我们展示了细胞外多单位记录技术的多种变体，用于表征无脊椎动物嗅觉通路前三个阶段中由气味诱发的神经反应。这些技术也可轻松适用于研究其他神经系统中的群体神经活动。
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摘要
摘要
对嗅觉线索的检测与解读对许多生物的生存至关重要。值得注意的是，不同门类的物种具有惊人相似的嗅觉系统，这表明生物体在化学感知方面的策略在进化过程中已得到优化1。在昆虫嗅觉系统中，气味分子由位于触角上的嗅觉感受神经元（ORN）进行转导，这些神经元将化学刺激转化为动作电位序列。来自ORN的感觉输入随后被传递至触角叶（AL；该结构类似于脊椎动物的嗅球）。在AL中，气味的神经表征表现为分布在一群主神经元（PNs；也称为投射神经元）上的时空放电模式2,3。AL的输出随后由下游蘑菇体（MB）中的肯扬细胞（KCs）进行处理，MB是与嗅觉记忆和学习相关的脑区4,5。本文中，我们介绍用于记录这些嗅觉回路中气味诱发神经反应的电生理记录技术。
首先，我们介绍一种单感器记录方法，用于在嗅觉受体神经元（ORN）群体水平上研究气味诱发的反应6,7。我们讨论使用充满生理盐水的尖端玻璃微量移液管作为电极，对外部ORN反应进行胞外记录。接着，我们介绍一种利用商用16通道电极对外周神经元（PN）反应进行胞外记录的方法3。类似地，我们展示了使用自制8通道绞合丝四极电极记录肯扬细胞的方法8。我们提供了实验装置的详细信息，并展示了上述每种技术的代表性记录轨迹。
方案
1. 气味的制备与递送
- 按体积将气味溶液用矿物油稀释至所需浓度。将20 ml矿物油与气味物质的混合液储存于60 ml玻璃瓶中。将两根注射器针头（19号）插入橡胶塞，一根从底部插入，另一根从顶部插入，分别作为进气口和出气口。用该橡胶塞密封玻璃瓶，并将定制的活性炭过滤器连接至进气管线（图1A）。
- 活性炭过滤器由两个6 ml注射器制成。将注射器从中间切开，丢弃带活塞的一端。将剩余部分填充棉花和活性炭后，使用热缩管将其连接在一起。
- 使用聚乙烯管（内径0.86 mm）将气味瓶的出气管线连接至塑料管（Nalgene FEP管，内径5.8 mm），该塑料管用于向触角提供持续气流（图1B）。
- 通过位于蝗虫触角附近几厘米处的塑料管，向蝗虫输送经活性炭过滤和除湿的空气（载气；流速0.75 L/min）。
- 进行气味刺激时，将瓶内气味溶液上方静态顶空气体以恒定体积（0.1 L/min）置换。通过Pico-pump（WPI, PV-820）向瓶内注入等量的除湿空气来实现此操作。气味瓶产生的蒸气经出气管线导入气流管中（图1B）。
- 在蝗虫触角后方约10 cm处放置一个真空漏斗，以清除输送后的气味蒸气。
2. 蝗虫触角单感器记录的准备工作
- 从密集饲养的群体中选取一只性成熟但尚未交配、具有完全发育翅膀的成年蝗虫，性别不限。固定蝗虫前，先将其足部截除。使用组织粘合剂（Vetbond, 3M）封闭截肢部位。用一小段电工胶带缠绕蝗虫胸部，将其固定在定制的实验腔室内（图2A）。
- 在解剖显微镜下，在蜡质平台（图2A）上为触角制作一个浅槽。将触角放入槽中，并在触角两端使用蜡封固定（图2B；熔化蜡时使用电热蜡笔）。
- 将接地电极（氯化银丝）插入蝗虫胸部（距头部约1 cm处）。使用蜡封封闭切口部位，并固定接地导线（图2A）。
3. 单感器记录法监测嗅觉受体神经元（ORNs）对气味刺激的反应
- 将稳定的蝗虫触角置于配备立体显微镜（Leica M205C）的隔振台（TMC）上（图3A）。确保记录用感器的基部清晰可见（图3B）。
- 使用微电极拉制仪（Sutter P-1000）和硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.2 mm，内径0.69 mm）制备玻璃电极（充满蝗虫生理盐水时阻抗为3–10 MΩ，尖端直径1–3 μm）9。
- 将玻璃电极插入连接至电动显微操作器（Sutter MP-285）的微电极夹持器中。轻柔地将电极插入感器基部（图3B）。注意，每个感器在蝗虫中可包含3–50个嗅觉受体神经元10。
- 使用交流放大器（Grass P-55）将信号放大10,000倍。通过数据采集系统（LabView，PCI-MIO-16E-4 DAQ卡；National Instruments）对信号进行0.3–10.0 kHz带通滤波，并以15 kHz采样率采集信号（图3D）。
4. 用于触角叶和蘑菇体记录的蝗虫解剖步骤
- 按照第 2.1 节所述的固定程序进行操作。将蝗虫置于定制设计的实验腔室中，如图 4A和B所示。
- 为了在解剖过程中及之后灌注生理盐水，需在蝗虫头部周围构建一个石蜡杯。石蜡杯应从口器上方开始，延伸至复眼以外，并覆盖两根触角之间的区域，如图 4C所示。
- 为使触角能够穿过石蜡杯，在两侧使用塑料（聚乙烯）管（长 5 mm，内径 0.86 mm）制作小通道。确保塑料管可穿过石蜡杯。这可通过使用一个橡胶垫圈实现，该垫圈紧密包裹在塑料管上，但固定于石蜡杯上（图 4C）。
- 使用环氧树脂将触角基部固定在塑料管的底端。此步骤可确保即使去除周围表皮后，触角仍能保持原位。
- 从此时起，保持石蜡杯内充满生理盐水溶液9。首先去除两根触角之间的一个中央矩形区域（矩形的长边与前后轴对齐）。随后去除邻近区域的表皮，但避免扰动复眼以及触角基部的表皮（图 4D）。
- 使用精细镊子轻轻去除大脑周围的气囊和脂肪体。此步骤完成后，应能清晰看到蝗虫的大脑（图 4D）。注意，处理嗅觉信息的大脑区域（呈淡黄色色素沉着）位于两根触角之间。
- 在蝗虫中，消化道位于大脑下方并沿身体全长延伸。为防止肠道运动可能影响制备的稳定性，应轻轻拉出前肠并用精细剪刀剪断。在直肠上方的腹部做一小切口，用粗镊子拉出后肠以移除整个肠道。为防止生理盐水泄漏，需立即在切口前方用缝合线结扎腹部。
- 使用由细金属丝制成并涂有一层薄蜡的小平台，将大脑抬高并在电生理记录期间稳定其位置11，如图 4D所示。
- 昆虫大脑表面覆盖有一层薄的绝缘鞘膜，实验前需将其去除。为剥离鞘膜，使用精细镊子将少量酶（0.3–0.4 mg 蛋白酶，Sigma Aldrich）均匀涂抹于大脑表面9。酶作用约 5–10 秒后，用生理盐水彻底冲洗大脑。随后使用超细镊子非常轻柔地夹起并提起鞘膜，并在记录位点（AL 和 MB；如图 4E、F所示）将其撕开。
5. 嗅觉叶和蘑菇体的多单元记录
- 将蝗虫标本放置于图 5A在置于防震台上的悬臂支架下，使用体视显微镜进行操作。
- 实验过程中保持恒定的生理盐水灌注速率（约 0.04 L/hr）。将浸没在盛有生理盐水的石蜡杯中的氯化银丝用作接地电极。
- 用于PN记录时，使用16通道硅探针（NeuroNexus Technologies，货号#A2x2-tet-3mm-150-150-121-A16， 图5B）。每次实验前，使用金电镀电极，使其阻抗达到200–300 kΩ范围。采用图示电路进行操作 图7 用于电镀。
- 将电极置于靠近触角叶表面的位置，并使用手动显微操作器（WPI, M3301R）轻轻插入组织中图 5D).
- 以约10 μm的步长推进电极。每步停留2–3分钟，评估所获取信号的质量。在理想的记录位点，多个记录通道将接收到细胞外信号，且信噪比（SNR）较高。 > 3-5 倍噪声标准差（SDs）。
- 对于KC记录，使用自制的绞合线四极电极（图5C；第6节中介绍的逐步制备流程）。按照5.3步骤所述对这些电极进行电镀。将四极电极放置在MB表面图5E因为KC神经元胞体仅限于蘑菇体的浅层8.
- 同一蝗虫标本上可同时记录PN和KC信号，示意图如下所示 图5A.
- 在确定记录位置后，至少等待15分钟，以使电极稳定。
- 以15 KHz采集所有细胞外信号，使用16通道交流放大器（Biology Electronics Shop；Caltech，Pasadena，CA）在0.3–6 KHz范围内进行滤波，并放大10,000倍图6A、B).
6. 用于KC记录的绞合丝电极制备步骤
- 为了设计用于KC记录的多通道电极，使用绝缘的镍铬合金丝（RO800，0.0005英寸细丝）8。
- 若需要八个电极，则将金属丝在一段10-15厘米长的纸板上缠绕4圈。纸板两端可用塑料套管包裹，以防止边缘割断金属丝。缠绕时应确保无明显松弛，但也不要拉得过紧。操作时需小心处理，因该金属丝易断裂。
- 将金属丝在纸板顶部聚拢，并用一段胶带（Time Tape, T-534-RP）固定在一起。在另一端剪断金属丝束。取出金属丝后，同样用另一段胶带将剪断端的金属丝束聚拢固定。
- 使用滴定板振荡器（Thermo Scientific, Model 4625Q），将金属丝束绞合在一起（约72转/分钟，持续3分钟），形成一根拧紧的导线。将已贴胶带的金属丝束底端夹在滴定板转子上，顶端夹在支架上。绞合过程中，金属丝应保持轻微张力，但不可过紧。
- 使用热风枪（Weller 6966C）加热，使绝缘层熔融，从而将各单股金属丝粘合为单一导线。沿导线长度方向缓慢加热3-4次（每次3-4秒），即可充分加热并融合金属丝。随后松开底部夹具，使导线自然松弛。修剪导线两端，去除胶带。
- 将导线一端穿入一段5-6厘米长的玻璃毛细管（外径1.0毫米，内径0.58毫米）。用精细镊子将导线一端的绞合部分小心分开，并用火焰短暂灼烧该端以去除绝缘涂层。此步骤需格外小心；若金属丝暴露于火焰时间过长，会导致金属丝熔化并缠结。
- 轻轻分离火焰处理端的8根金属丝，并将每根金属丝分别焊接到一个8针IC插座的引脚上。在IC插座顶部涂覆环氧树脂，以固定金属丝和玻璃毛细管。同时，在毛细管另一端也滴加少量环氧树脂，以固定导线位置（图5C）。
- 最后，使用碳化钨剪刀在距离毛细管尖端约0.5厘米处，以45度角剪切导线尖端。
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结果
单个嗅觉受体神经元对两种不同醇类的气味诱发反应如图3D所示。根据记录位置（嗅器类型、电极放置位置），可获得多单位记录信号。
AL记录中的一个原始细胞外波形如图所示 图6A可在此电压记录中观察到来自不同投射神经元（PNs）的、具有不同幅度的动作电位或峰电位。尽管蝗虫触角叶中存在兴奋性投射神经元和抑制性局部神经元，但只有投射神经元能够产生可在细胞外检测到的钠离子峰电位。3这一观察结果表明，本文介绍的多单元记录技术可用于选择性地监测触角叶回路的输出，从而使蝗虫成为研究嗅觉编码的一种理想的无脊椎动物模型。
图 6B 展示了蘑菇体记录的一个示例。与嗅觉受体神经元（ORNs）和投射神经元（PNs）不同，肯尼恩细胞（KCs）具有较低的基础活动水平，并以稀疏且选择性的方式对气味产生反应。
为了从这些多单元记录中分离出单个神经元的反应，我们使用在 IGOR Pro（W...
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讨论
大多数感觉刺激会引发分布在多个神经元集合中的组合式反应。因此，要理解大脑神经回路如何表征和处理特定刺激的信息，必须同时监测多个神经元的活动。本文中，我们展示了细胞外多通道记录技术，用于表征昆虫嗅觉通路中前三个处理中枢对气味刺激的反应。需要指出的是，本文所介绍的技术已在先前多项关于嗅觉编码的研究中得到应用，并逐渐成为该领域的标准实践方法3,6,13-17。结合本文所述技术，可建立系统性研究方法，用于探究无脊椎动物嗅觉系统的设计原理与计算机制。在此，我们必须承认Gilles Laurent、Mark Stopfer及其同事所做出的开创性贡献2,3,8,9,13,16,18-21，他们率先采用这些方法揭示并阐明了嗅觉编码中的若干基本原理。
最后值得注意的是，光学技术也已成功用于研究昆虫嗅觉回路中的群体神经活动22-27。尽管当需要同时监测大量神经元的神经活动时，这些光学技术具有优势，但在需要检测单个动作电位的情况下，电生理学技术仍然是“金标准”。
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致谢
作者感谢以下机构对本工作的资助：华盛顿大学生物医学工程系提供的丰厚启动资金、系统神经科学麦克唐奈尔中心的资助、美国海军研究办公室的资助（项目编号：N000141210089）给 B.R.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电生理设备 | |||
| 交流放大器 | GRASS | 型号 P55 | 用于单感器记录 |
| 音频监视器（型号 3300） | A-M Systems | 940000 | |
| 定制16通道前置放大器和放大器 | 加州理工学院生物学电子车间 | 用于触角叶和蘑菇体记录 | |
| 数据采集单元 | 国家仪器公司 | BNC-2090 | |
| 光纤光源 | WPI | SI-72-8 | |
| 115 V 光源 | WPI | NOVA | |
| 手动显微操作器 | WPI | M3301R | 用于蝗虫脑部记录 |
| 带臂架的体视显微镜1 | Leica | M80 | 用于蝗虫脑部记录 |
| 体视显微镜2 | Leica | M205C | 用于单感器记录 |
| 防振台 | TMC | 63-500 系列 | |
| 电动显微操作器 | Sutter Instruments | MP285/T | |
| 示波器 | Tektronix | TD2014B | |
| 电极/制作工具 | |||
| 16通道电极 | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | 用于触角叶记录 |
| 含丝硼硅酸盐毛细管，内径 0.69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | 用于制作玻璃电极 |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| 函数发生器 | 万用表仓库 | SG1639A | 用于电极镀金 |
| 镀金液（无氰化物） | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| 阻抗测试仪 | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | 用于电极镀金 |
| 旋转开关 | Electroswitch | C7D0123N | 用于电极镀金 |
| 脉冲隔离器 | WPI | A365 | 用于电极镀金 |
| Q系列电极夹持器 | Warner Instruments | 64-1091 | |
| 直径 0.010" 的银丝 | A-M Systems | 782500 | 接地电极 |
| 8针双列直插式IC插座 | Digikey | ED90032-ND | |
| 含丝硼硅酸盐毛细管，内径 0.58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| 热风枪 | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 导线 | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| 滴定板摇床 | Thermo Scientific | 4625Q | 用于绞合导线 |
| 碳化钨剪刀，4.5" | 生物医学研究仪器公司 | 25-1000 | 用于切割绞合的四极导线 |
| 尖头镊子 | HECO | 91-EF5-SA | 用于分离四极导线 |
| 气味递送 | |||
| 6 ml 注射器 | Kendall | 1180600777 | 用于定制的活性炭过滤器 |
| 棕色气味瓶 | Fisher | 08-912-165 | |
| 活性炭 | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| 干燥剂 | Drierite | 23005 | |
| Drierite 气体干燥罐 | Fischer Scientific | 09-204 | |
| 热缩管 | 3M | EPS-200 | 用于气味过滤器制备 |
| 带铝制接头的皮下注射针头，19号规格 | Kendall | 8881-200136 | 用于为气味瓶提供进气和出气管路 |
| 矿物油 | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | 用于稀释气味 |
| Nalgene 塑料管，890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | 用于载气输送 |
| 气动皮升级泵 | WPI | sys-pv820 | 用于气味递送 |
| 聚乙烯管，内径 0.86 mm | Intramedic | 427421 | 用于气味瓶出口连接和灌流盐溶液管路 |
| 瓶塞 | Lab Pure | 97041 | 用于密封气味瓶 |
| 时间标记带 | PDC | T-534-RP | |
| 管路鲁尔接头 | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| 真空管 | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| 制备/解剖 | |||
| 100 x 15 mm 培养皿 | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG 多股铜线 | Lapp Kabel | 4510013 | |
| 22 AWG 多股连接线 | AlphaWire | 1551 | 脑部支撑平台 |
| 蜡染蜡 | Jacquard | 7946000 | |
| 牙科边缘蜡 | Henry-Schein Dental | 6652151 | |
| 电热蜡笔 | Almore International | 66000 | |
| 5分钟快速固化环氧树脂 | Permatex | 84101 | |
| 带铝制接头的皮下注射针头 | Kendall | 8881-200136 | |
| 来自Streptomyces griseus的蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P5147 | 用于去除蝗虫脑部鞘膜 |
| 非无菌缝合线 | Fisher | NC9087024 | 用于肠道切除后结扎腹部 |
| Vetbond | 3M | 1469SB | 用于封闭截肢部位 |
| Dumont #1 镊子（粗头） | WPI | 500335 | |
| Dumont #5 钛合金镊子（细头） | WPI | 14096 | |
| Dumont #5SF 镊子（超细头） | WPI | 500085 | 用于去除蝗虫脑部鞘膜 |
| 10 cm 解剖剪刀 | WPI | 14393 | 用于去除腿和翅膀 |
| Vannas 剪刀（细头） | WPI | 500086 | 用于去除角质层、切割前肠 |
| 盐溶液灌流 | |||
| 带流速调节器的延长管组 | Moore Medical | 69136 | 用于调节盐溶液流速 |
| 带Y型注射口的静脉输液管组 | Moore Medical | 73190 | 用于调节盐溶液流速 |
参考文献
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