本文介绍了一种组织学方法，用于捕获、标记、光学透明化并成像啮齿类动物脑组织中长期植入微装置周围的完整脑组织界面。该方法所包含的技术可帮助理解各种穿透性脑植入物对其周围组织的影响。
本文内容
摘要
摘要
针对脑内植入式微器件（如微电极阵列）的设计与应用研究，旨在开发能够长期与周围脑组织形成稳定界面的、具有临床应用价值的装置。这些植入物周围的组织被认为会随着时间推移对装置的存在产生反应，其中包括在装置周围形成起绝缘作用的“胶质瘢痕”。然而，对这些组织变化的组织学分析通常是在取出装置后进行的，而这一过程可能破坏目标组织的形态结构。
本文演示了一种从啮齿类动物脑组织中完整回收皮层植入器件的方法。我们描述了在用固定剂灌流后，如何移除脑组织并进行切片，以避免取出植入器件。我们概述了可用于制备厚组织切片的荧光抗体标记和光学透明化方法，以获得具有信息量的样本。最后，我们展示了这些组织切片的封片与成像方法，以便研究脑内植入器件周围的生物界面。
引言
神经假体研究领域的目标是通过中枢神经系统（CNS）接口装置绕过体内病变或受损的结构，从而帮助患有各种残疾和疾病的个体1,2。植入大脑的微型装置，例如微电极阵列（MEAs），可用于记录或刺激脑结构，从而建立电子设备与中枢神经系统组织之间的长期接口3-5。穿透式MEAs是指插入脑组织内的装置，由于其电极与邻近少量神经元之间距离非常接近，因而作为双向接口具有特殊前景6。
然而，穿透式微电极阵列（MEAs）长期植入后会引发复杂的组织反应，通常导致电生理信号的信噪比在数天至数月内出现波动并逐渐下降，同时电极位点与接地之间的电学阻抗升高7,8。这些变化的可能来源包括小胶质细胞的激活、微装置周围出现反应性星形胶质增生，以及神经元从植入装置周围的组织中丢失或迁移9-11。要理解慢性穿透式MEAs周围发生的这些组织变化，主要挑战在于难以获取完整组织界面的组织学数据，尤其是长期植入装置周围仍保持原位的组织界面12。若能在组织中保留装置与组织界面完整的情况下进行组织学分析，将优于目前需移除装置后再进行的组织学检测流程。当装置在组织中保持未扰动状态时，诸如使用生物相容性涂层13,14或对电极表面进行电学清洗15,16等相对细微的相互作用所产生的生物学影响，均可针对植入体进行成像与分析。
本文展示了一种用于收集、处理和成像完整微装置界面的方法，以对周围脑组织进行基于显微镜的详细分析。该方法使用振动切片机（vibratome）将装置及其周围脑组织一同切取为较厚的组织切片（>250 μm）。为了提高组织化学和免疫组织化学荧光标记物在这些厚切片中的渗透效果，需在含有封闭血清和去污剂的溶液中，使用高浓度的荧光标记物孵育数天。采用光学透明溶液以增强显微镜的成像深度，并将组织样本置于双面成像腔室中，用于后续的激光扫描共聚焦显微镜17观察。为了完整捕获组织-装置界面的全貌，在成像过程中使用计算机控制的平移载物台，沿植入物全长采集z轴堆叠的全景图像。除了检测所施加的组织标记外，收集来自植入物的激光反射信号以及穿过组织的透射光，也有助于确定装置界面相对于周围组织的位置。采用本“装置捕获组织学”（Device-Capture Histology, DCHist）方案制备的组织样本，可实现对形态学上保存良好的组织-装置相互作用的成像观察，从而改进了以往需移除装置的组织学方法18。
方案
溶液
磷酸盐缓冲液（PBS） - 单位：g/L；9 g NaCl，0.144 g KH2PO4，0.795 g Na2HPO4，pH 7.4
4% 甲醛 - 单位为 ml/L；202 ml 磷酸氢二钠溶液（0.4 M Na2HPO4），48 ml 磷酸二氢钠溶液（0.4 M NaH2PO4），500 ml 8% 甲醛溶液，250 ml Milli-Q DDi 水，pH 值调至 7.4
含叠氮化钠的 HEPES 缓冲汉克斯盐水（HBHS） - 单位为 g/L：7.5 g NaCl，0.3 g KCl，0.06 g KH2PO4，0.13 g Na2HPO4，2 g 葡萄糖，2.4 g HEPES，0.05 g MgCl2·6H2O，0.05 g MgSO4·7H2O，0.165 g CaCl2，0.09 g NaN3，pH 7.4
洗涤液（WS） - 含1%体积比的正常山羊血清和0.3%曲拉通X-100，并溶于含叠氮化钠（NaN3）的HBHS溶液中。后续步骤使用前，需将WS于4 °C冷藏保存。
U2 Scale 溶液 - 4 M 尿素，30% 甘油和 0.1% Triton X-100 17
实验步骤
所有实验均在美国普渡大学动物护理与使用委员会及普渡大学实验动物项目的监督下进行。
1. 手术
- 多种无菌手术方法均可与本研究所述的组织学方法兼容。建议使用立体定位仪和自动植入器，以提高微电极阵列（MEA）植入角度相对于立体定位平面的可重复性和控制精度。
注意： 本演示中的手术方法如下：在异氟烷麻醉剂（1-3%）与医用级氧气混合气体的麻醉下，将啮齿类实验动物固定于立体定位仪耳杆中。通过测试大鼠是否存在脚趾夹捏反射或小鼠是否存在尾巴夹捏反射，确认动物已完全麻醉。涂抹眼膏，用聚维酮碘和乙醇交替清洗手术区域三次。洗手后戴上外科手套、发网、口罩和手术服。注射利多卡因以局部麻醉手术区域，使用剪刀或手术刀做切口，用骨刮匙和棉签清除骨膜，再使用牙科钻机手柄配合钻头制作颅骨开窗。使用显微操作器将单束微电极阵列（MEA）植入皮层。建议由一名手术助手协助维持无菌手术条件，并记录手术过程的进展。
- 在将MEA植入脑部后，通过手术显微镜采集图像，以指导最终移除脑组织周围颅骨的操作。装置的已植入部分将原位保留 in situ。
注意： 最终收集组织样本 原位 设备的使用依赖于精确匹配设备插入平面与组织切片平面。因此，关于设备插入平面相对于大脑的详细记录非常重要。
- 植入设备后，在任何暴露的MEA探针臂或线缆周围涂抹硅胶弹性体Kwik-Sil（WPI），并使其固化。在固化过程中，可使用灭菌的塑料片（如剪断的移液器吸头）帮助将硅胶弹性体限制在颅骨开孔周围的微小凹槽内。
- 在Kwik-Sil和任何暴露的颅骨上覆盖一层双组分牙科丙烯酸树脂（Lang Dental公司的“Jet Liquid”和“Jet Powder”）。
注意：在后续步骤中，将通过熔化头帽使植入物与颅骨分离。应避免在Kwik-Sil和开颅部位使用紫外固化丙烯酸树脂，因为这种非常坚硬的丙烯酸树脂后续难以去除。也应避免在植入物周围使用视觉不透明的材料；透明的Kwik-Sil可在本方案后续步骤中提供对植入物的可视观察。
- 根据当地动物福利法规的术后护理规程进行操作，并将可自主活动的实验动物放回单独饲养的笼盒中。
2. 灌注与组织采集
注意：有关大鼠动物模型中详细的灌注操作步骤，请参见 Gage 等人的研究19。
- 采用经机构动物护理与使用委员会批准的麻醉和灌注方案。在对啮齿类动物进行深度麻醉（通过大鼠无趾捏反射或小鼠无尾捏反射确认）并暴露心脏后，在左心室和右心房做浅层剪口。将钝头针插入左心室，并注入室温 PBS。小鼠以约 5 ml/min 的速度灌注约 10 ml PBS，大鼠以约 100 ml/min 的速度灌注约 200 ml PBS。灌注过程中观察肝脏是否褪色以判断血液清除情况。
- 如需进行组织学标记，可通过经心注射的方式使用注射器递送化学标记物，注意避免引入气泡。
注意： 血管标记物（例如 DiI）和核酸复染染料（例如 Hoechst 33342）是灌注过程中可递送的化学标记物的示例。若操作得当，这些组织学标记物应能标记整个动物20。
- 通过心脏灌注输送缓冲的、室温的4%多聚甲醛以固定动物。灌注过程中应避免穿刺隔膜导致心脏穿孔，此类情况可能表现为肺部至鼻腔的液体引流。观察大肌肉群是否出现固定震颤，以判断灌注是否完全。小鼠以约5 ml/min的速度灌注总量约10 ml固定液，大鼠以约100 ml/min的速度灌注总量约200 ml固定液。
- 灌注完成后，将动物断头，使用咬骨钳或剪刀暴露部分脑干或小脑，并将头部置于4%多聚甲醛溶液中，在4 °C下固定过夜。
- 用PBS清洗头部组织，共换液三次，每次间隔一至四小时。
- 将固定后的头部组织保存于含叠氮化钠的HBHS溶液中，置于4 °C可保存数天至数月。
3. 脑组织取出方法 原位 设备
注意： 本步骤需在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。为避免组织干燥，需定期将固定后的头部放回 HBHS 溶液中。
- 使用镊子和小剪刀小心地剥离覆盖在丙烯酸颅骨帽周围的皮肤及其他组织。
- 佩戴耐热手套，使用电烙铁去除牙科丙烯酸材料，暴露出下方透明的Kwik-Sil区域（图2a）。
注意：此步骤的目的是使显微剪刀能够以适当的角度接触到植入设备进入大脑的位置，从而将植入大脑的部件与固定在颅骨上的部件分离。
- 在手术显微镜下，使用弯头显微剪刀切开硅胶弹性体，并用镊子小心移除Kwik-Sil材料的小块，直至暴露出设备进入脑组织的位置。
- 继续沿颅骨开窗表面使用弯头显微剪刀进行切割，将附着在多晶硅和颅骨上的装置部件与已植入脑内的部件分离。再次使用显微镜放大并格外小心地剪切暴露的装置部件，注意避免在固定组织中推压或拖拽植入物。
- 使用咬骨钳小心去除头帽周围的骨组织。用刮匙将带有植入装置的脑组织与颅骨分离。将脑组织保存在HBHS溶液中，待后续切片时使用。
- 将脑组织置于盛有HBHS的玻璃培养皿中，使用剃刀刀片去除无关组织，如脊髓、小脑或嗅球，具体取决于这些结构是否与装置植入位置相关。使用脑切块模具（Ted Pella）和剃刀刀片对脑组织进行切段，制备一个与植入装置角度相近的平整切面；操作时将脑组织放入合适尺寸的脑切块模具中，调整脑组织方向，使植入物的可见部分与剃刀导向槽平行，并将剃刀刀片置于导向槽中，距离植入物至少2 mm。缓慢压下剃刀刀片穿过组织。将此切面粘附至振动切片机平台上。或者，也可将剃刀刀片固定在微操作器上，以类似脑切块模具的精确控制方式，制备与植入方向高度匹配的切面。
- 在振动切片机平台下方放置冰块，待组织切面在纸巾上短暂干燥后，使用瞬干胶（Super Glue）将脑组织粘附于振动切片机上。将上一步制备的平整组织面粘接到工作台上。对于不对称的组织样本，应调整其方向，使最宽的维度与振动切片机刀片的运动方向平行，以防止刀片运行过程中可能将组织推倒。待胶水固化（约1–2分钟）后，在振动切片机皿中加入预冷的（约4 °C）PBS溶液，包围组织样本。
- 使用最大振动频率（约100 Hz）、缓慢的刀片推进速度（< 0.2 mm/秒）以及10°的刀片倾斜角（相对于水平方向），切取厚度为200–400 μm的组织切片，包括对照组织。使用毛刷或刮匙小心收集切片，并将其置于24孔板中的HBHS溶液内，于4 °C保存。
- 当肉眼或手术显微镜下可清晰观察到原位（in situ）装置时，改为切取更薄的组织切片，以每次100 μm或更小的厚度逐步接近装置位置。
注意：典型的硅微植入物在福尔马林固定的啮齿类动物大脑皮层组织中，距离器件表面 300 至 500 μm 的范围内，肉眼可见。
- 随着 原位 设备现在靠近组织表面，采集一个 >含有装置的250 μm组织切片。必要厚度的估计可参考先前收集的切片。
注意：较大的装置、多阵列装置以及倾斜装置可能需要更厚的组织切片（>500 μm），以便在一个组织片段中完整包含装置；需注意，在这些非常厚的切片中，所施加标记物的渗透能力以及显微成像的成像深度在最终数据收集中均会受到限制。如果可能，应避免使用振动切片机刀片触碰到装置，因为这可能导致装置在组织中被拖拽，并引起形态学上的变形。
4. 组织处理与透明化
- 用HBHS溶液清洗切片，每次5分钟，共清洗3次
- 将切片在硼氢化钠溶液（5 mg NaBH4/1 ml HBHS）中孵育，总时长30分钟（每侧15分钟）。使用不锈钢或特氟龙涂层微型勺和小号画笔（Ted Pella）翻转切片。缓慢而谨慎的操作有助于提高每次翻转的成功率。避免画笔接触植入装置周围的区域。如条件允许，加入明显多于所需量的溶液（>2 ml）可更方便地操作和翻转组织切片。
注意：此步骤可降低内源性自发荧光；如果在灌注过程中已使用荧光标记，或存在 xFP 转基因标记，则可跳过此步骤。
- 在室温下用洗涤液洗涤切片，每次5分钟，共洗涤3次。
注意：洗涤和孵育步骤中的振荡为可选操作。作者推测，振荡可能导致坚硬的植入物相对于周围脑组织产生轻微的震动。然而，使用以缓慢速度（< 60 rpm）运行的轨道式混合器，可能在避免此类震动的同时促进溶液的流动。
- 在室温下用洗涤液封闭 2 小时（一小时后翻转切片）。
- 在 4 °C 条件下，用一抗（用洗涤液稀释）孵育约 48 小时（每侧切片各 24 小时）。
- 用洗涤液快速洗涤 6 次，每次 3 分钟。
- 用洗涤液洗涤 6 次，每次 1 小时（每侧切片各 3 次）；若需过夜洗涤，可于 4 °C 保存。
- 在 4 °C 条件下，用二抗（用洗涤液稀释）孵育约 48 小时（每侧各 24 小时）。
- 用洗涤液快速洗涤 6 次，每次 3 分钟。
- 用洗涤液洗涤 6 次，每次 1 小时（每侧各 3 次）；若需过夜洗涤，于 4 °C 保存。
- 移除洗涤液，加入基于甘油的“U2 - Scale”透明化溶液。在 4 °C 条件下，厚切片（250–500 μm）约需 1 周完成透明化，非常厚的组织切片（>500 μm）则需 2–3 周。
- 用铝箔覆盖培养皿，并于 4 °C 保存。
- 使用可容纳厚组织切片的载玻片进行封片（图 2b, 2c），以透明化溶液作为封片介质，并用透明指甲油密封。避光，于 4 °C 保存。
5. 全组织与器件界面的全景成像
- 使用工作距离较长的显微镜物镜（> 2 mm），利用激光扫描共聚焦显微镜或双光子显微镜开始成像。我们将以蔡司LSM 710显微镜、蔡司“Zen”软件（2010版）以及计算机控制的XY平移载物台为例，对植入物周围的三维全景进行成像。
注意：可通过软件、物镜上的校正环或采集数据后的数据处理来校正透明溶液的折射率。在本演示中，我们将“U2”透明溶液的折射率为1.4输入至Leica Zen显微镜软件中；该设置会轻微调整z轴步进间隔，以补偿折射率不匹配的问题。
- 在设备附近的组织中，使用较低的激光功率（约0.5%至5%）和较大的z步进尺寸（>25 μm），大致评估每个荧光通道在z轴方向上的合适成像范围和数据采集参数。
注意：在设置全景数据采集的 z 轴时，应在上下方预留额外空间，因为组织可能无法完全平贴于载玻片上（每个方向约 20 μm）。
- 将物镜设定在最终全景图像的 x-y 中心位置；使用 Zen 全景软件，确定覆盖目标区域在每个轴（x 和 y）上所需采集位置的数量。
- 重新评估并最终确定 z 轴采集范围。
- 手动设置探测器灵敏度和激光功率，使其随成像深度增加而适当调整；目标通常是在对组织切片不同深度成像时，保持大致相同的图像强度，同时避免背景噪声过高。
- 采集每组荧光图像数据。若需避免信号重叠，应依次单独运行各激光谱线。
注意：如果可行，应将软件设置为在数据采集期间自动保存数据到硬盘。
- 更改软件设置以采集“反射率”和“透射率”数据，并使用波长更长、穿透性更强的激光（例如 633 nm）来捕获这些通道。确定采集“反射率”和“透射率”所需的合适激光功率和探测器灵敏度，并在植入装置周围重复相同的采集序列。
- 导出数据以供后续处理、定量和分析。
结果
通过将固定在头骨上的部件与嵌入脑组织的部件分离，可从脑组织切片中回收植入式微电极阵列（MEAs）。图2a展示了移除大鼠颅骨上牙科水泥头帽一侧以及围绕MEA电极线部分Kwik-Sil材料的结果。在通风橱中使用电烙铁去除牙科水泥和Kwik-Sil材料。随后，使用显微剪刀逐步剥离Kwik-Sil，直至暴露固定脑组织表面，进而切断电极线缆及任何未植入的MEA结构。
在组织切片、标记和透明化处理后，使用简单自制的载玻片来封载厚组织切片非常方便（图2b）。图2c展示了一张包含植入式微器件的脑组织切片封载实例。通过载玻片任一侧进行成像，均可评估器件周围的界面情况，如图3所示：从一侧可观察到沿MEA硅基底分布的小胶质细胞（图3a），而从另一侧则可观察到沿电极位点和导迹分布的小胶质细胞（图3b）。
组织切片固定后，可使用XY平移载物台进行成像。可在所需分辨率下获取整个组织切片上荧光标记的全景图像（图4）。通过高倍镜详细观察植入微器件周围形态保存良好的组织界面，以分析局部组织反应（图5）。
图 1. 实验流程概览。 （a-c）脑部微型植入手术完成后，在装置周围立即覆盖一层 Kwik-Sil 聚合物，随后再用丙烯酸水泥密封。（d, e）实施安乐死后，烧除丙烯酸层，并通过切割硅胶弹性体将固定在颅骨上的部件与植入部分分离。（f, g）随后将脑组织从颅腔中取出，并进行切割，固定于振动切片机载物台上。（h-k）收集组织切片，其中包括含有植入装置的组织切片。（l）随后可将组织置于定制腔室中进行处理和封片，以便进行高分辨率显微成像。 点击此处查看高清大图。
图2. (a使用电烙铁在灌注的大鼠头部牙科水泥帽上烧出一个窗口，暴露出电极阵列导线（箭头）周围透明的Kwik-Sil硅胶弹性体。b为了便于对厚组织切片的两侧进行成像，可通过切割塑料载玻片并在组织及封片液周围两侧粘附盖玻片，制作简易的“载玻片腔室”。c) 安装后显示带有完整植入物（红色箭头）的大鼠脑组织切片。利用此装置，可快速对组织任一侧进行显微成像。比例尺参考，图示（a）底部直径为 25 mm，而面板（b, c底部直径为 80 mm。
图 3. 围绕植入式微电极阵列背面（a）和正面（b）采集的 40 μm 厚图像堆栈的最大强度 z 投影。从 400 μm 厚的组织切片两侧，依次采集了小胶质细胞（使用抗 Iba1 抗体与 Alexa Fluor 633 标记，呈白色）以及来自器件表面的激光反射光（红色）。由于脑部植入物通常不透明，通过双侧光学通路进行封片，可清晰观察相对于显微镜物镜位于植入物“后方”的标记组织结构。比例尺：50 μm。
图 4. 使用激光扫描共聚焦显微镜配备计算机控制载物台成像的标记DCHist切片。（a）细胞核（用Hoechst 33342染色）和（b）单核细胞/小胶质细胞（用抗Iba1抗体标记）在不同通道中同时成像。（c）同时采集透射光和反射光信号，显示4周植入物相对于Hoechst和Iba1数据的位置。（d）所有通道（除透射光外）的叠加图像也已展示。白色矩形区域在右侧图像中被放大显示。比例尺为1 mm。
图5. 利用计算机控制的显微镜载物台和相应的软件，可围绕植入物采集全景成像数据。反射光成像（a）和透射光成像（b）可用于定位装置，而荧光抗体或化学标记（c，Iba1抗体标记的小胶质细胞和巨噬细胞）则可对完整组织界面处的组织成分进行精细成像。比例尺：200 μm。
讨论
本文展示的“设备捕获组织学”（DCHist）方法能够对脑组织与组织植入物之间形态保持良好的相互作用进行精细的组织学评估。DCHist 组织采集需要将固定在颅骨上的设备部件与植入脑内的部件仔细分离。DCHist 还要求采集较厚的组织切片（>250 μm）。这些组织切片在标记、透明化、封片并成像后，可为植入损伤或植入设备引发的后续慢性反应提供新的研究视角。如图3-5所示，利用先进的显微成像工具，可对组织与设备之间的界面进行高分辨率成像与详细分析。
目前所展示的技术依赖于能够缓慢地将由双组分牙科水泥和Kwik-Sil制成的头帽逐步清除，直至暴露出植入装置的位置。使用可经灼烧或其他方式去除的牙科水泥，以及一种透明硅胶弹性体，以便在直视下引导小型剪刀进行操作，可极大有助于成功分离植入装置与其固定于颅骨上的组件。若试图在颅骨下方、脑组织上方直接剪断装置以回收之 原位 不建议这样做，因为颅骨固定的植入物会被显著地从脑组织中拉出。
尽管较薄、较小的植入物（例如 NeuroNexus Technologies 的单束微电极阵列）最适合进行 DCHist，但该方法的原理并不局限于单束装置或微电极阵列。收集和成像策略广泛适用于多束装置以及较大的植入物（如套管），其要求是必须将这些装置从任何颅骨固定装置上分离，并在较厚的组织切片中进行收集。尽管作者主要关注皮层植入物周围组织的分析，但插入大脑更深层的装置同样可以被收集和成像。只要植入物未显著偏离已知的插入角度，其植入深度不应影响在切片中对装置的捕获。
DCHist 方法的适用性存在一定的局限性。对脑组织切片进行成像时，尤其是在白质区域，难以实现数百微米深度的清晰成像，尽管光学透明化溶液可显著提高多种组织中的成像深度21。为进一步提高成像深度，可结合使用双光子激发显微镜与所述的光学透明化技术。
该方法的另一个潜在局限性可能是研究人员所采用的特定荧光免疫组织化学方法和抗体。这些标记物通常通过被动扩散进入固定组织并结合至抗原位点。最终抗体的工作浓度必须由研究人员根据具体情况逐一确定，以在最大程度促进标记渗透的同时避免背景信号过高。对于处理方式完全相同的切片，抗体标记不应存在差异，但不同抗体在穿透组织并标记其靶向抗原的能力方面可能存在显著差异，某些抗体可轻松标记深达数百微米的抗原，而另一些抗体仅能标记深度为数十微米的抗原。我们建议通过以下方式改善扩散效果：使用高于常规浓度的抗体标记物、延长标记时间至数天，并在含有稀释去垢剂和封闭血清的溶液中进行孵育。定期翻转组织切片也有助于实现均匀标记。针对特定抗原，可考虑采用抗原修复步骤或替代的固定方法（例如 戊二醛固定、微波处理等）。二抗-荧光素偶联物在厚切片标记中的表现也可能存在差异，尽管作者在使用Invitrogen公司的Alexa Fluor荧光标记物时未观察到此类问题。作为替代方案，可利用转基因动物模型，使其在目标细胞类型中表达荧光蛋白，从而避免抗体渗透相关问题，因为许多荧光蛋白（如eGFP）在甲醛处理后仍能保持荧光，可在组织切片中直接进行观察。
DCHist 是一组强大的技术，用于捕捉和分析植入式微器件对脑组织的影响。将该组织学方案与体内电生理质量及电极阻抗数据的评估相结合22，可显著增进我们对生理信号变异性和退化生物学来源的理解。特别是植入式神经假体器件领域，或可受益于对完整器件/组织界面进行的高细节DCHist成像，从而为开发生物学中性MEA器件提供依据。
披露
作者声明无任何相关利益披露，无论财务或其他方面。
致谢
所有实验均在普渡大学动物护理与使用委员会及普渡大学实验动物项目监督下进行。
本工作由美国国防高级研究计划局（DARPA）微系统技术办公室（MTO）资助，在杰克·W·朱迪博士（jack.judy@darpa.mil）的指导下作为可靠神经技术计划的一部分实施，资助来源于空间与海军作战系统司令部（SPAWAR）系统中心太平洋分部（SSC）第 N66001-11-1-4013 号拨款。
作者们谨向 Mikhail Slipchenko、Don Ready、Greg Richter、Aaron Taylor 和 Kevin Eliceiri 致以谢意，感谢他们分享显微镜技术方面的专业知识。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA标记物 |
| 兔抗Iba1抗体 | Wako (日本) | 019-19741 | 单核细胞抗体 |
| 牙科丙烯酸树脂 | Lang Dental（多个分销商） | Jet Denture Repair Powder & Liquid | 头帽制作 |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | 覆盖暴露的颅内植入物 |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | 组织处理 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 组织处理 |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U4883 | 透明溶液 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G20225 | 透明溶液 |
| 设备 | |||
| 弯头显微剪刀 | World Precision Instruments | 14208 | 取出脑组织前切割植入物 |
| 剃刀刀片 | Ted Pella | （多种规格） | 与脑切模器配合使用 |
| 丙烯酸脑模 | Ted Pella | 15054 | 脑切模器，用于创建组织初始切面 |
| 塑料载玻片 | Ted Pella | 260225 | 组织封片 |
| 盖玻片 | Ted Pella | （多种规格） | 组织封片 |
| 电极阵列 | NeuroNexus Technologies | （多种设计） | 多电极阵列示例 |
| 振动切片机 | Leica | VT1000 S | 本方法中使用的特定系统 |
| 振动切片机刀片 | （多个供应商） | 收集切片 | |
| 24孔板 | （多个供应商） | 储存和处理组织切片 | |
| 配备电动XY扫描载物台的共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 和 ’Zen 2010’软件 | 本方法中使用的特定系统 |
| 电烙铁 | （多个供应商） | 挖掘头帽 |
参考文献
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