前列腺感染可能是介导慢性前列腺炎盆腔疼痛的一个影响因素。本文描述了制备标准化细菌接种物的操作步骤、将细菌接种至雄性小鼠尿道的方法，以及随时间测定小鼠触觉异常性疼痛的技术方案。
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本文内容
摘要
摘要
尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是尿路感染和细菌性前列腺炎的重要致病菌1。我们最近的研究表明，UPEC 在慢性盆腔疼痛的发生中具有重要作用2，而慢性盆腔疼痛是慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的主要特征3,4。临床上相关的 UPEC 感染前列腺后，可能通过引起组织损伤以及诱发自身免疫机制等途径，启动并建立慢性疼痛5。
研究UPEC在前列腺中致病机制的一个挑战是前列腺腺体相对难以进行操作。我们采用了一种先前描述过的经尿道感染方法6，将一株临床来源的UPEC菌株注入雄性小鼠体内，从而建立前列腺的上行性感染模型。本文中，我们详细描述了细菌接种物标准化的操作流程7，以及对麻醉后的雄性小鼠进行导管插管以接种细菌的具体步骤。
慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）主要特征是触觉异常性疼痛4。行为学检测基于内脏牵涉痛引起的皮肤痛觉过敏概念8-10。内脏组织中的刺激灶会降低皮肤痛阈，导致对正常情况下无痛刺激产生过度反应（即异常性疼痛）。对皮肤施加正常力度时会出现异常反应，且该反应通常随潜在内脏疼痛强度的增加而增强。本文描述了在NOD/ShiLtJ小鼠中采用von Frey纤维丝的方法，用于量化单次尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染后随时间变化的触觉异常性疼痛程度。
方案
1. 小鼠接种用细菌的制备
以下操作必须在无菌条件下进行。
- 取一支 17 x 100 mm 聚丙烯管（带盖），加入 3 ml 新鲜的 Luria 肉汤（LB）培养基。使用经高压灭菌的枪头，取少量菌株 CP12 的冷冻甘油菌种，转移至含有 LB 培养基的试管中。盖上管盖时稍松，以允许氧气进入——培养需在有氧条件下进行。将试管置于 37 °C、220 rpm 摇床培养箱中过夜培养。
- 次日，取 5 μl 过夜培养物，转移至另一含 3 ml LB 培养基的新鲜试管中，在 37 °C 静置培养箱中静置过夜培养。
- 第 3 天，将 40 μl 培养物转移至一个 50 ml 离心管中，每管含 40 ml LB 培养基。置于 37 °C 静置培养箱中过夜培养。
- 开启离心机并预冷至 4 °C。待离心机达到设定温度后，将每份 40 ml 培养物转移至 40 ml Nalgene 离心管中。
- 称量离心管以平衡离心机——必要时用 LB 培养基调整体积。在 6,000 rpm 条件下离心 20 分钟。
- 小心移除上清液，并用 40 ml 无菌 PBS 轻柔重悬细菌沉淀。
- 用 PBS 重复步骤 1.5。
- 吸除上清液，将细菌沉淀重悬于 500 μl 无菌 PBS 中。将悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。取 10 μl....
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结果
我们检测了NOD/ShiLtj和C57BL/6J雄性小鼠在细菌感染后是否存在慢性疼痛。将5至7周龄的雄性小鼠通过尿道灌注生理盐水或细菌（图1）。对灌注生理盐水的C57BL/6J小鼠和UPEC感染的C57BL/6J小鼠进行骨盆区域的机械刺激（使用von Frey纤维丝），其反应频率在28天的实验过程中未发生改变（图1）。相比之下，UPEC感染的NOD小鼠对骨盆刺激的反应显著增强，并且这种升高一直持续至第28天（P < 0.05；图3）。细菌感染未引起后肢足底区域触觉敏感性的变化（数据未显示）。
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讨论
用UPEC感染小鼠前列腺可实现对 体内 建立可能参与细菌性前列腺炎、慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）发病机制或作为慢性炎症易感因素的事件模型。所述细菌制备与灌注方法借鉴了大量关于UPEC在女性尿路感染模型中的研究文献7,14该模型具有广泛的应用性，可用于研究发病机制、测试潜在的疫苗候选物以及免疫调节机制。通过可量化的方式追踪疼痛行为，能够研究感染诱导的疼痛发病机制，并有望作为测试镇痛治疗药物的临床前模型。
有多个关键步骤决定了小鼠感染模型的成功。为了最佳表达已知对UPEC附着于上皮细胞至关重要的菌毛，需采用为期三天、交替进行振荡培养与静置培养的方法。这是UPEC成功定植器官的关键步骤。细菌培养技术专为UPEC生长设计，其中OD420的设定经过优化，以获得含有1 × 108个细菌的10 μL磷酸盐缓冲液7。其他细菌种类或菌株的生长速率可能不同，因此必须进行标准化，以确定获得1 × 108个细菌所需的合适光密度（O.D.）。不同细菌菌株在膀.......
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所资助，项目编号为1K01DK079019A2（P.T.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养管 | BD Falcon | 352059 | |
| LB 肉汤（Miller 型） | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene 离心管 | Thermo | 3118-0050 | |
| 异氟烷 | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| 导管针 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 管路 | BD intramedic | 427400 | |
| 冯·弗雷纤维丝 | Stoelting | 58025-31 |
参考文献
- Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
- Rudick, C. N., et al. Uropathoge....
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