脊柱稳定对于减少变异性和产生一致的实验性脊髓损伤至关重要。 通过使用定制的稳定装置与NYU/MASCIS撞击器联合操作，我们在此展示了在成年大鼠中建立可重复的颈段（C5）半挫伤性脊髓损伤所需的正确设备和操作步骤。
本文内容
摘要
摘要
临床相关的动物颈椎脊髓损伤（SCI）模型对于开发和测试潜在疗法至关重要；然而，由于缺乏令人满意的椎体固定方法，制备可靠的颈椎SCI模型十分困难。传统的脊柱固定方法是通过夹子夹住颈椎棘突，悬吊颈椎的头端和尾端进行固定。 然而，由于颈椎棘突过短，夹子无法有效固定，因此在挫伤过程中无法防止组织移位，导致该固定方法失败（图1）。 本文介绍一种可在损伤节段水平完全固定颈椎的新方法。 该方法能有效减少损伤部位脊柱的移动，显著提高SCI模型的一致性和可重复性。 我们提供了相关设备（图2-4）、方法及操作步骤的可视化描述，以实现成年大鼠第五颈椎（C5）的稳定固定，进而实施椎板切除术（图5）并制造挫伤性SCI。 尽管本文仅以NYU/MASCIS撞击器为例演示了颈椎半侧挫伤模型，但该椎体固定技术也可应用于脊髓其他节段，或适配于其他SCI造模设备。 通过椎体固定改善脊髓的暴露与固定效果，可能对制备一致且可靠的脊髓损伤模型具有重要价值。 该椎体固定方法还可用于神经生物学研究中的立体定位细胞或示踪剂注射，以及双光子显微成像等实验。
引言
对目标脊髓组织施加一致且可重复的机械力，对于减少功能和组织学上的变异性以及建立成功的挫伤性脊髓损伤（SCI）模型至关重要1-7。 施加于脊髓目标区域的力的大小取决于所采用的脊柱固定方法。 在撞击柱与脊髓接触过程中，目标脊柱的位置移动会改变最终的损伤力。 与其他类型的SCI模型相比，颈段挫伤性SCI模型具有更高的临床相关性，因为约50%的人类SCI病例发生在此节段8，并且已有多个研究采用动物颈段损伤模型开展SCI研究9-14。 尽管挫伤性SCI模型通常通过夹持损伤部位前后节段的棘突来实现一定程度的固定，但该方法在制备颈段SCI时存在困难。 如本演示所示，我们所开发的固定方法在提高挫伤损伤的质量和可重复性方面具有优势。 特别是，该椎体固定方法的建立旨在弥补其他模型存在的不足与挑战：1）在撞击力作用下，通过夹持椎板切除术上下相邻的背侧棘突进行固定时，可能出现椎体屈服程度的变异。椎体移动的程度取决于撞击点与被固定椎体之间所跨越的椎间关节数量（图1），因此涉及的关节数越多，脊柱的稳定性越差；2）背侧棘突较为脆弱，容易因棘突骨折或夹具滑脱而导致夹持失败；3）与胸椎相比，C3至T1节段椎体的棘突极短，使得传统夹具难以有效抓握棘突以实现颈椎的稳定固定。
本文介绍了一种用于在成年雌性Sprague-Dawley大鼠中建立C5节段挫伤性脊髓损伤（SCI）的新型脊柱稳定方法。 该方法也可用于脊柱及其他脊髓节段的稳定， 并可与多种其他挫伤性SCI装置良好结合使用，包括纽约大学/多中心动物脊髓损伤研究组（NYU/MASCIS）撞击器15（图2）、Precision Systems and Instrumentation, LLC公司的Infinite Horizon（IH）装置16、俄亥俄州立大学电磁脊髓损伤装置1以及路易斯维尔损伤系统装置（LISA）17，因而可在脊髓损伤研究中广泛使用。
方案
1. 暴露颈椎椎板
- 使用70%乙醇清洁手术台面，并用加热垫预热。在手术区域放置无菌纱布、棉签和高压灭菌的手术器械前，先用无菌手术单覆盖台面。 手术间歇期间使用微珠灭菌器对手术器械进行灭菌。
- 通过腹腔注射（IP）给予大鼠氯胺酮（87.7 mg/kg）和赛拉嗪（12.3 mg/kg）进行麻醉。 当动物对脚趾夹捏刺激不再产生反应时，表明已达到适当的麻醉深度。 在手术开始前，皮下注射0.01–0.05 mg/kg丁丙诺啡和5 mg/kg卡洛芬。 术后前4–7天内，丁丙诺啡应每8–12小时给药一次 ，卡洛芬每日给药一次。
- 在动物眼部涂抹保护性眼膏，以防止手术期间角膜干燥。
- 使用电动剪刀剃除大鼠背部从胸中部至头部后方的手术区域毛发。 使用配备HEPA过滤器的真空装置清除剃下的毛发。
- 在剃毛区域涂抹聚维酮碘溶液进行手术部位消毒，然后用70%异丙醇擦拭清洁该区域。
- 使用手术刀片从头部基底部向尾侧至胸中部做一条3–4 cm的正中切口。
- 在颈部下部位于冬眠腺前方的筋膜和皮下肌肉中确定正中线；沿正中线切开斜方肌及其他肌肉，以减少出血。
- 找到肌肉下方两处脂肪组织的正中线；严格沿正中线向尾侧切开椎旁肌，并使用小型组织牵开器分离肌层，直至暴露胸椎T2棘突水平。
- 识别并切除连接于T2棘突的肌肉，以便将此结构作为解剖学标志。
- 切除T2棘突的软骨尖端，以改善颈椎的视野可见性。
- 将椎旁肌从C4–T1节段的棘突和椎板向两侧分离；但应保留C3椎板上的肌肉覆盖，以防止出血。
- 从C4–T1节段的椎板上方肌肉开始，向脊柱两侧的关节突方向进行横向切开。
- 暴露脊柱椎板后，将动物置于稳定器的U形槽中，使其处于腹侧朝下的体位。
- 从T2解剖标志开始，向前（头侧）依次计数棘突，依次为T1、C7、C6，最终确定C5椎体的位置。
2. 固定椎骨并实施撞击损伤
- 将稳定器的两个不锈钢臂置于 C5-6 椎骨侧块下方，以悬挂动物，使臂的锯齿边缘位于侧块下方（图 1C）。 固定好带有椎骨的臂部后（图 2B），调节稳定装置，确保脊柱处于水平且居中的位置。 最后，通过拧紧稳定器的拇指螺丝将臂部锁紧。
- 剪开 C4-5 和 C5-6 节段棘突与椎板之间的韧带，以确定 C5 椎板的边界。
- 使用微型咬骨钳，按脊髓损伤（SCI）设计意图，切除右侧 C5 节段一半的椎板（图 5C-E）。 完成椎板切除术后，将带稳定器的动物转移至损伤装置下方。 将动物连同稳定器一起固定在支架上（图 3A-C），利用侧向微操纵器（图 3）精确对准脊髓目标位置的撞针。
- 在高倍放大下，无需切开硬脑膜，即可在暴露的脊髓背侧表面定位 C5 和 C6 背根进入区（DREZs）。 将撞针对准两个已识别 DREZs 的中点，并位于脊髓中线与外侧边缘之间的中点位置（图 5B）。
- 使用带有直径为 2.5 mm 撞击头的 NYU/MASCIS 撞击装置（图 3A & B），通过 10 g 撞击杆从 12.5 mm 高度下落（图 2A），造成 C5 节段半侧挫伤 （图 5B & E）。
- 通过观察脊髓上的瘀斑（图 5E，箭头）直观验证损伤，并核对 NYU 软件提供的损伤参数12,17 （图 6）。
- 用无菌 4-0 薇乔缝线缝合肌肉和软组织，然后用外科缝钉（EZ Clips）闭合皮肤切口。
- 在手术部位涂抹抗菌软膏。
- 皮下注射 5.0 ml 无菌 0.9% 氯化钠溶液，以补充动物水分。
- 将动物置于温控环境中（加热垫上的循环热水垫笼），在垫料上提供湿润食物（每日更换），并在笼底放置带有长管嘴的饮水瓶以便取用。 提供护理以确保动物充分恢复，再将其送回饲养笼中。
- 由于这是单侧颈段挫伤性损伤，动物同侧前肢功能可能会暂时丧失，但在伤后数周内开始恢复。 然而，对侧功能应保持完整，因此动物应能正常进食饮水，且仅在运动和理毛行为方面存在轻微障碍。
结果
按照本方案操作后，可产生稳定且可重复的颈段半横断脊髓损伤（图5 和 图6）。通过使用椎体稳定器固定拟造成脊髓损伤节段的同水平椎骨横突，可获得满意的效果。采用该方法时，不仅目标节段C5椎体，而且相邻的C4和C6椎体也被牢固固定。
NYU/MASCIS 软件提供带有 x 轴和 y 轴的图形化读数，并支持我们采用的椎体稳定方法及相关设备（图 6）。该稳定方法可减少因目标组织和脊柱向下移位所导致的损伤变异（图 1）。损伤后，在 C5 与 C6 脊髓背根进入区（DREZ）之间可见清晰的单侧青紫色血肿（图 5E）。根据 NYU/MASCIS 软件提供的读数，这些损伤参数在各实验动物之间具有一致性（图 6）。
由于颈段半挫伤会导致明显的前肢功能障碍，该模型非常适合评估前肢功能，如抓取、理毛13和物体操控能力18-19。由于后肢运动功能障碍较轻，Basso、Beattie 和 Bresnahan（BBB）运动功能评分量表4不适用于此模型。损伤后的功能表现最显著的是同侧前爪伸肌功能障碍，表现为大鼠所有指头屈曲，形成“杵状”拳18。在正确实施损伤的前提下，所有接受相同损伤程度和脊髓节段损伤的动物，其同侧前肢应表现出与本方案所示相似的功能缺陷。若损伤操作不当，动物可能出现截然不同的功能障碍表现形式和持续时间13,18。
组织学上，该模型在损伤中心以及损伤部位的头侧和尾侧均产生广泛的灰质和白质损伤，导致明显的病灶和空洞形成，这些病变几乎完全局限于脊髓的损伤侧。在病灶边界处形成一个主要由星形胶质细胞构成的大型胶质瘢痕，并伴有大量神经元死亡18。
图1：使用不同夹持方法时挫伤性脊髓损伤过程中脊柱柔韧性的示意图。图A 和 B 显示了当棘突从背侧被夹紧时脊柱的柔韧性或“屈服”现象，这可能导致撞击不准确并产生不一致的数据。图A所示情况在受到撞击时表现出更大的柔韧性（红色虚线和较大的弯曲箭头），而图B所示情况（较小的弯曲箭头）柔韧性较小，因为夹具距离椎板切除和损伤部位更远。图C展示了使用本文所述装置进行侧向稳定的情况，其中稳定臂牢固地固定在将要实施撞击部位的椎骨横突下方。在此操作过程中，目标椎骨得到完全固定，脊柱无任何柔韧性。
图2：NYU/MASCIS撞击器及定制稳定容器。图A展示了NYU/MASCIS脊髓损伤装置的部件与特征，包含多种杆高度设置以调节损伤程度（插图）。图B和图C展示了用于固定大鼠的U形容器，以及在手术和损伤过程中牢固稳定脊柱的锯齿状稳定臂（由Y.P. Zhang设计并制作）。
图3：NYU/MASCIS撞击器上的定制支架系统及侧向微调装置。图A展示了用于脊髓损伤研究的U形大鼠固定器的定制支架系统的各个组成部分。请注意图A中的侧向微调装置，该装置对于精确对准大鼠脊髓以实施损伤至关重要。图B和图C进一步展示了该固定器在无（B）和有（C）U形大鼠容器的情况下，相对于损伤装置其他关键部件的结构（支架系统由Y.P. Zhang设计并制作）。
图 4： 手术稳定装置及其附件各部件的尺寸测量。 定制稳定系统的每个部件均被突出显示，以展示其尺寸和比例 (A, C 和 D)。胸椎稳定臂 (B) 展示了该装置在不同脊柱手术模型中潜在应用方式。
图 5：颈段半挫伤性脊髓损伤的手术标志与准备。图 A 和 B 显示了在暴露的大鼠脊髓上进行准确定位打击的正确解剖标志。合适的打击点位于 C5 和 C6 背根之间（头尾方向），以及脊髓中线与侧缘之间（B）。图 C-E 以更高倍数展示了通过精细的单侧椎板切除术暴露目标侧颈段脊髓以实施损伤的过程。此外，图 D 和 E 分别展示了脊髓挫伤损伤发生前和发生后的即时状态。注意打击造成的明显出血（E）（黑色箭头所示）。
图6：使用NYU/MASCIS撞击器进行撞击后，可接受与不可接受数据读数的示例。 上方的图表 (A) 和上方的数据集 (C) 展示了一次高质量撞击的数据读数，其中用红色箭头和下划线标示了撞击杆速度、初始高度和起始时间的“%误差”测量值。所有数值均明显处于可接受误差范围之内。相反，下方图示展示的是由于脊柱固定不当 (B) 以及在设定撞击杆高度前，撞击杆和尖端未正确“归零”至脊髓表面所导致的不当撞击所产生的数据 (C)。请注意，撞击杆下落的初始高度和起始时间存在明显误差，如红色箭头和下划线所示。软件还发出警告，提示这些参数已检测到误差（见图C底部）。
讨论
本文展示了一种颈椎稳定方法，用于在 C5 节段制造单侧挫伤性脊髓损伤（SCI）。 该稳定方法在解剖学上提高了创伤的精确性，并可产生一致的功能缺陷13,18。 在其他依赖棘突背侧夹持的模型中，棘突损伤或夹具从椎骨脱落的风险较高。 这些模型还可能允许脊柱在挫伤力作用下发生明显移位和形变，这源于脊柱和椎体结构的柔韧性（图 1A 和 B）。 组织的形变会改变撞杆与组织的接触时间，导致损伤力不可预测（图 1A-B & 6B）。 我们所描述的椎体稳定方法还为手术准备带来了其他优势：1）该方法可在手术显微镜下完全稳定以 C5 为中心的椎体，从而提高椎板切除术的准确性（图 1C）；2）动物固定在 U 形稳定器内后，可直接从手术位置转移至定制的安装装置，避免了在 SCI 设备上重新固定动物的操作，节省了时间；3）在损伤部位及紧邻其背侧和尾侧的椎体进行固定，可显著减少由呼吸引起的躯体运动，这是降低实验变异性的另一项措施。
采用这种稳定方法的主要优势在于，能够减少冲击时脊髓和脊柱的形变或腹侧移动。 根据挫伤损伤的基本物理原理，冲击力和能量会从打击杆传递到脊髓，理想情况下由脊髓在受击部位吸收这些能量。 然而，如果脊柱在脊髓下方发生形变（如背侧棘突夹持法中可能发生的情况，图1A & B），则实际作用于脊髓的力会因形变程度不同而降低且具有变异性。
尽管本视频展示了整个颈椎挫伤性脊髓损伤（SCI）模型的实验流程，但本文的核心在于介绍我们在实验室多种应用中所采用的脊髓稳定化方法，特别是用于SCI研究的技术。 一种改良版的稳定装置和方法已用于小鼠脊髓损伤（SCI）研究23. 这种简单的脊柱稳定方法对脊髓损伤研究非常有用，我们此前已使用该方法和设备成功建立了胸段挫伤及切割伤脊髓损伤模型。 另一实验室近期在本期刊中描述了这种颈椎损伤稳定方法的一种改良方案22. 总之，我们介绍这种新型椎体稳定方法，并将其应用于多种外科手术操作中，以实现从椎板切除到损伤制备的可重复性实验性脊髓损伤。 该稳定装置的优势不仅限于颈椎脊髓挫伤，此稳定方法已被广泛应用于多种实验，如脊髓内注射、细胞移植、经小脑延髓池脑脊液采集、半横断与全横断损伤、胸段脊髓挫伤等。 体内 采用双光子显微成像和脊髓电生理记录。 提高脊柱手术和损伤操作的质量并减少实验变异，将有助于深入了解脊髓损伤（SCI）的真实损伤与恢复机制，并筛选不同疗法对这种严重疾病的影响。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院 [NS36350、NS52290 和 NS50243，授予 X–M.X.]、Mari Hulman George 捐赠基金、印第安纳州政府以及露丝·L·克什斯坦国家研究服务奖（NRSA）1F31NS071863（授予 C.L.W.）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 普渡产品倍他碘外科洗手液 | 费舍科学公司 | 19-027132 | |
| 杜卡尔纱布海绵 | 费舍科学公司 | 22-415-490 | |
| 氯胺酮（87.7 mg/kg）/赛拉嗪（12.3 mg/kg） | 韦伯斯特兽医公司 | 07-881-9413, 07-890-5745 | |
| Decon 无水乙醇（200 proof） | 费舍科学公司 | 04-355-450 | |
| 人工泪液眼膏 | 韦伯斯特兽医公司 | 07-870-5261 | |
| 抗生素软膏 | 韦伯斯特兽医公司 | 07-877-0876 | |
| 棉签 | 费舍科学公司 | 1006015 | |
| 咬骨钳 | 精细科学工具公司 | 16000-14 | |
| 外科剪刀 | 精细科学工具公司 | 15009-08 | |
| 剪刀（钝性解剖用） | 精细科学工具公司 | 14040-10 | |
| 外科牵开器 | 精细科学工具公司 | 17005-04 | |
| 大镊子 | 精细科学工具公司 | 11024-18 | |
| 精细镊子 | 精细科学工具公司 | 11223-20 | |
| 止血钳 | 精细科学工具公司 | 13004-14 | |
| 手术刀 | 精细科学工具公司 | 10003-12 | |
| 手术刀片 #15 | 费舍科学公司 | 10015-00 | |
| EZ夹 | 费舍科学公司 | 59027 | |
| 无菌缝合线 | 精细科学工具公司 | 12051-10 | |
| 器械灭菌器 | 精细科学工具公司 | 14040-10 | |
| 手术稳定器 | 定制制造 | N/A | 详情请联系 Y. Ping Zhang（yipingzhang50@gmail.com） |
| 脊柱稳定杆（带爪端足） | 定制制造 | N/A | 详情请联系 Y. Ping Zhang（yipingzhang50@gmail.com） |
| NYU/MASCIS撞击损伤装置 | 定制制造 | W. M. Keck神经科学合作研究中心 罗格斯新泽西州立大学 电子邮件：impactor@biology.rutgers.edu |
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