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方法文章

使用滑动实验测量生物大分子的弯曲刚度

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DOI：

10.3791/50117

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2012年11月9日

 ,  , 
1Department of Physics, Lawrence University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于测量生物大分子持久长度或弯曲刚度的方法。该方法利用驱动蛋白驱动的微管滑动实验，通过实验手段测定单个微管的持久长度，并可适用于基于肌动蛋白的滑动实验。

摘要

微管是细胞骨架聚合物，在细胞分裂、细胞力学和细胞内运输中发挥重要作用。这些功能均要求微管具有足够的刚性和直线性，以跨越细胞直径的显著比例。因此，作为刚性度量的微管持久长度在过去二十年中被广泛研究1。然而，仍存在未解的问题：短微管的刚性比长微管低10至50倍2-4，甚至长微管测得的持久长度也存在数量级上的差异5-9。

本文介绍了一种测量微管持久长度的方法。该方法基于驱动蛋白驱动的微管滑动实验10。通过结合对单个微管的稀疏荧光标记以及对附着在微管上的单个荧光基团的单粒子追踪，可实现对单个微管滑动轨迹的纳米级精度追踪。在所采用的实验条件下，轨迹的持久长度与微管本身的持久长度相同11。利用自动化追踪程序，由附着在单个微管上的荧光基团生成微管运动轨迹，并使用 IDL 编写的程序计算该轨迹的持久长度。

该技术可快速实施，能够在一天的实验时间内测量100根微管的持久长度。该方法可拓展用于在多种条件下测量持久长度，包括沿微管长度方向上的持久长度变化。此外，所使用的分析程序也可扩展至基于肌球蛋白的肌动蛋白滑动实验，以测量肌动蛋白丝的持久长度。

引言

细胞骨架是存在于大多数真核细胞中的一种生物聚合物网络，参与细胞结构组织、细胞内运输以及细胞力学过程。细胞骨架生物聚合物（主要是肌动蛋白和微管）的力学特性在决定整个细胞的力学行为方面起着重要作用12。由于全细胞力学特性可用于区分健康细胞与病变细胞13,14，并参与调控细胞运动性15，因此过去二十年来，细胞骨架基本组分的力学性质一直是研究的热点领域1。

生物大分子的柔韧性（或刚性）由持续长度表征，即在室温下由于热涨落使聚合物弯曲约一弧度的长度。已有多种技术被开发用于测量持续长度16，例如主动技术，通过流体动力流、光镊或电场对聚合物施加弯曲作用4,17,18；以及被动技术，通过测量溶液中自由聚合物的涨落情况来实现5,6。然而，主动测量需要专门的装置以在微米尺度上施加已知的作用力，而自由涨落测量则可能因聚合物扩散出显微镜焦平面之外而变得困难。

本文介绍了一种互补性的被动技术，用于测量微管（一种细胞骨架聚合物）的持久长度。该技术包括滑动实验，可确保聚合物始终处于焦平面内19。此外，该方法涉及追踪永久标记在目标聚合物上的单个荧光分子，从而精确定位聚合物上的特定位置。

该方法的示意图见图1。驱动蛋白特异性地向微管的正端移动，因此在滑动实验中，微管被单向推动。微管的前端（即最后一个结合的驱动蛋白之外的部分）在周围溶液的热力作用下可自由波动。当微管被向前推动时，其前端持续波动，直到与玻璃片上更远处的另一个驱动蛋白分子结合，从而将某一波动状态固定下来。由于驱动蛋白与微管的结合非常牢固，微管被迫沿着前端的路径行进。因此，冻结在微管轨迹中的统计波动与游离微管末端的统计波动相同11，因而可根据此关系计算持久长度20

静态平衡方程；⟨cosθ_s⟩=e^(-s/l_p)。用于科学分析的公式。
其中 lp 为微管的持久长度，θs 为沿轮廓长度相距 s 的轨迹切线之间的夹角，<> 表示对所有沿轮廓长度相距 s 的位置对进行平均。

滑动实验本身采用在卷曲螺旋区域生物素化的驱动蛋白，通过链霉亲和素-生物素连接特异性结合到玻璃载片上21。这种连接方式确保驱动蛋白的马达结构域能够自由地结合并推动微管。为了追踪微管的运动轨迹，微管被稀疏地标记上有机荧光染料22,23——标记密度需足够低，以便利用单分子荧光显微镜分辨出单个荧光分子。使用基于IDL编写的数据分析程序对单个荧光分子进行追踪。每个与特定微管结合的荧光分子的运动轨迹会自动整合为一条完整的微管轨迹24。计算轨迹上每一点的切线角度θ，并基于这些切线角度计算每个轮廓长度s对应的<cosθs>值。最后，将这些数据拟合到公式1，以获得单根微管或同一滑动实验中多根微管的持久长度。

该方法具有足够的稳健性，可适用于在多种条件下制备的微管（包括结合了不同稳定剂或其他小分子的微管、结合了微管相关蛋白（MAPs）的微管，或处于多种黏稠溶液中的微管）。在本实验室中，该技术已被用于表征微管的持久长度随微管轴向长度的变化，以及含有不同稳定剂的微管的持久长度。主要限制在于微管必须仍能支持驱动蛋白的运动。由于驱动蛋白是一种性能稳健的马达酶，这一限制相对宽松。通过将微管替换为肌动蛋白，并将驱动蛋白替换为肌球蛋白家族的酶，可利用相同技术测定肌动蛋白的持久长度。

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方案

1. 微管滑动实验储备溶液

在滑动测定实验前做好准备。

  1. 聚合0.5 mg稀疏标记有明亮有机荧光团的微管22。目标标记浓度为每微米微管含1个荧光团，即标记密度约为每1,500个微管蛋白二聚体含1个荧光团。室温避光保存（用铝箔包裹），可保存长达两周。
  2. 纯化生物素化驱动蛋白（biotin-kinesin）21至浓度约为1 μM。分装为5 μl每份，-80 °C保存，用于单个实验。
  3. 配制测定缓冲液（AB）：50 mM咪唑、50 mM氯化钾（KCl）、4 mM氯化镁（MgCl2）、2 mM乙二醇四乙酸（EGTA），pH 6.7。经无菌过滤后，4 °C保存。
  4. 将生物素化牛血清白蛋白（biotin-BSA）溶于AB缓冲液至2 mg/ml。使用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为100 μl每份于-80 °C储存；短期可于4 °C保存长达一个月。
  5. 将链霉亲和素（SA）溶于AB缓冲液至10 mg/ml。使用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为20 μl每份于-80 °C储存；短期可于4 °C保存长达两周。
  6. 将α-酪蛋白（α-casein）溶于AB缓冲液至5 mg/ml。使用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为100 μl每份于-80 °C储存；短期可于4 °C保存长达两周。
  7. 将二硫苏糖醇（DTT）溶于去离子水中至200 mM。分装为100 μl每份，-20 °C保存；解冻后8小时内使用。可反复冻融。
  8. 将紫杉醇（PT）溶于HPLC级二甲基亚砜（DMSO）中至4 mM。长期保存分装为10 μl每份于-80 °C储存，短期可于-20 °C保存。解冻后8小时内使用。可反复冻融。
  9. 将葡萄糖溶于去离子水中至120 mg/ml。分装为100 μl每份，-20 °C保存。可反复冻融。
  10. 将三磷酸腺苷（ATP）溶于去离子水中至150 mM，pH 7.0。分装为5 μl每份，-80 °C保存；解冻后8小时内使用。
  11. 通过将10,000单位葡萄糖氧化酶和156,000单位过氧化氢酶溶解于总共600 μl的测定缓冲液中，配制100倍氧清除系统储备液25。在微量离心机中短暂离心以沉淀不溶物；上清液用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为10 μl每份于-80 °C储存；短期可于4 °C保存长达一周。

2. 微管滑动实验，同日溶液配制

在实验当天配制2.1-2.6中的溶液。熟练后，可在流式细胞仪清洗过程中配制2.2-2.6溶液。除非另有说明，所有储备溶液均需置于冰上保存。

  1. 配制 AB：取 1 ml 检测缓冲液，加入 10 μl DTT 储液（终浓度为 2 mM DTT 的 AB）。室温保存。
  2. 配制生物素化 BSA 缓冲液：取 40 μl 生物素-BSA 储液与 AB 的 1:1 混合液。室温保存。
  3. 配制 BSA 缓冲液：将 645 μl AB 与 5.5 μl BSA（AB 中含 1 mg/ml BSA）混合。室温保存。
  4. 配制链霉亲和素（SA）缓冲液：将 57 μl AB 与 3 μl 链霉亲和素储液（AB 中含 0.5 mg/ml 链霉亲和素）混合。室温保存。
  5. 配制 α-酪蛋白缓冲液：将 200 μl BSA 缓冲液、50 μl 酪蛋白储液和 0.8 μl 15 μM ATP 混合（终浓度为 AB 中含 1 mg/ml α-酪蛋白、0.8 mg/ml BSA 和 50 nM ATP）。室温保存。
  6. 配制荧光抗漂白缓冲液：将 95 μl α-酪蛋白缓冲液、2.5 μl 葡萄糖储液、1 μl 100 倍氧清除剂混合液、1 μl 紫杉醇储液和 1 μl 2-巯基乙醇（βME）混合。在通风橱内加入 βME。配制后 1 小时内使用。 注意：βME 具有高毒性且气味难闻。务必仅在通风橱内操作。储存时应避光；光照会降解 βME，降低其抗光漂白能力。

3. 微管滑动实验

  1. 使用注射器通过移液器吸头挤出真空脂作为间隔物，在 24 × 60 mm 盖玻片与 22 × 22 mm 盖玻片之间构建约四个流动通道。每个流动通道的体积应约为 10 μl（后续体积按比例调整）。
  2. 向每个通道中加入 10 μl 生物素化 BSA 缓冲液。孵育 5 分钟，使 BSA 覆盖玻璃表面。
  3. 用 15 μl BSA 缓冲液将每个通道洗涤三次，以去除游离的生物素化 BSA，同时继续封闭载玻片表面。使用 Kimwipe 纸或滤纸从流动室的对侧吸除缓冲液，务必避免气泡通过流动室。
  4. 向每个通道中加入 15 μl 链霉亲和素（SA）缓冲液。静置 10 分钟，或最长 2 小时。链霉亲和素将与表面结合的生物素化 BSA 结合。
  5. 用 15 μl BSA 缓冲液将每个通道洗涤三次，以去除游离的链霉亲和素，同时继续封闭载玻片表面。
  6. 用 15 μl α-酪蛋白缓冲液冲洗每个通道。α-酪蛋白有助于进一步阻断驱动蛋白和微管与玻璃表面的非特异性结合。
  7. 将驱动蛋白用 α-酪蛋白缓冲液稀释至 10 nM，并向每个通道中加入 15 μl 该驱动蛋白-α-酪蛋白溶液。静置 15 分钟（或最长 1 小时），使生物素化的驱动蛋白特异性结合到表面固定的链霉亲和素上。驱动蛋白的马达结构域将保持游离状态，以便结合微管。
  8. 将紫杉醇用室温的 α-酪蛋白缓冲液稀释至 40 μM，并向每个通道中加入 15 μl 该溶液，以洗去游离的驱动蛋白，并预先将每个流动室充满紫杉醇溶液，防止微管解聚。低温也会导致微管解聚，因此确保这些步骤在室温下使用室温溶液进行。
  9. 将荧光标记的微管在含 1 mM ATP 的抗荧光淬灭缓冲液中稀释 1:100 至 1:1,000。取 15 μl 加入一个通道中，并在 30 分钟内观察。

4. 数据采集

  1. 使用荧光显微镜观察微管滑动；需要配备能够分辨单个荧光分子的显微镜，例如商用或自制的全内反射荧光（TIRF）系统26（图2）。
    微管应由驱动蛋白马达在基底上以约 0.5 μm/s 的速度推进，具体速度取决于温度。若显微镜的视场为 50 μm，则单个微管应可被观察约 100 秒。调节照明强度，使单个荧光分子的光漂白时间不短于 100 秒。若使用激光激发，激光功率设置在约 3–5 mW 为宜。
  2. 采集用于分析的图像序列。以 5 Hz 采集 600 张图像（总计 2 分钟）效果良好。应使用足够长的序列，使微管能够穿越整个视场。

5. 数据分析

附带一个 IDL 程序 get_lp.pro。该程序可根据给定图像序列中所有滑动微管的数据返回持久长度值。可对每个图像序列运行此程序，并根据您特定的显微镜设置调整强度参数；或者执行以下操作：

  1. 追踪连接到微管上的每个荧光染料，以生成荧光染料的运动轨迹。
  2. 将同一条微管上所有荧光染料的轨迹合并为一条整体的微管轨迹；对图像序列中的每一条微管重复此过程（图3）。
  3. 计算轨迹上每一点的切线角度（图4），并通过计算所有间距为路径长度 s 的点对之间角度差的余弦平均值，得到公式1中的 θs>（图5）。通过将 θs> 拟合至公式1，并在拟合过程中根据用于计算平均值的 cosθs 独立数据点数量对各个数据点进行加权，从而求得单条微管或一组微管的持久长度。

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结果

滑动实验的快照如图所示 图2微管密度适宜为每视野1-10条微管；密度过高会导致微管相互交叉，从而引起追踪错误。来自滑动实验的11条微管运动轨迹图 图2 如图所示 图3典型的轨迹为10到 30 μm 较长；一些轨迹在微管交叉处存在间隙。这些轨迹可从分析中剔除。

单个长微管轨迹如图4A所示，图中给出了轨迹上两个位置处的切线角示例。相隔固定距离的切线角之差与持久长度相关；微管轨迹上切线角随位置变化的关系如图4B所示。

通过整合多条微管运动轨迹的切线角数据，可计算出特定实验中所有微管的单一持久长度。图5展示了图2中滑动实验的θs>随轮廓长度s变化的曲线图。在较大的轮廓长度范围内，测得的cosθ值非常...

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讨论

持续长度的测量是表征单个生物大分子机械性能的良好方法。本文介绍了一种测量微管持续长度的方法。如引言所述，通过在滑动实验的最后一步（步骤3.9）中改变试剂、温度或黏度，或在不同条件下进行微管聚合（步骤1.1），该方法可轻松扩展应用于多种条件下微管机械性能的研究。

该技术本身操作迅速。一旦预先配制好储备溶液（步骤1），即可在2至3小时内完成一次滑动测定实验，包括在单个显微镜载玻片上设置多达四种不同的实验条件（步骤3.1中的四条通道）。每次实验可观察大量微管；本实验室典型的实验通常每种条件下分析100条微管（每条通道约10个图像序列，每个序列包含10条微管）。大规模数据集的分析同样较为快速。熟练操作后，使用现代个人电脑，一个下午即可完成10个图像序列的持续长度分析。分析过程中的限速步骤是追踪单个荧光分子所需的时间；而更新的追踪方法有望显著提高这一分析速度27。

由于该方法涉及追踪连接到特定微管上的单个荧光基团，其追踪精度仅受限于光子采集量，可达到纳米级22,

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Melissa Klocke 协助准备图1，感谢 Anna Ratliff 对本实验方案的演示。本研究工作由科学进步研究公司（Research Corporation for Science Advancement）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
咪唑Sigma-AldrichI2399
氯化钾Sigma-AldrichP9541
氯化镁Sigma-AldrichM8266
EGTASigma-AldrichE3889
BSACalbiochem126615
生物素标记的BSAThermo Scientific29130
α-酪蛋白Sigma-AldrichC6780
链霉亲和素Thermo Scientific21125
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
紫杉醇LC LaboratoriesP-9600
葡萄糖氧化酶Sigma-AldrichG2133
过氧化氢酶Sigma-AldrichC100
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
ATPSigma-AldrichA2383
2-巯基–乙醇Sigma-AldrichM3148有毒。请购买小量。
24×60 mm No. 1 1/2 盖玻片VWR48393-252
22×22 mm No. 1 盖玻片Gold Seal3306
高真空润滑脂Dow-CorningNA
设备
TIRF显微镜多家厂商NA本方法中使用的TIRF显微镜为自制。
IDL（软件）ExelisNA可用MATLAB、ImageJ或其他图像分析软件替代。

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