果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

摘要

我们介绍一种用于标记黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中枢神经系统（CNS）中单个神经元的技术，该技术可通过透射光显微镜或共聚焦显微镜对神经元形态进行分析。

摘要

本文介绍了如何通过邻近细胞注射脂溶性荧光膜标记物DiI，对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎中枢神经系统中的单个神经元进行特异性标记。该方法可实现神经元细胞形态的高分辨率可视化。可在中枢神经系统中对任意细胞进行标记：目标神经元的细胞体可通过微分干涉差（DIC）光学显微镜观察，或通过表达荧光遗传标记物（如GFP）来识别。标记后，可通过光转化将DiI转化为永久性的棕褐色染色，从而利用透射光和DIC光学显微镜观察细胞形态。 Alternatively，也可直接使用共聚焦显微镜观察DiI标记的细胞，从而实现与遗传引入的荧光报告蛋白的共定位分析。该技术适用于任何基因型的动物，因此能够在单细胞分辨率下分析突变体表型。

引言

了解单个细胞水平上的神经元形态是理解神经元连接性和中枢神经系统功能的关键前提。因此，自神经科学发展的早期以来，研究人员一直致力于开发单细胞标记技术（关于此问题的历史讨论参见⁷）。传统的高尔基染色等方法虽然能够很好地分辨神经元形态，但如果需要特异性地标记某一特定类型的神经元，则并不适用，因为其染色具有随机性。通过微电极向细胞内或近细胞内注射染料以标记单个细胞的方法，解决了特异性标记的需求。

单个神经元染料注射技术的应用 果蝇 由于生物体及其神经元的尺寸微小，这构成了一个主要挑战。尽管如此，仍可对胚胎的单个神经元进行染色 果蝇 20世纪80年代中期，Corey Goodman 实验室实现了对神经元的研究突破 ¹⁵该方法已被证明极为有用，为神经元发育机制提供了一些关键见解 果蝇 在过去的20到30年里（例如 ^{2, 10}），许多研究人员对其望而却步，主要原因是其技术要求较高。

近年来，果蝇（Drosophila）神经元标记遗传技术的出现也导致单个神经元染料注射方法变得不再流行。由GAL4驱动的膜靶向GFP构建体表达能够实现神经形态的高分辨率成像^{1, 20}。然而，该方法存在某些局限性：GFP常常不可避免地在多个细胞中表达，从而掩盖单个神经元的结构；此外，可....

方案

我们在实验室中使用了两种略有不同的单神经元标记方法。这些差异主要涉及胚胎收集、去卵膜、去卵黄以及胚胎剖片步骤。图1概述了这两种方法的共同步骤与差异步骤。

1. 胚胎解剖用微针和染料注射用微量移液管的制备

1. 用于胚胎解剖的玻璃针由玻璃毛细管（直径1 mm，壁厚0.1 mm）使用Sutter拉针仪（Science Instruments）或类似设备拉制而成。或者，也可使用安装在针持中、经电解 sharpened 的0.15 mm钨丝进行解剖。（电解 sharpened 的操作说明见文献⁹）。
2. 染料注射用微吸管由带内丝的薄壁玻璃毛细管（Science Products；GB 100 TF 8P）使用Sutter拉针仪（Science Instruments）或类似设备拉制而成。微吸管尖端需锋利，且杆部应具有平缓、均匀的锥形，以利于穿过胚胎组织。理想的微吸管类型为Sutter仪器公司《微吸管食谱手册》第20页所述的“高阻抗微电极，尖而长”型（http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf）。通常在注射前立即拉制微吸管，以确保其尖端保持锋利和洁净。
....

结果

图4展示了本研究中所述技术的典型结果。图4A显示了一个DiI标记的单个中间神经元被清晰光转化的示例，很好地体现了此类样本所能提供的细节水平。在微分干涉差（DIC）光学下观察时，标记细胞在未标记周围组织中的空间位置关系变得清晰可见，例如细胞体在皮层中的位置以及纤维投射在神经网中的走向。

图4B 是一个染料液滴稍大的示例，导致多个相邻细胞同时被标记。这种情况常常使得难以将单个投射结构与特定的细胞体相对应。此外，该图还显示，在荧光显微镜下直接观察时（未进行光转化），背景分辨率明显较低。

图4C中的标本展示了一种多个细胞在相邻节段中被分别标记的情况。经光转化后，按照标准方案13，使用抗Fas2抗体对样本进行染色，以在神经纤维网中提供标记结构（神经束）。尽管在此样本中，大多数细胞体分离良好，能够可靠地绘制其投射路径，但它也展示了当光转化时间延长（以同时转化标记较弱的细胞）时可能出现的情.......

讨论

一个主要优势是 果蝇 作为一种模式系统，其优势在于能够对单个细胞水平上的发育和功能进行分析。这对于神经系统尤其重要，因为神经系统的细胞类型多样性极高，相邻细胞的功能和形态可能完全不同。

本文介绍的方法可用于对单个神经元进行染料标记，该染料既可转化为永久性染色，也可直接通过荧光显微镜观察。该方法能够清晰地展示神经突起的形态细节（图4）。该方法的主要优势之一在于，它几乎可以用于研究中枢神经系统（CNS）中任何类型的神经元形态（关于胚胎腹神经索，参见 Rickert et al., 2011；关于胚胎脑，参见 Kunz et al., 2012）。此外，与某些遗传标记技术不同，该方法无需胚胎中存在复杂的遗传元件组合。染料注射可应用于携带报告基因构建体的动物细胞，从而能够在野生型或突变型背景下，结合特定基因表达模式来观察单个细胞的形态（图4D 和 图5）。我们还曾利用该技术在活体胚胎神经元中监测轴突发育的动态过程^{11, 12<.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	100 mM TRIS-Hcl（pH 7.4）中配制成 2-3 mg/ml
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	乙醇中配制成 1 mg/ml
Formaldehyde	Merck Millipore		PBS 中配制成 7.4%
甘油	Roth	3783	PBS 中配制成 70%
庚烷胶	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	用正庚烷稀释至约 1:1
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
仪器
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP2	用于观察和记录荧光标记
直流放大器	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	用于进行标记操作
盖玻片	Menzel	BB018018A1	18 × 18 mm
盖玻片	Menzel	BB024060A1	24 × 60 mm
解剖显微镜	Leica	MZ8	用于胚胎的制备和解剖
扁平毛细管	Hilgenberg		外径 1 mm；玻璃厚度 0.1 mm
注射毛细管	Science Products	GB 100 TF 8P
显微操作仪 R	Leica		用于进行标记操作
拉针仪 P-97	Sutter Instruments		用于拉制毛细管
载玻片	Marienfeld Superior	1000000
科研显微镜	Zeiss	Axioskop 2 mot	用于光转化后观察标记
科研显微镜	Olympus	BX50	用于进行标记操作
Sony MC3255 视频相机	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	用于记录光转化后的标记图像
表 1。