细菌性前列腺炎小鼠模型中触诱发痛的测定

摘要

前列腺感染可能是介导慢性前列腺炎盆腔疼痛的一个影响因素。本文描述了制备标准化细菌接种物的操作步骤、将细菌接种至雄性小鼠尿道的方法，以及随时间测定小鼠触觉异常性疼痛的技术方案。

摘要

尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是尿路感染和细菌性前列腺炎的重要致病菌¹。我们最近的研究表明，UPEC 在慢性盆腔疼痛的发生中具有重要作用²，而慢性盆腔疼痛是慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的主要特征^3,4。临床上相关的 UPEC 感染前列腺后，可能通过引起组织损伤以及诱发自身免疫机制等途径，启动并建立慢性疼痛⁵。

研究UPEC在前列腺中致病机制的一个挑战是前列腺腺体相对难以进行操作。我们采用了一种先前描述过的经尿道感染方法⁶，将一株临床来源的UPEC菌株注入雄性小鼠体内，从而建立前列腺的上行性感染模型。本文中，我们详细描述了细菌接种物标准化的操作流程⁷，以及对麻醉后的雄性小鼠进行导管插管以接种细菌的具体步骤。

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）主要特征是触觉异常性疼痛⁴。行为学检测基于内脏牵涉痛引起的皮肤痛觉过敏概念^8-10。内脏组织中的刺激灶会降低皮肤痛阈，导致对正常情况下无痛刺激产生过度反应（即异常性疼痛）。对皮肤施加正常力度时会出现异常反应，且该反应通常随潜在内脏疼痛强度的增加而增强。本文描述了在NOD/ShiLtJ小鼠中采用von Frey纤维丝的方法，用于量化单次尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染后随时间变化的触觉异常性疼痛程度。

方案

1. 小鼠接种用细菌的制备

以下操作必须在无菌条件下进行。

1. 取一支 17 x 100 mm 聚丙烯管（带盖），加入 3 ml 新鲜的 Luria 肉汤（LB）培养基。使用经高压灭菌的枪头，取少量菌株 CP1² 的冷冻甘油菌种，转移至含有 LB 培养基的试管中。盖上管盖时稍松，以允许氧气进入——培养需在有氧条件下进行。将试管置于 37 °C、220 rpm 摇床培养箱中过夜培养。
2. 次日，取 5 μl 过夜培养物，转移至另一含 3 ml LB 培养基的新鲜试管中，在 37 °C 静置培养箱中静置过夜培养。
3. 第 3 天，将 40 μl 培养物转移至一个 50 ml 离心管中，每管含 40 ml LB 培养基。置于 37 °C 静置培养箱中过夜培养。
4. 开启离心机并预冷至 4 °C。待离心机达到设定温度后，将每份 40 ml 培养物转移至 40 ml Nalgene 离心管中。
5. 称量离心管以平衡离心机——必要时用 LB 培养基调整体积。在 6,000 rpm 条件下离心 20 分钟。
6. 小心移除上清液，并用 40 ml 无菌 PBS 轻柔重悬细菌沉淀。
7. 用 PBS 重复步骤 1.5。
8. 吸除上清液，将细菌沉淀重悬于 500 μl 无菌 PBS 中。将悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。取 10 μl 悬液，加入 990 μl 冰冷 PBS 中稀释。使用分光光度计测定 OD_{420 nm}，以确定接种所需体积。计算重悬沉淀所用冰冷 PBS 的合适体积：取 OD_{420 nm} 数值（以 ml 计），减去细菌沉淀的估计体积 [例如：OD_{420 nm} = 0.545，沉淀约 0.075 ml；0.545 - 0.075 = 0.470]。
9. 取 10 μl 细菌悬液，加入 990 μl 冰冷 PBS 中稀释。测定 OD_{420 nm}。目标是使稀释后悬液的 OD_{420 nm} 值达到 1.000 ± 0.010。若稀释后数值高于目标值，则向悬液中加入更多 PBS 并重新测定；若低于 0.990，则离心沉淀后重新测定 OD_{420 nm}，直至获得理想读数。

2. 动物感染

小鼠（5至7周龄，每组10只）购自杰克逊实验室（缅因州巴尔港）。

1. 将小鼠置于含1-4%异氟烷的有机玻璃麻醉舱中吸入麻醉，并持续监测直至小鼠呈卧位状态。
2. 每次取一只小鼠，使用连接在经改造的玻璃Hamilton注射器（30 G针头）上的聚乙烯（PE10）导管进行导尿接种。导管插入针头根部。小鼠在通过鼻罩维持麻醉状态下仰卧放置。
3. 通过轻柔按压使小鼠阴茎外露，并使用蘸有足量润滑剂的棉签对阴茎尿道口进行润滑。
4. 经导管后，将10 μl含有1 × 10⁸细菌的磷酸盐缓冲液注入麻醉小鼠的尿道内。
5. 接种细菌后，将小鼠继续置于有机玻璃麻醉舱中维持麻醉状态15分钟，以促进细菌黏附并防止立即排尿。
6. 随后将小鼠放回笼中，并在接下来的24小时内进行监测。

3. 行为学测试

小鼠在感染前（基线）以及感染后第3、7、14、21和28天进行检测。采用von Frey纤维丝检测牵涉性痛觉过敏和触诱发痛，刺激部位为腹部^11,12和后肢足底区域¹³。测试在每天固定时间进行，采用标准化方法，并由同一名实验人员完成所有动物的测试。实验分组采用盲法测试，以克服动物模型中基于行为的疼痛检测方法的局限性。使用5根不同力度的von Frey纤维丝（0.04、0.16、0.4、1.0和4.0 g，Stoelting，美国），分别作用于腹部，记录回缩反应的频率并进行计算。

1. 经过30分钟的适应期后，将小鼠 individually 置于自制的有机玻璃箱（6 x 10 x 12 cm）中，箱底为不锈钢丝网。
2. 使用五根 von Frey 纤维丝测试牵涉性痛觉过敏和触觉异常性疼痛。每根纤维丝施加1-2秒，刺激间隔为5秒，共进行10次测试，纤维丝按作用力从小到大依次使用。
3. 将每根纤维丝应用于前列腺区域附近的下腹部，并注意在此区域内刺激不同部位，以避免脱敏或“增强”效应。纤维丝按作用力递增顺序施加，每次持续1-2秒，刺激之间至少间隔5秒，共进行10次。
4. 以下三种行为被视为对纤维丝刺激的阳性反应：1）腹部急剧回缩；2）立即舔舐或抓挠纤维丝刺激部位；3）跳跃。
5. 反应频率计算为阳性反应所占百分比（共10次，e.g. 10次中出现5次反应 = 50%），数据以反应频率的平均百分比 ± 标准误差（SE）表示。
6. 基线总阳性反应次数超过25次的动物被排除在研究之外。
7. 使用作用力为0.04、0.16、0.4、1.0和4.0 g的von Frey纤维丝检测后肢足底区域的触觉异常性疼痛。采用上下法测定50%缩足阈值的中位数（5），测试起始时将0.04 g纤维丝垂直施加于后肢足底表面，直至纤维丝轻微弯曲。纤维丝按作用力递增顺序测试，直到观察到阳性反应为止。阳性反应定义为足部急剧回缩或舔舐测试侧足部。当记录到阳性反应时，使用下一更弱的纤维丝；若为阴性反应，则使用下一更强的纤维丝。
8. 本研究所描述的实验及方法已通过西北大学动物护理与使用委员会的审查和批准。

结果

我们检测了NOD/ShiLtj和C57BL/6J雄性小鼠在细菌感染后是否存在慢性疼痛。将5至7周龄的雄性小鼠通过尿道灌注生理盐水或细菌（图1）。对灌注生理盐水的C57BL/6J小鼠和UPEC感染的C57BL/6J小鼠进行骨盆区域的机械刺激（使用von Frey纤维丝），其反应频率在28天的实验过程中未发生改变（图1）。相比之下，UPEC感染的NOD小鼠对骨盆刺激的反应显著增强，并且这种升高一直持续至第28天（P < 0.05；图3）。细菌感染未引起后肢足底区域触觉敏感性的变化（数据未显示）。

讨论

用UPEC感染小鼠前列腺可实现对 体内 建立可能参与细菌性前列腺炎、慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）发病机制或作为慢性炎症易感因素的事件模型。所述细菌制备与灌注方法借鉴了大量关于UPEC在女性尿路感染模型中的研究文献^7,14该模型具有广泛的应用性，可用于研究发病机制、测试潜在的疫苗候选物以及免疫调节机制。通过可量化的方式追踪疼痛行为，能够研究感染诱导的疼痛发病机制，并有望作为测试镇痛治疗药物的临床前模型。

有多个关键步骤决定了小鼠感染模型的成功。为了最佳表达已知对UPEC附着于上皮细胞至关重要的菌毛，需采用为期三天、交替进行振荡培养与静置培养的方法。这是UPEC成功定植器官的关键步骤。细菌培养技术专为UPEC生长设计，其中OD₄₂₀的设定经过优化，以获得含有1 × 10⁸个细菌的10 μL磷酸盐缓冲液⁷。其他细菌种类或菌株的生长速率可能不同，因此必须进行标准化，以确定获得1 × 10⁸个细菌所需的合适光密度（O.D.）。不同细菌菌株在膀...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养管	BD Falcon	352059
LB 肉汤（Miller 型）	EMD	EM1.10285.0500
Nalgene 离心管	Thermo	3118-0050
异氟烷	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
导管针 30G	Hamilton	91030
PE10 管路	BD intramedic	427400
冯·弗雷纤维丝	Stoelting	58025-31