芽殖酵母复制性衰老的连续高分辨率显微观察

摘要

本文介绍了一种微流控装置的操作方法，该装置可在单个出芽酵母细胞的整个复制和/或时间寿命过程中，实现连续、高分辨率的显微成像。

摘要

我们展示了一种简单的微流控装置，可用于在整个寿命过程中追踪单个出芽酵母细胞。该微流控芯片利用母细胞与子细胞之间的尺寸差异，通过一系列微垫结构实现分离。在加载细胞时，由于微垫与盖玻片之间的距离接近酵母细胞的直径（3–4 μm），细胞被截留在微垫下方。加载完成后，培养基持续流经芯片，这不仅在整个实验过程中维持了稳定且可控的环境，同时将不断产生的子细胞冲走——由于子细胞体积较小，无法被保留在微垫下方。该装置对母细胞的保留效率极高，单次实验中可对多达50个独立细胞进行完全自动化的监测，持续达5天或更长时间（如有需要）。此外，芯片优异的光学特性使得在细胞整个衰老过程中均可实现高分辨率成像。

引言

芽殖酵母是衰老研究的重要模式生物¹。直到最近，研究酵母细胞的复制性衰老仍是一个费力的过程，需要采用显微解剖方法，即手动将每个芽体从母细胞上分离^2,3。为解决这一问题，我们近期提出了一种新型的微流控装置，能够在整个生命周期中追踪单个母细胞⁴。

在我们的微流控芯片中，酵母细胞被截留在基于软弹性体的微垫下（参见 图1）。持续流动的培养基会冲走新形成的子代细胞，并为细胞提供新鲜营养。在单次实验中，可全程全自动监测多达50个母细胞的整个复制性寿命。由于微流控芯片具有优异的光学特性，可同时监测酵母细胞生物学的多个不同方面（例如 通过使用荧光蛋白

与传统的解剖方法相比，微流控装置具有显著优势。它能够在整个衰老实验过程中提供明确且恒定的环境。该方法无需昂贵的专用设备，可在配备自动对焦、延时成像功能以及细胞培养温度控制的任何显微镜上运行。微流控芯片的制备与操作可在数天内掌握。此外，细胞可直接从指数生长期的培养物中加载，这一优点优于另一种 recently published 微流控方法⁵，后者需要对母细胞进行生物素标记^a。结合高分辨率成像，本文所述方法能够以前所未有的方式测量酵母衰老过程中细胞形态、蛋白质表达及定位的渐进....

方案

1. 硅片模具的制备与加工

微流控芯片由通过软光刻技术制备的硅片模具制成。这些硅片可重复使用多次以制备微流控芯片。建议由专门从事微流控技术的团队来制备相应的硅片模具⁶。

晶圆采用两步光刻工艺制成，使用两层不同的负性光刻胶SU-8⁷。底层用于形成细胞捕获区域（SU-8 2002；高度3-4 μm），而通道则由顶层制成（SU-8 2010；高度10 μm）。晶圆制备过程的示意图可参见Huang et al⁸。微流控芯片的设计图可向作者索取，同时可获取有关如何获得相应晶圆的建议。

1. 获得晶圆后，用解剖刀将 Tough-Tag 切成约 0.5 mm × 3 mm 的细条，小心地将其放置在晶圆上，位置略高于进样通道与微垫阵列之间的通道结构（图 2A）。这将在每块芯片中形成一个较大的附加通道，该通道不仅在细胞加载过程中使用，对于微流控装置的稳定运行也至关重要。
2. 用双层铝箔覆盖玻璃培养皿，并将晶圆放入培养皿中。铝箔可防止 PDMS 渗入晶圆与玻璃培养皿之间。若 PDMS 渗入晶圆与玻璃培养皿之间，晶圆将永久固定在培养皿中。尽管晶圆仍可使用，但若培养皿破裂则无法更换，且后续还需将 PDMS 切除。

2. 微流控芯片....

结果

在本实验方案中，细胞直接从对数中期培养物中加载至微流控芯片。为了确定被困在微流控芯片中的细胞的年龄分布是否与加载前的培养物相似，使用与FITC偶联的小麦凝集素（WGA-FITC）对细胞进行染色，以观察芽痕。如图3所示，细胞在微流控芯片微垫下方的滞留并未偏向特定年龄的细胞。

通过计数单个母细胞产生的芽体数量，即可简单测定复制性寿命。通过绘制存活细胞百分比与芽体数量的关系曲线，可将该数据转化为寿命曲线。可采用Kaeberlein等所使用的统计学方法进行分析。 等⁹可用于比较不同实验中的寿命数据。 图4 显示了野生型BY4741酵母菌株及两种突变体的寿命曲线示例sir2Δ fob1Δ

视频 1 野生型 BY4741 酵母细胞在 YPD 培养基上生长的延时视频。图像每 10 分钟采集一次。该细胞在死亡前共产生 30 个芽体。比例尺：5 μm。

讨论

本文所述的微流控方法是衰老研究中一种重要的新型工具，它能够简便、自动地生成酵母复制性寿命数据，并结合连续的高分辨率成像。这些特性相较于传统的显微解剖方法在实验能力上实现了显著提升，但该方法仍存在一些局限性，需予以考虑。

请注意，所测定的复制寿命可能受到母细胞滞留效率的影响：每个在微垫下保留的细胞都有一定概率被冲洗出芯片例如 邻近细胞的出芽可能会将其从微垫上推开）。细胞被冲洗出去的累积概率随着寿命的延长而增加。因此，短寿命细胞在被冲走之前完成其生命周期的可能性高于长寿命细胞。微流控装置获得相似寿命数据的事实表明⁴ 与经典的显微解剖方法一样^11-13 表明该潜在问题即使存在，也仅为轻微或无关紧要。

需要注意的是，与传统的显微解剖方法不同，使用微流控装置无法在实验开始时选择新生的子代细胞。然而，当将来自对数生长期液体培养物的细胞加载到芯片中时，所加载的大多数细胞为新生或相对年轻的细胞即 约54%的细胞此前从未出芽，约27%出芽一次¹⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DC Sylgard 184 弹性体	Mavom bv	1060040	本包装包含PDMS基础剂和PDMS固化剂。
玻璃培养皿 120/20 mm	VWR International	391-2850
盖玻片 22×40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
铝箔
一次性塑料杯
5 ml 移液管	VWR International	612-1245
透明胶带	VWR International	819-1460
Baysilone 膏体（GE Bayer 硅酮）	Sigma-Aldrich	85403-1EA
PTFE 微孔管，0.012"ID × 0.030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	简称细管
Tygon 微孔管，0.030"ID × 0.090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	简称粗管
手术刀	VWR International	233-5334
50 ml 鲁尔锁注射器	BD	300137
5 ml 注射器，鲁尔接头	VWR International	613-1599
镊子	VWR International	232-2132
20 号鲁尔短管接头	Instech Solomon	LS20
注射器滤器（孔径 0.20 μm）	Sigma-Aldrich	16534K
不锈钢导管塞，20 号 × 12 mm	Instech Solomon	SP20/12
培养皿	VWR International	391-0892
设备
台式紫外臭氧清洗仪	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
SU-8 硅模板（晶圆）			自制；详情请联系通讯作者
天平	Sartorius corporation	ED4202S
真空泵	KNF Neuberger	N022 AN.18
干燥器	VWR International	467-2115
加热板	VWR International	460-3267
可选：盖玻片（22×40 mm）金属支架			自制；详情请联系通讯作者
（荧光）显微镜，配备 60 倍物镜、自动对焦、延时成像功能，最好带有自动化（电动 XY 控制）载物台	Nikon	Eclipse Ti-E