我们展示了细胞外多单位记录技术的多种变体，用于表征无脊椎动物嗅觉通路前三个阶段中由气味诱发的神经反应。这些技术也可轻松适用于研究其他神经系统中的群体神经活动。
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本文内容
摘要
摘要
对嗅觉线索的检测与解读对许多生物的生存至关重要。值得注意的是，不同门类的物种具有惊人相似的嗅觉系统，这表明生物体在化学感知方面的策略在进化过程中已得到优化1。在昆虫嗅觉系统中，气味分子由位于触角上的嗅觉感受神经元（ORN）进行转导，这些神经元将化学刺激转化为动作电位序列。来自ORN的感觉输入随后被传递至触角叶（AL；该结构类似于脊椎动物的嗅球）。在AL中，气味的神经表征表现为分布在一群主神经元（PNs；也称为投射神经元）上的时空放电模式2,3。AL的输出随后由下游蘑菇体（MB）中的肯扬细胞（KCs）进行处理，MB是与嗅觉记忆和学习相关的脑区4,5。本文中，我们介绍用于记录这些嗅觉回路中气味诱发神经反应的电生理记录技术。
首先，我们介绍一种单感器记录方法，用于在嗅觉受体神经元（ORN）群体水平上研究气味诱发的反应6,7。我们讨论使用充满生理盐水的尖端玻璃微量移液管作为电极，对外部ORN反应进行胞外记录。接着，我们介绍一种利用商用16通道电极对外周神经元（PN）反应进行胞外记录的方法3。类似地，我们展示了使用自制8通道绞合丝四极电极记录肯扬细胞的方法8。我们提供了实验装置的详细信息，并展示了上述每种技术的代表性记录轨迹。
方案
1. 气味的制备与递送
- 按体积将气味溶液用矿物油稀释至所需浓度。将20 ml矿物油与气味物质的混合液储存于60 ml玻璃瓶中。将两根注射器针头（19号）插入橡胶塞，一根从底部插入，另一根从顶部插入，分别作为进气口和出气口。用该橡胶塞密封玻璃瓶，并将定制的活性炭过滤器连接至进气管线（图1A）。
- 活性炭过滤器由两个6 ml注射器制成。将注射器从中间切开，丢弃带活塞的一端。将剩余部分填充棉花和活性炭后，使用热缩管将其连接在一起。
- 使用聚乙烯管（内径0.86 mm）将气味瓶的出气管线连接至塑料管（Nalgene FEP管，内径5.8 mm），该塑料管用于向触角提供持续气流（图1B）。
- 通过位于蝗虫触角附近几厘米处的塑料管，向蝗虫输送经活性炭过滤和除湿的空气（载气；流速0.75 L/min）。
- 进行气味刺激时，将瓶内气味溶液上方静态顶空气体以恒定体积（0.1 L/min）置换。通过Pico-pump（WPI, PV-820）向瓶内注入等量的除湿空气来实现此操作。气味瓶产生的蒸气经出气管线导入气流管中（图1B）。
- 在蝗虫触角后方约10 cm处放置一个真空漏斗，以清除输送后的气味蒸气。
2. 蝗虫触角单感器记录的准备工作
- 从密集饲....
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结果
单个嗅觉受体神经元对两种不同醇类的气味诱发反应如图3D所示。根据记录位置（嗅器类型、电极放置位置），可获得多单位记录信号。
AL记录中的一个原始细胞外波形如图所示 图6A可在此电压记录中观察到来自不同投射神经元（PNs）的、具有不同幅度的动作电位或峰电位。尽管蝗虫触角叶中存在兴奋性投射神经元和抑制性局部神经元，但只有投射神经元能够产生可在细胞外检测到的钠离子峰电位。3这一观察结果表明，本文介绍的多单元记录技术可用于选择性地监测触角叶回路的输出，从而使蝗虫成为研究嗅觉编码的一种理想的无脊椎动物模型。
图 6B 展示了蘑菇体记录的一个示例。与嗅觉受体神经元（ORNs）和投射神经元（PNs）不同，肯尼恩细胞（KCs）具有较低的基础活动水平，并以稀疏且选择性的方式对气味产生反应。
为了从这些多单元记录中分离出单个神经元的反应，我们使用在 IGOR Pro（W.......
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讨论
大多数感觉刺激会引发分布在多个神经元集合中的组合式反应。因此，要理解大脑神经回路如何表征和处理特定刺激的信息，必须同时监测多个神经元的活动。本文中，我们展示了细胞外多通道记录技术，用于表征昆虫嗅觉通路中前三个处理中枢对气味刺激的反应。需要指出的是，本文所介绍的技术已在先前多项关于嗅觉编码的研究中得到应用，并逐渐成为该领域的标准实践方法3,6,13-17。结合本文所述技术，可建立系统性研究方法，用于探究无脊椎动物嗅觉系统的设计原理与计算机制。在此，我们必须承认Gilles Laurent、Mark Stopfer及其同事所做出的开创性贡献2,3,8,9,13,16,18-21，他们率先采用这些方法揭示并阐明了嗅觉编码中的若干基本原理。
最后值得注意的是，光学技术也已成功用于研究昆虫嗅觉回路中的群体神经活动22-27。尽管当需要同时监测大量神经元的神经活动时，这些光学技术具有优势，但在需要检测单个动作电位的情况下，电生理学技术仍然是“金标准”。
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致谢
作者感谢以下机构对本工作的资助：华盛顿大学生物医学工程系提供的丰厚启动资金、系统神经科学麦克唐奈尔中心的资助、美国海军研究办公室的资助（项目编号：N000141210089）给 B.R.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电生理设备 | |||
| 交流放大器 | GRASS | 型号 P55 | 用于单感器记录 |
| 音频监视器（型号 3300） | A-M Systems | 940000 | |
| 定制16通道前置放大器和放大器 | 加州理工学院生物学电子车间 | 用于触角叶和蘑菇体记录 | |
| 数据采集单元 | 国家仪器公司 | BNC-2090 | |
| 光纤光源 | WPI | SI-72-8 | |
| 115 V 光源 | WPI | NOVA | |
| 手动显微操作器 | WPI | M3301R | 用于蝗虫脑部记录 |
| 带臂架的体视显微镜1 | Leica | M80 | 用于蝗虫脑部记录 |
| 体视显微镜2 | Leica | M205C | 用于单感器记录 |
| 防振台 | TMC | 63-500 系列 | |
| 电动显微操作器 | Sutter Instruments | MP285/T | |
| 示波器 | Tektronix | TD2014B | |
| 电极/制作工具 | |||
| 16通道电极 | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | 用于触角叶记录 |
| 含丝硼硅酸盐毛细管，内径 0.69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | 用于制作玻璃电极 |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| 函数发生器 | 万用表仓库 | SG1639A | 用于电极镀金 |
| 镀金液（无氰化物） | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| 阻抗测试仪 | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | 用于电极镀金 |
| 旋转开关 | Electroswitch | C7D0123N | 用于电极镀金 |
| 脉冲隔离器 | WPI | A365 | 用于电极镀金 |
| Q系列电极夹持器 | Warner Instruments | 64-1091 | |
| 直径 0.010" 的银丝 | A-M Systems | 782500 | 接地电极 |
| 8针双列直插式IC插座 | Digikey | ED90032-ND | |
| 含丝硼硅酸盐毛细管，内径 0.58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| 热风枪 | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 导线 | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| 滴定板摇床 | Thermo Scientific | 4625Q | 用于绞合导线 |
| 碳化钨剪刀，4.5" | 生物医学研究仪器公司 | 25-1000 | 用于切割绞合的四极导线 |
| 尖头镊子 | HECO | 91-EF5-SA | 用于分离四极导线 |
| 气味递送 | |||
| 6 ml 注射器 | Kendall | 1180600777 | 用于定制的活性炭过滤器 |
| 棕色气味瓶 | Fisher | 08-912-165 | |
| 活性炭 | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| 干燥剂 | Drierite | 23005 | |
| Drierite 气体干燥罐 | Fischer Scientific | 09-204 | |
| 热缩管 | 3M | EPS-200 | 用于气味过滤器制备 |
| 带铝制接头的皮下注射针头，19号规格 | Kendall | 8881-200136 | 用于为气味瓶提供进气和出气管路 |
| 矿物油 | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | 用于稀释气味 |
| Nalgene 塑料管，890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | 用于载气输送 |
| 气动皮升级泵 | WPI | sys-pv820 | 用于气味递送 |
| 聚乙烯管，内径 0.86 mm | Intramedic | 427421 | 用于气味瓶出口连接和灌流盐溶液管路 |
| 瓶塞 | Lab Pure | 97041 | 用于密封气味瓶 |
| 时间标记带 | PDC | T-534-RP | |
| 管路鲁尔接头 | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| 真空管 | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| 制备/解剖 | |||
| 100 x 15 mm 培养皿 | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG 多股铜线 | Lapp Kabel | 4510013 | |
| 22 AWG 多股连接线 | AlphaWire | 1551 | 脑部支撑平台 |
| 蜡染蜡 | Jacquard | 7946000 | |
| 牙科边缘蜡 | Henry-Schein Dental | 6652151 | |
| 电热蜡笔 | Almore International | 66000 | |
| 5分钟快速固化环氧树脂 | Permatex | 84101 | |
| 带铝制接头的皮下注射针头 | Kendall | 8881-200136 | |
| 来自Streptomyces griseus的蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P5147 | 用于去除蝗虫脑部鞘膜 |
| 非无菌缝合线 | Fisher | NC9087024 | 用于肠道切除后结扎腹部 |
| Vetbond | 3M | 1469SB | 用于封闭截肢部位 |
| Dumont #1 镊子（粗头） | WPI | 500335 | |
| Dumont #5 钛合金镊子（细头） | WPI | 14096 | |
| Dumont #5SF 镊子（超细头） | WPI | 500085 | 用于去除蝗虫脑部鞘膜 |
| 10 cm 解剖剪刀 | WPI | 14393 | 用于去除腿和翅膀 |
| Vannas 剪刀（细头） | WPI | 500086 | 用于去除角质层、切割前肠 |
| 盐溶液灌流 | |||
| 带流速调节器的延长管组 | Moore Medical | 69136 | 用于调节盐溶液流速 |
| 带Y型注射口的静脉输液管组 | Moore Medical | 73190 | 用于调节盐溶液流速 |
参考文献
- Ache, B. W., Young, J. M. Olfaction: diverse species, conserved principles. Neuron. 48, 417-430 (2005).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. Journal of Neuroscience. 16, 3837-3847 (1996).
- Stopfer, M., Jay....
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重印与许可
