多单位记录方法来描述蝗虫的神经活动（ Schistocerca美洲）嗅觉电路

摘要

我们证明细胞外的多单元的记录技术中的前三个阶段的无脊椎动物的嗅觉路径表征气味诱发反应的变化。这些技术可以很容易地适应以及其他神经系统检查合奏活动。

摘要

嗅觉检测和解释的许多生物的生存是至关重要的。值得注意的是，跨门类的物种都有着惊人的相似嗅觉系统在进化的时间^1，化学传感，生物方法进行了优化。在昆虫的嗅觉系统，增味剂，转嗅觉受体神经元（ORN）的天线，这将化学刺激的动作电位的列车。从ORNs的感官输入，然后转发至触角叶（AL;类似于脊椎动物的嗅球结构）。在AL，神经表征气味采取的形式分布在歌舞团的主要神经元（PNS，也被称为投射神经元^）2,3的时空放电模式。随后处理的AL输出由肯扬细胞（角质形成）在下游蘑菇体（MB），相关联的结构与嗅觉记忆和学习^4,5。她的E，我们提出了电生理记录技术，在这些嗅觉电路的监控气味诱发的神经反应。

首先，我们提出一个单一的感受器记录的方法来研究人口的ORNs ^6,7气味诱发反应。我们讨论使用生理盐水填充尖锐的玻璃吸管作为电极细胞外监控ORN反应。接下来，我们提出了一种方法来使用商业16通道的电极细胞外PN反应。类似的方法使用一个定制的8路双绞线四极管展示了肯扬细胞记录^8。我们提供详细的实验装置，目前这些技术代表记录的痕迹。

方案

1。气味准备工作和实施

1. 稀释在矿物油中的气味的解决方案（体积），以达到所需的浓度水平。存储一个20毫升的混合物，矿物油和的加臭剂，在60毫升的玻璃瓶。成的橡胶止动件（表19），一个从底部和其他从顶部插入两个注射器针头，以提供一个入口和一个出口管线。该橡胶塞密封的玻璃瓶中，并附加一个自定义设计的活性炭过滤器的入口线（ 图1A）。
2. 的碳过滤器是由使用两个6毫升注射器。切一半，丢弃的注射器的柱塞端。与棉和活性炭填充每个剩余的片前，将它们连接在一起使用热收缩管。
3. 出口管线连接的气味瓶（使用聚油管，ID0.86 ​​毫米）到塑料管（的Nalgene FEP套管，ID5.8毫米）提供一个恒定的气流通过天线（ 图1B ）。
4. 直接的碳 - 过滤，除湿后的空气（载气流量为0.75升/分钟），使用的塑料管内放置几个厘米蝗虫天线朝向蝗虫。
5. 对于刺激气味，取代上述的气味在瓶中溶液的静态顶空恒定的体积（0.1升/分钟）。这是通过使用一个小型的泵（WPI，PV-820）注入等量的除湿后的空气进入瓶子。从气味瓶的蒸气被引导通过的气流管（ 图1B）上的出口管线。
6. 取出输送气味的气体，通过放置一个真空漏斗〜10厘米背后的蝗虫天线。

2。准备拍摄单感器的蝗虫天线

1. 选择完全成熟的翅膀，不论男女，一个年轻的成年蝗虫，，但交配前阶段从拥挤的殖民地。为了抑制蝗虫，第一次截肢的腿。密封组织的粘合剂（Vetbond，3M）截肢网站。安全吨他蝗虫一个自定义的设计室搭着一小块电工胶带围绕其胸部（ 图2A）。
2. 在解剖显微镜下，使天线放置在蜡中的平台（ 图2A），一个浅的凹槽。将天线放置入槽中，并使其稳定在两端的天线（ 图2B;一个electrowaxer是用于熔化的蜡）使用蜡染蜡。
3. 接地电极（氯化银线）插入到胸部（〜1厘米的距离，从头部）。使用蜡染蜡到两个密封切口部位和持有的接地线（ 图2A）。

3。单感器监测记录到的气味诱发反应的嗅觉受体神经元（ORNs）

1. 稳定的蝗虫天线放置在立体显微镜下（徕卡M205C）的振动隔离表（TMC）（ 图3A）。请确保记录感器的基础是明确的光年可见（ 图3B）。
2. 使用微管拆卸器（萨特P-1000），制作玻璃电极（阻抗3-10MΩ时，充满了蝗虫盐水，齿顶圆直径1-3微米），使用高硼硅玻璃毛细管（外径1.2毫米，ID0.69毫米）。
3. 玻璃电极放置到一个微量吸移管的保持器，其被安装到机动的微操纵器（萨特MP-285）。轻轻插入电极插入底座的感受器（ 图3B）。需要注意的是每个感器可以包含3-50 ORNs在蝗虫^10。
4. 放大的信号（10000倍），使用一个AC放大器（草P-55）。过滤器0.3 -之间的信号为10.0 kHz和15 kHz的采样率（ 图3D）数据采集系统（LabVIEW软件，PCI-MIO-16E-4数据采集卡，美国国家仪器公司）收购。

4。蝗虫触角叶和蘑菇体的录音解剖程序

1. 关注的restraini的纳克第2.1节中描述的步骤。 图4A和 B所示的蝗虫在定制设计室的位置。
2. 灌注生理盐水后，解剖过程中，建立一个蜡杯左右的蝗虫头。的蜡杯应该从正上方的口部，并超出围绕的两个天线之间的区域，如在图4C中所示的化合物的眼延伸。
3. 为了让天线通过的蜡杯，使用塑料（聚乙烯）管材（5毫米长，ID0.86​​毫米），双方的小隧道。确保塑料管材，可通过滑动的蜡杯。实现，后者是通过使用紧密环绕的塑料管的橡胶垫圈，但被连接到的蜡杯形（ 图4C）。
4. 使用环氧树脂，附加的基础上的触角的塑料管的底端。此步骤可确保天线即使在周围的地方举行角质层除去。
5. 保持从这时开始用生理盐水填充蜡杯。首先通过除去之间的两个天线（与前后轴对齐的矩形的长边）的中心的矩形区域。接着，在天线（ 图4D）的基础上，而不会干扰的化合物的眼睛和角质层去除角质层在相邻区域。
6. 用细镊子，轻轻地取下空气囊和大脑周围的脂肪体。在此步骤结束时，应该清楚地看到蝗虫大脑（ 图4D）。请注意，这个过程中的的嗅觉信息（浅黄色色素沉着）的大脑区域位于两个天线之间。
7. 在蝗虫肠道下方的大脑和身体长度的沿运行。为了防止潜在的不稳定准备的肠道运动，轻轻一拉肠，并把它用细剪刀。做一个小切口在腹部，以上的直肠，取出肠道的通过拉后肠粗钳。为了防止盐水泄漏，配合前腹部的切口部位的缝合线。
8. 使用涂有一层薄薄的蜡，以提升大脑和稳定¹¹ 如图4D所示期间电生理薄的金属丝制成的一个小平台。
9. 昆虫的大脑覆盖由一个薄的绝缘鞘，实验之前需要被移除。若要desheath大脑，轻轻地散布少量的一种酶（0.3-0.4毫克蛋白酶，Sigma Aldrich公司）的表面上使用细钳子⁹的大脑。 〜5-10秒的酶应用后，用生理盐水彻底冲洗大脑。使用超精细镊子轻轻捏，拉套，随后撕毁它打开了记录位置（AL和MB所示的图4E，F）。

5。多单元录音和触角叶蕈状体

1. 放置的蝗虫制剂（ 图5A），在立体显微镜下对隔振表下的悬臂支架暂停。
2. 整个实验过程中保持恒定的盐水灌注率（约0.04升/小时）。使用氯化银线作为接地电极浸没在盐水充注蜡杯。
3. PN录音，使用一个16通道的，硅探头（NeuroNexus技术，项目，中央与特区关系的TET-3MM-150-150-121-A16， 图5B）。每次实验前，电极电镀金实现在200〜300kΩ范围的阻抗。使用图7中所示的电路用于电镀。
4. 定位电极靠近触角叶的表面，并轻轻地插入到使用手动微操纵器（WPI，M3301R）（ 图5D）的组织。
5. 在〜10μm的步骤推进电极。等待2-3分钟，在每一个步骤，并评估收购D信号质量。在一个理想的录制现场，将拿起细胞外信号由多个记录通道，将有一个高的信号噪声比（SNR> 3-5倍，噪音SDS）。
6. 对于KC录音，使用一个定制的双绞线四极管（ 图5C，一步一步的制作过程，在第6）。所讨论的，在步骤5.3，电镀这些电极。 KC胞体被限制的表面层的MB ⁸放置的MB的表面上（ 图5E）的四极管。
7. PN和KC录音可以同时从同一蝗虫制备，如在图5A中示意性地示出。
8. 至少等待15分钟后，发现记录的位置，让稳定的电极。
9. 收购在15千赫之间0.3-6千赫，过滤器，所有细胞外信号放大（10000次）使用的是16通道AC放大器（生物电子商店，加州理工学院，帕萨迪纳，CA）（图6A，B）。

6。 KC录音程序，使绞丝电极

1. 要设计一个多单元的电极为KC录音，使用绝缘镍铬丝（RO800，0.0005"丝^）8。
2. 如果需要8个电极，然后包裹的导线周围的一块长10-15厘米的硬纸板4倍。纸板的端部可以用塑料管覆盖，以防止导线从切割边缘。虽然包装，确保有一点松弛，但保证线未拉紧。小心处理线，因为它打破容易。
3. 一束导线合在一起在纸板的顶部，并用一条胶带（时间带，T-534-RP）保持在一起。切的股线在其另一端。删除钢绞线和组线切端，以及使用另一块的磁带。
4. 使用滴度板振动筛（赛默飞世尔科技，型号4625Q），风绞合在一起（〜72转/分3分钟），以形成一个绞合线。录音股的底部可以夹在滴定板转子和顶部可以夹在一个繁荣的立场。卷绕时，导线应具有稍有懈怠，但不绷紧。
5. 熔体的绝缘层，用热枪（韦勒6966C）坚持个人绞合在一起，形成一个单一的线。 3-4缓慢通行证（3-4秒）的线的长度上应该是足够的，以加热并熔化的绞合在一起。然后松开线的底部，并允许它放松。修剪线附近的两端取出磁带。
6. 一端插入的导线通过一个5-6厘米长，玻璃毛细管（外径1.0毫米，编号0.58毫米）。取笑除了双绞线的一端，用细镊子，非常简要用火焰烧毁年底，除去包衣。这一步必须做仔细的电线暴露在火焰中的时间过长将导致股熔化和纠结。
7. 轻轻分开8股的火烧端一个第二焊每股分别采用8引脚IC插座。外套的IC插座的顶部与环氧持有的股线和玻璃毛细管到位。还放置一小滴的环氧树脂，在其另一端的毛细管按住丝的地方（ 图5C）。
8. 最后，切割导线的前端在一个45度的角度与硬质合金剪刀从毛细管尖端约0.5厘米。

结果

在图3D中示出一个单一的ORN两种不同醇的气味诱发反应。根据记录位置（放置的电极）的多单元录音感器类型，可以实现的。

图6A中所示的原料外从AL记录波形。可以观察到的动作电位或尖峰的幅度变化，来自不同的PN，在此电压跟踪。虽然蝗虫触角叶投射神经元有兴奋和抑制神经元，唯一的PN生成钠尖峰，可以检测到细胞外^3。这一观察表明，这里提出的多单元记录技术可用于选择性地监测的输出的触角叶电路，从而使蝗虫模型研究嗅觉编码一个有吸引力的无脊椎动物。

一个蘑菇体记录的一个例子示于

分离单个单元响应这些多单元录音，我们进行离线秒杀排序（最好的四通道）发布的软件实施:IGOR专业^{（Wavemetrics）12。} PN和KC尖峰分拣的实例示于图6C中 ， 和 D，分别。

讨论

大多数感官刺激，唤起组合分布在歌舞团的神经元的反应。因此，同时监控多神经元活动是有必要了解如何刺激特定的信息在大脑中的神经回路表示和处理。在这里，我们已经证明细胞外多单位记录技术的气味诱发反应的特点前三加工中心以及昆虫嗅觉通路。我们注意到，这里所介绍的技术已嗅觉编码的以前的研究中使用的一些，并成为一个标准的实践在此字段中^3,6,13-17。相结合的技术，这里可以开发一个系统的方法来研究无脊椎动物的嗅觉系统的设计和计算原则。在这里，我们必须认识到由吉尔·洛朗，马克Stopfer，和他们的同事^{2,3,8,9,13,16,18-21}这些approa，谁率先开创性的贡献CHES揭示和阐明的嗅觉编码的一些基本原则。

最后，值得一提的是，光学技术也被成功地用于研究整体活动在昆虫嗅觉电路^22-27。虽然这些光学技术是有利的，当我们的目标是在大量的神经元，同时监测神经活动，电生理技术仍然是'黄金标准'时的个别动作电位的检测所需的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
名称	公司	目录编号	评论
			电设备
AC放大器	GRASS	型号P55	单感器录音的
音频显示器（型号3300）	AM系统	940000
定做16个信道，前置放大器和放大器	卡尔。技术。生物电子商店		AL和MB录音
数据采集​​单元	美国国家仪器公司	BNC-2090
光纤灯	WPI	SI-72-8
光源115 V	WPI	NOVA
手动显微操纵器	WPI	M3301R	蝗虫大脑录音的
Stereomicroscope1繁荣的立场	徕卡	M80	蝗虫大脑录音的
Stereomicroscope2	徕卡	M205C	单感器录音的
振动隔离表	TMC	63-500系列
电动微操作机器人	萨特仪器	MP285 / T
示波器	泰克公司	TD2014B
			电极/建筑工具
16通道的电极	NeuroNexus	中央与特区关系的TET-3MM-150-121	触角叶的录音
高硼硅毛细管长丝，ID0.69毫米	萨特仪器	BF120-69-10	用于制造玻璃电极
微管拉马	萨特仪器	P-1000
函数信号发生器	万用表仓库	SG1639A	镀金电极
镀金溶液（非氰化物）	SIFCO产业	NC SPS 5355
阻抗测试仪	比克电子有限公司	IMP-2	镀金电极
开关旋转	ELECTROSWITCH	C7D0123N	金PLating电极
脉冲隔离器	WPI	A365	镀金电极
Q系列电极持有人	华纳仪器	64-1091
银线直径0.010"	AM系统	782500	接地电极
8引脚DIP IC插座	DIGIKEY	ED90032-ND
高硼硅毛细管长丝，ID0.58毫米	华纳仪器	64-0787	双绞线四极管建设
热风枪	韦勒	6966C
Rediohm-800线	康泰尔精密技术	PF002005
滴度板振动筛	热科学的	4625Q	扭线
硬质合金剪刀，4.5"	生物医学研究INSTR	25-1000	为削减扭曲四极线
细点镊子	HECO	91-EF5-SA	除了戏弄四极管电线
			气味交货
6毫升注射器	肯德尔	1180600777	定制设计的活性炭过滤器
布朗气味瓶	费舍尔	08-912-165
木炭	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
干燥剂	燥石膏	23005
燥石膏气体干燥罐	菲舍尔科学	09-204
热缩管	3M	EPS-200	气味过滤器准备
注射针铝轮毂，计19	肯德尔	8881-200136	用于提供入口和出口管线的气味瓶
矿物油	Mallinckrodt公司化学品	6357-04	气味稀释
NALGENE塑料管材，890 FEP	Thermo Scientific的	8050-0310	载波气体输送
气动picopump	WPI	系统pv820	气味交付
聚乙烯气管内径0.86毫米	Intramedic	427421	气味瓶出口CONNECTI组件和生理盐水丰富的管
瓶塞	实验室纯	97041	密封气味瓶
时间的录像带	PDC	T-534-RP
管的luer	Cole-Parmer公司	30600-66
真空集热管	麦克马斯特 - 卡尔	5488K66
			准备工作/夹层
100×15毫米陪替氏培养皿	VWR国际	89000-304
18 AWG铜绞线	LAPP KABEL	4510013	电线绝缘层被用作橡胶垫片
22 AWG绞合联播线	AlphaWire	1551	大脑平台
蜡染蜡	提花	7946000
牙齿周边蜡，	亨利·施恩牙科	6652151
Electrowaxer	Almore国际	66000
环氧树脂，5分钟	Permatex	84101
注射针铝轮毂	肯德尔	8881-200136
从灰色链霉菌蛋白酶	Sigma-Aldrich公司	P5147	，为desheathing蝗虫大脑
缝合线的非无菌	费舍尔	NC9087024	绑在腹部肠切除后
Vetbond	3M	1469SB	密封是putation网站
杜蒙＃1钳（粗）	WPI	500335
杜蒙＃5级钛金属钳（精）	WPI	14096
杜蒙5SF钳（超精细）	WPI	500085	desheathing蝗虫大脑
10厘米解剖剪刀	WPI	14393	为消除腿和翅膀
Vannas剪刀（精）	WPI	500086	去除角质层，切割前肠，
			盐水绮靡
扩展率流量调节器	摩尔医疗	69136	调节盐水流量
静脉注射设置Ÿ注射部位	摩尔医疗	73190	调节盐水流量