬液比经胰蛋白酶处理的细胞悬液更容易发生聚集¹，但采用本方法所获得的细胞悬液中几乎未见细胞聚集现象，如图1所示。在这方面，我们发现添加NDA在防止细胞聚集以及避免后续流式分析过程中喷嘴堵塞方面非常有效。图1还显示出细胞碎片极少，这一点在图2所示的流式细胞术直...

讨论

本文所述的优化方法能够以快速且可重复的方式制备啮齿类动物睾丸组织的细胞悬液，避免使用酶和去垢剂处理，同时保持良好的细胞完整性和细胞类型比例。该方法操作简便，耗时短（15 分钟内完成睾丸解剖、组织切割及处理），操作步骤少，且无需酶解处理，是其主要优势。这些特点有助于较好地保存短寿命大分子，当需要获取原始细胞群体中具有代表性的化合物样本时，这一点尤为关键。

关于使用 PI 或 Hoechst 33342，我们在对睾丸细胞悬液进行流式细胞分析时，观察到使用其中任一染料所获得的结果图谱之间无明显差异。染料的选择将主要取决于使用者的偏好、可获得性以及后续实验计划。一方面，PI 成本较低，且应用广泛，因其无需使用配备紫外激光器的流式细胞仪或分选仪。另一方面，尽管我们已成功将经 PI 染色的细胞用于后续的分选及差异基因表达研究（图4），但在需要保持细胞完全活力的应用中，例如生殖细胞培养和/或移植⁴，Hoechst 33342 或其他低细胞毒性的活细胞染料可能是更优选择。

我们已能够分选...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Medimachine 系统	BD	340587
Medicon 单元（50 μm）	BD	340591
Filcon 单元（50 μm）	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
胎牛血清	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	14533	储存液浓度 5 mg/ml；使用时终浓度为 5 μg/ml
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	287075	储存液浓度 1 mg/ml；使用时终浓度为 50 μg/ml