使用滑动实验测量生物大分子的弯曲刚度

摘要

本文介绍了一种用于测量生物大分子持久长度或弯曲刚度的方法。该方法利用驱动蛋白驱动的微管滑动实验，通过实验手段测定单个微管的持久长度，并可适用于基于肌动蛋白的滑动实验。

摘要

微管是细胞骨架聚合物，在细胞分裂、细胞力学和细胞内运输中发挥重要作用。这些功能均要求微管具有足够的刚性和直线性，以跨越细胞直径的显著比例。因此，作为刚性度量的微管持久长度在过去二十年中被广泛研究¹。然而，仍存在未解的问题：短微管的刚性比长微管低10至50倍^2-4，甚至长微管测得的持久长度也存在数量级上的差异^5-9。

本文介绍了一种测量微管持久长度的方法。该方法基于驱动蛋白驱动的微管滑动实验¹⁰。通过结合对单个微管的稀疏荧光标记以及对附着在微管上的单个荧光基团的单粒子追踪，可实现对单个微管滑动轨迹的纳米级精度追踪。在所采用的实验条件下，轨迹的持久长度与微管本身的持久长度相同¹¹。利用自动化追踪程序，由附着在单个微管上的荧光基团生成微管运动轨迹，并使用 IDL 编写的程序计算该轨迹的持久长度。

该技术可快速实施，能够在一天的实验时间内测量100根微管的持久长度。该方法可拓展用于在多种条件下测量持久长度，包括沿微管长度方向上的持久长度变化。此外，所使用的分析程序也可扩展至基于肌球蛋白的肌动蛋白滑动实验，以测量肌动蛋白丝的持久长度。

引言

细胞骨架是存在于大多数真核细胞中的一种生物聚合物网络，参与细胞结构组织、细胞内运输以及细胞力学过程。细胞骨架生物聚合物（主要是肌动蛋白和微管）的力学特性在决定整个细胞的力学行为方面起着重要作用¹²。由于全细胞力学特性可用于区分健康细胞与病变细胞^13,14，并参与调控细胞运动性¹⁵，因此过去二十年来，细胞骨架基本组分的力学性质一直是研究的热点领域¹。

生物大分子的柔韧性（或刚性）由持续长度表征，即在室温下由于热涨落使聚合物弯曲约一弧度的长度。已有多种技术被开发用于测量持续长度¹⁶，例如主动技术，通过流体动力流、光镊或电场对聚合物施加弯曲作用^4,17,18；以及被动技术，通过测量溶液中自由聚合物的涨落情况来实现^5,6。然而，主动测量需要专门的装置以在微米尺度上施加已知的作用力，而自由涨落测量则可能因聚合物扩散出显微镜焦平面之外而变得困难。

本文介绍了一种互补性的被动技术，用于测量微管（一种细胞骨架聚合物）的持久长度。该技术包括滑动实验，可确保聚合物始终处于焦平面内¹⁹。此外，该方法涉及追踪永久标记在目标聚合物上的单个荧光分子，从而精确定位聚合物上的特定位置。

该方法的示意图见图1<....

方案

1. 微管滑动实验储备溶液

在滑动测定实验前做好准备。

1. 聚合0.5 mg稀疏标记有明亮有机荧光团的微管²²。目标标记浓度为每微米微管含1个荧光团，即标记密度约为每1,500个微管蛋白二聚体含1个荧光团。室温避光保存（用铝箔包裹），可保存长达两周。
2. 纯化生物素化驱动蛋白（biotin-kinesin）²¹至浓度约为1 μM。分装为5 μl每份，-80 °C保存，用于单个实验。
3. 配制测定缓冲液（AB）：50 mM咪唑、50 mM氯化钾（KCl）、4 mM氯化镁（MgCl₂）、2 mM乙二醇四乙酸（EGTA），pH 6.7。经无菌过滤后，4 °C保存。
4. 将生物素化牛血清白蛋白（biotin-BSA）溶于AB缓冲液至2 mg/ml。使用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为100 μl每份于-80 °C储存；短期可于4 °C保存长达一个月。
5. 将链霉亲和素（SA）溶于AB缓冲液至10 mg/ml。使用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为20 μl每份于-80 °C储存；短期可于4 °C保存长达两周。
6. 将α-酪蛋白（α-casein）溶于AB缓冲液至5 mg/ml。使用0.2 μm注射器滤器过滤。长期保存可分装为100 μl每份于-80 °C....

结果

滑动实验的快照如图所示 图2微管密度适宜为每视野1-10条微管；密度过高会导致微管相互交叉，从而引起追踪错误。来自滑动实验的11条微管运动轨迹图 图2 如图所示 图3典型的轨迹为10到 30 μm 较长；一些轨迹在微管交叉处存在间隙。这些轨迹可从分析中剔除。

单个长微管轨迹如图4A所示，图中给出了轨迹上两个位置处的切线角示例。相隔固定距离的切线角之差与持久长度相关；微管轨迹上切线角随位置变化的关系如图4B所示。

通过整合多条微管运动轨迹的切线角数据，可计算出特定实验中所有微管的单一持久长度。图5展示了图2中滑动实验的θ_s>随轮廓长度s变化的曲线图。在较大的轮廓长度范围内，测得的cosθ值非常.......

讨论

持续长度的测量是表征单个生物大分子机械性能的良好方法。本文介绍了一种测量微管持续长度的方法。如引言所述，通过在滑动实验的最后一步（步骤3.9）中改变试剂、温度或黏度，或在不同条件下进行微管聚合（步骤1.1），该方法可轻松扩展应用于多种条件下微管机械性能的研究。

该技术本身操作迅速。一旦预先配制好储备溶液（步骤1），即可在2至3小时内完成一次滑动测定实验，包括在单个显微镜载玻片上设置多达四种不同的实验条件（步骤3.1中的四条通道）。每次实验可观察大量微管；本实验室典型的实验通常每种条件下分析100条微管（每条通道约10个图像序列，每个序列包含10条微管）。大规模数据集的分析同样较为快速。熟练操作后，使用现代个人电脑，一个下午即可完成10个图像序列的持续长度分析。分析过程中的限速步骤是追踪单个荧光分子所需的时间；而更新的追踪方法有望显著提高这一分析速度²⁷。

由于该方法涉及追踪连接到特定微管上的单个荧光基团，其追踪精度仅受限于光子采集量，可达到纳米级^22,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
咪唑	Sigma-Aldrich	I2399
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
生物素标记的BSA	Thermo Scientific	29130
α-酪蛋白	Sigma-Aldrich	C6780
链霉亲和素	Thermo Scientific	21125
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D0632
紫杉醇	LC Laboratories	P-9600
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	G2133
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C100
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	有毒。请购买小量。
24×60 mm No. 1 1/2 盖玻片	VWR	48393-252
22×22 mm No. 1 盖玻片	Gold Seal	3306
高真空润滑脂	Dow-Corning	NA
设备
TIRF显微镜	多家厂商	NA	本方法中使用的TIRF显微镜为自制。
IDL（软件）	Exelis	NA	可用MATLAB、ImageJ或其他图像分析软件替代。