在芽殖酵母连续高分辨率显微观察复制性衰老

Summary

在这里，我们描述了一个完整的复制和/或按时间顺序寿命期间的单芽殖酵母细胞允许连续和高分辨率的显微成像的微流体装置的操作。

Abstract

我们展示了使用一个简单的微流控设置，单芽殖酵母细胞可以在其整个生命周期跟踪。利用微流控芯片使用数组micropads的母亲和女儿细胞之间的大小差异。在加载时，细胞下面这些micropads，被困的的micropad和盖玻璃之间的距离，因为类似的酵母细胞（3-4微米）的直径。的加载过程后，培养液中连续冲洗通过芯片，它不仅在整个实验中，创建一个常数和定义的环境，但也刷新新兴的子细胞，后者由于其更小的尺寸下面的焊盘不保留。设置如此有效地保留了母细胞，在一次实验中，最多50个单个单元格可以监测在一个完全自动化的方式，连续5天，或者，如有必要，更长。此外，该芯片的优异的光学性能允许高高分辨率成像在整个老化过程的细胞。

Introduction

芽殖酵母是一种重要的模式生物衰老研究^1。直到最近，研究在酵母细胞中复制老龄化是一个艰苦的过程，需要解剖的方法，其中每个芽母细胞^2,3手动删除。为了解决这个问题，我们最近提出了一种新的微流体设置能够跟踪个人母细胞在其整个寿命^4。

在我们的微流控芯片，酵母细胞被困在软弹性micropads（ 见图1）。的连续流动的介质冲走新形成的女儿细胞，并提供新鲜的养分的细胞。在一次实验中，高达70母细胞可以监测在一个完全自动化的方式在其整个的复制寿命。由于微流体芯片的优异的光学性能，它可以同时监测不同方面的酵母细胞生物学（ 例如 的使用荧光蛋白）。

古典夹层法相比，微流控的设置提供了巨大的优势。它确保了明确和稳定的环境下进行在整个老化实验。它不需要昂贵的专用设备，并可以运行在任何显微镜配备自动对焦和时间推移能力以及温度控制细胞培养。微流控芯片的生产和经营的，可以学到在几天之内。此外，细胞可以被直接加载从指数生长培养，另一个最近发表的微流控方法^5，这需要母细胞的生物素化的优点在于比高分辨率成像，在这里描述的方法可以用来测量逐步改变^一个结合在酵母细胞形态，蛋白质表达和定位以前所未有的方式老化。能力长期监测单细胞酵母细....

Protocol

1。硅片模具的生产和制备

微流控芯片的创建软光刻模具生产的硅片。这些晶片可多次重复使用，以生产微芯片。可取的做法是执行各自的晶片的生产由一组专门在微流控^6。

的晶片是由在两个步骤的光刻工艺，使用两种不同的负光致抗蚀剂层，SU-8 ^7。底部层是用来产生细胞俘获区（SU-8，2002;高度3-4微米），而频道与顶层（SU-8 2010，高度为10μm）。 Huang 等人 ⁸可以发现在晶片生产过程中的印象。微流控芯片的图纸可以从作者的意见如何获得相应的晶片。

1. 一旦获得晶片，切一块艰难的标签诠释ö薄带约0.5毫米，3毫米，用解剖刀，并仔细地将它们放置在晶片上稍微的信道结构的顶部之间的入口通道和micropad的阵列（ 图2A）。这将导致在一个大的附加信道，这将不仅可以用于在细胞装载过程中在每个芯片的形成，但同样重要的是微流体装置的稳定运行。
2. 用双层铝箔覆盖玻璃培养皿中，并把晶片的陪替氏培养皿中。铝箔将防止PDMS之间的晶片和陪替氏培养皿中运行。如果PDMS蠕变之间在晶片和玻璃培养皿中，晶片将成为永久地固定在陪替氏培养皿中。虽然晶片仍然是可用的，它不会是可能的，用以代替玻璃培养皿中，如果它打破，将需要被切出之后的PDMS。

Results

在这个协议中，细胞被装入微流控芯片，直接从指数中的文化。被困在微流控芯片的细胞的年龄分布，以确定是否是类似文化装货前，细胞染色小麦凝集素结合FITC（WGA-FITC）可视化芽痕。在图3中可以看出，细胞包封微流体芯片micropads下不偏细胞的目标年龄。

自我复制的寿命可以简单地确定计数芽是由一个单一的母细胞的数量。此数据被变换成的寿命曲线绘制的反对数​​产生的芽的存活细胞的百分比。统计测试，如那些由Kaeberlein， 等^。9，可以用来比较的寿命数据，从不同的实验， 图4示出一个例子的寿命曲线获得一WT BY4741酵母菌株和两个突变体（SIR2Δ，Δfob1）。

电影1时间推移电影单一的WT BY4741 YPD培养基上生长的酵母细胞。图片每10分钟。细胞产生一共有30个芽，它死之前。比例尺，5微米。

Discussion

这里所描述的微流体方法是一个重要的新工具，在老龄化的研究，因为它使酵母复制寿命数据相结合的简单和自动化生成连续的高分辨率成像。这些属性是经典的夹层法在实验的可能性的重大改进，但需要加以考虑的方法，该方法也有一些局限性。

请注意，所确定的复制寿命可受保留母细胞:下micropad保存的每一个细胞的效率有一定概率被冲刷掉从芯片（ 例如相邻小区的出芽细胞可以把它相差的micropad）​​。集成的一个单元格的概率被冲刷掉的增加而增加的寿命。因此，它更可能是短命的细胞比长寿命的细胞被冲走之前，完成其生命周期。事实上，类似的立显微切割方法与经典^11-13生成的微流控设置⁴ fespan数据表明，这个潜在的问题是只有轻微的，即使不是无足轻重。

重要的是要注意，与微流体设置选择原始的子细胞，在实验开始时，在经典的夹层法是不可能的。然而，当加载到芯片从成倍增长的液体培养细胞，加载的细胞多数刚出生的或相对年轻（ 即约54％的细胞永远不会发芽前和一次27％.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
DC Sylgard 184 弹性体	Mavom bv	1060040	该包装包含 PDMS 基料和 PDMS 固化剂。
玻璃培养皿 120/20 毫米	VWR International	391-2850
盖玻片 22x40 毫米	CBN 实验室供应商 BV	190002240
Tough-标签	Sigma-Aldrich	Z359106
铝箔
一次性塑料杯
血清学移液管 5 ml	VWR International	612-1245
透明胶带	VWR International	819-1460
Baysilone 糊剂（GE 拜耳有机硅）	Sigma-Aldrich	85403-1EA
PTFE 微孔管，0.012 英寸内径 x 0.030 英寸外径	Cole Parmer	EW-06417-11	简称薄管
Tygon 微孔管，0.030 英寸内径 x 0.090 英寸外径	Cole Parmer	EW-06418-03	称为厚管
手术刀	VWR International	233-5334
50 ml 鲁尔-洛克注射器	BD	300137
5 ml 注射器，鲁尔尖	VWR International	613-1599
镊子	VWR International	232-2132
20 号鲁尔短管	Instech Solomon	LS20
针式过滤器（孔径 0.20 &μ;m）	Sigma-Aldrich	16534K
不锈钢导管塞，20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
培养皿	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
台式紫外线臭氧清洁剂	NOVA Scan	PSD-UVT
哈佛泵 11 精英	哈佛仪器	70-4505
SU-8 硅母模（晶片）			自制;有关详细信息，请联系通讯作者
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
真空泵	KNF Neuberger	N022 AN.18
干燥器	VWR International	467-2115
热板	VWR International	460-3267
可选：盖玻片金属支架 （22x40 mm）			白手起家;有关详细信息，请联系通讯作者
（荧光）显微镜，具有 60 倍物镜、自动对焦、延时功能，最好是自动（电动 XY 控制）载物台	Nikon	Eclipse Ti-E