小鼠心房与心室心肌细胞的分离及Kv通道记录

摘要

Kv 通道功能障碍与心律失常相关。为了研究导致此类心律失常的分子机制，我们采用一种系统性方案，从 Kv 通道辅助亚基基因敲除小鼠中分离心房和心室心肌细胞。分离后的心肌细胞可立即用于细胞电生理学研究、生物化学或免疫荧光（IF）检测。

摘要

KCNE 基因编码一组小型的 Kv 通道辅助亚单位，这些辅助亚单位可与 Kv 通道 α 亚单位形成异源多聚体复合物，从而调节其功能特性。在患有心律失常（如长 QT 综合征和/或心房颤动）的患者中已发现 KCNE 基因的突变。然而，导致这些疾病的精确分子病理生理机制仍不明确。在以往的研究中，这些基因致病突变的电生理特性主要在异源表达系统中进行研究，我们无法确定所报道的效应是否可直接转化为原代心肌细胞中的真实情况。因此，在我们的实验室中采用了一种不同的方法。我们通过细胞电生理技术直接研究 KCNE 基因敲除小鼠分离的心肌细胞中 KCNE 基因缺失的影响——这是一种独特的技术，本文在《可视化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments）中对此进行描述。通过主动脉插管，将基因工程改造的 KCNE 小鼠心脏迅速摘除并安装到 Langendorff 装置上。使用 EGTA 结合心肌组织中的游离 Ca²⁺，随后通过逆行灌注含有胶原酶的特制低 Ca²⁺ 缓冲液，实现心肌细胞的分离。然后可通过显微外科技术分离心房、游离右心室壁和左心室。钙离子随后通过多步洗涤程序逐步重新加入到分离的心肌细胞中。在分离后的最初 6 小时内，立即对形态健康且无自发性收缩的心房和心室心肌细胞进行膜片钳技术或其他生物化学分析的电生理学检测。

方案

1. 动物麻醉与器官采集

1. 通过腹腔内（i.p.）注射 Ketamine（200 mg/kg 体重）和 Xylazine（20 mg/kg 体重）使小鼠麻醉。
2. 为防止血液凝固和血栓形成，进行腹腔内注射 250 IU 肝素（Heparin）以实现抗凝。
3. 等待小鼠进入深度麻醉状态，该状态以无反射为特征。可通过轻触角膜检测角膜反射，或通过夹尾检测逃避反射，以确认无反射状态。
4. 将小鼠转移至手术台，并以仰卧位固定。
5. 在剑突下方切开皮肤和腹壁，行双侧开胸术（clamshell thoracotomy）：沿肋弓向两侧延伸切口，随后在腋中线处剪断肋骨，将胸廓向上翻转。
6. 打开心包，定位大血管。轻压心脏尾侧以更清晰地暴露主动脉。使用镊子夹住主动脉。
7. 将心脏置于剪刀的凹槽内，一次性切断所有连接血管。注意保留足够长度的升主动脉，以便进行 Langendorff 插管。
8. 立即将离体心脏转移至盛有冰浴且预先充氧的溶液 1 的培养皿中（溶液配方见 表 1）。

2. 心脏准备与朗格多夫灌流

1. 用1.8F钢制插管插入股动脉，注意避免空气栓塞。
2. 用外科缝线将主动脉固定在插管上，并用1 ml溶液1冲洗冠状动脉。
3. 将插管连接至Langendorff装置。
4. 确保从开胸至完成Langendorff插管的时间不超过120秒，以避免心肌发生长时间的缺血/再灌注损伤。
5. 以4 ml/min流速用10 ml无Ca²⁺的溶液2灌注心脏。
6. 以4 ml/min流速用胶原酶溶液3灌注心脏8分钟。

3. 心脏心腔的显微外科分离

1. 将心脏转移至含有低 Ca²⁺ 溶液 4 的预热 100-mm 培养皿中。
2. 用剪刀小心去除主动脉及其他非心脏组织，并弃去。
3. 分离心房与心室，分别对每个心腔进行后续操作。保持细胞浸没在溶液 4 中。使用小体积溶液（少于 5 ml）。

4. 心肌细胞的进一步解离

1. 心房心肌细胞：
   1. 将心房组织转移至单独的预热100 mm培养皿中，用精细镊子轻轻撕扯以分离组织，从而获得单个心房心肌细胞。确保组织几乎完全解离。
   2. 使用带有经火焰抛光并扩大的塑料吸头的1 ml移液器，将细胞悬浮于1 ml溶液5中，孵育5分钟。
   3. 使用细胞滤网（200 μm孔径）去除细胞碎片，分离细胞。
   4. 向细胞悬液中加入5 ml溶液5，室温下以16 × g离心2分钟。
   5. 以下步骤在细胞培养罩内操作。弃去上清液，将沉淀重悬于5 ml溶液6中。
   6. 在15 ml离心管中静置沉降10分钟后，室温下以16 × g离心1分钟。弃去上清液。根据细胞数量，将细胞重悬于1–5 ml溶液6中。
2. 心室心肌细胞：
   1. 在5 ml溶液4中，用精细镊子解剖感兴趣的左心室区域。
   2. 通过轻柔吹打使细胞悬浮，直至大部分细胞分离。将过滤后（200 μm孔径）的细胞悬液转移至50 ml离心管中，并加至25 ml体积。
   3. 室温下以16 × g离心2分钟。
   4. 以下步骤在细胞培养罩内操作。弃去上清液，将沉淀重悬于25 ml溶液6中，静置沉降10分钟。
   5. 计数细胞后弃去上清液，向细胞沉淀中加入25–50 ml溶液6。

5. 用于细胞电生理学、生物化学或免疫荧光研究的心肌细胞制备

1. 电生理学研究时，将心肌细胞置于50 ml离心管中的溶液6中，并防止沉降。
2. 用于生化研究， 例如 钙成像，将心肌细胞接种于层粘连蛋白包被的细胞培养皿中（层粘连蛋白终浓度为20 μg/ml，溶于PBS）。
3. 进行免疫荧光染色时，准备一个细胞培养皿，内含经玻璃盖玻片铺板并涂覆层粘连蛋白溶液的培养板（层粘连蛋白在PBS中的终浓度为50 μg/ml）。
   1. 铺板心肌细胞前去除溶液。使用显微镜观察并控制细胞密度。
   2. 让心肌细胞在37 °C、2 % CO条件下于盖玻片上贴壁1小时₂，移除溶液后立即开始标准染色程序。
   3. 用固定剂孵育， 例如 4% PFA（PBS，pH 7.5）中室温固定10分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
   4. 用含10%血清、0.3% Triton、0.2% BSA的PBS溶液在室温下孵育心肌细胞30分钟，以实现细胞通透并抑制非特异性抗体结合。
   5. 在37 °C下与一抗孵育1小时，并按前述方法洗涤。
   6. 室温下与二抗孵育1小时。使用DAPI和荧光素偶联的鬼笔环肽（Alexa Fluor 488，Invitrogen）对细胞核和α-肌动蛋白进行复染。
   7. 洗涤后，将玻璃盖玻片小心转移至经硅烷处理的载玻片上，并将细胞封埋于荧光封片剂中。

6. 细胞电生理学

1. 在室温下对 freshly isolated 的心房和心室心肌细胞进行全细胞膜片钳记录。
2. 将形态健康的心肌细胞转移至灌流 chamber，其中加入已知体积的细胞外灌流液（117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH）。₂PO₄，4 mM NaHCO₃₃，1.7 mM MgCl₂，3 mM CoCl₂，10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖和 0.02 mM 河豚毒素（TTX），（pH 7.4）。使用 NaOH 调节 pH 值。
3. 使用合适的膜片钳设备（即 IX71 倒置显微镜、Multiclamp 700B 放大器、Digidata 1440A 采集系统及配备 pClamp10.3 软件（Molecular Devices）的计算机。
4. 使用充满含有130 mM KCl、2 mM MgCl的细胞内溶液时，膜片钳电极的阻值应为3-5 MΩ₂，11 mM HEPES，11 mM EGTA，5 mM Na₂ATP，0.4 mM Na₂GTP，5 mM Na₂CP 和 4.9 mM CaCl₂ （pH 7.2）。使用 KOH 调节 pH 值。
5. 在−70 mV的钳制电位下，先给予20毫秒的−40 mV预脉冲，随后以10 mV为增量，从−60 mV至+50 mV进行4.5秒的电压阶跃，以诱发外向K⁺电流。
6. 确保漏电流始终 <100 pA
7. 为分离不同的 K+ 电流，使用特异性抑制剂，例如 4-氨基吡啶（4-AP；ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA）、Heteropodatoxin 2（HpTx2；Alomone）或四乙基铵（TEA；Sigma）。储备液应以细胞外灌流液配制，并在“基线”记录后通过微尖管直接施加至细胞最近的周围区域。施加药物后应给予 2–3 分钟平衡时间，再进行“药物”记录。
8. 将单个细胞的电流幅值归一化为细胞大小（全细胞膜电容）进行分析。使用 pClamp10.3 软件（Molecular Devices）或类似软件离线分析数据。

结果

从基因工程小鼠中分离成年小鼠心肌细胞以研究特定目的基因的功能 体外 已成为深入理解心脏病理生理学的有力工具。目前，全球仅有少数但逐渐增多的基础科学研究实验室正在使用该方法。然而，成年小鼠心室心肌细胞的分离过程较为复杂，需由经验丰富的人员彻底且反复地操作。 图1 显示 freshly isolated 的典型心房和心室心肌细胞。对于心室心肌细胞，我们建议仅使用杆状、有横纹、外观健康且无自发性收缩的心室肌细胞。与心室肌细胞相比，心房肌细胞更短且更细。成年小鼠心房心肌细胞缺乏心室心肌细胞所具有的典型横纹和杆状形态。从完整小鼠心脏中分离得到的心室心肌细胞产量为 5x10⁵ - 1×10⁶对于心房心肌细胞，其数量显著较少。通常我们预期从一只小鼠心脏中可分离得到约5,000至25,000个心房细胞。分离后，心肌细胞可进行不同处理 体外 包括电生理记录在内的技术（图1建议在分离后6小时内使用分离的心肌细胞。 图1 显示通过全细胞膜片钳技术，由不同去极化阶跃诱发的 心房和心...

讨论

随着用于研究心脏功能及与基因敲除相关心脏病理学的转基因小鼠品系的不断发展，人们对采用专门方法来研究特定基因敲除效应的兴趣也在日益增加 体外在我们的实验室中，我们研究一组Kv通道辅助亚单位在心脏复极化过程中的作用。 KCNE 基因包含一个由5个基因组成的家族（KCNE1-5在人心室和心房复极化过程中发挥重要作用 ^{11, 15}. KCNEs 是单次跨膜结构域的Kv通道辅助亚单位，其自身无法介导任何钾离子电流，但可与Kv通道α亚单位形成复合物，显著调节后者在门控、电导、药理学特性及细胞内转运等功能特性。突变及常见多态性在 KCNE2 例如与遗传性和获得性长QT综合征（LQTS）相关 ^{1, 16}.

20世纪90年代，圣路易斯华盛顿大学的Nerbonne博士团队率先开展了不同Kv通道α亚基的分离与电生理学表征研究，并阐明了这些亚基在大鼠及小鼠心室和心房复极化过程中的作用。 ^{3, 5, 7}然而，关于 Kv 通道辅助亚基在啮齿类动物心肌心房和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
河豚毒素	Alomone
4-氨基吡啶	ICN Biomedicals
异孔毒素 2	Alomone
四乙基铵	Sigma Chemicals
胶原酶 II 型	Worthington