欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

摘要

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac 已被构建为一个开放获取的平台，并开发了标准操作程序以最大化其应用价值。

摘要

蛋白质组学研究以前所未有的细节揭示了真核生物蛋白质组的惊人复杂性。目前普遍认为，细胞中的蛋白质大多并非以孤立形式存在，而是通过与许多其他蛋白质相互作用来发挥其生物学功能；在人类中，这种相互作用通常涉及十个或更多的蛋白质，从而在细胞内形成执行大部分甚至全部生命功能的组装线。^1,2 要深入了解这些多蛋白复合物的功能与结构，需要获得高质量且足量的复合物样品，以便进行详细分析。然而，许多蛋白质复合物在细胞内的含量极低，尤其是在真核生物中，这使得从天然来源提取变得不可行，因而必须依赖重组表达手段进行生产。杆状病毒表达载体系统（BEVS）已被证明在表达真核蛋白方面特别有效，因为这些蛋白的功能往往依赖于翻译后修饰，而其他常用的表达系统通常难以支持此类修饰。³ BEVS利用一种重组杆状病毒，将目标基因插入该病毒基因组中，再用其感染昆虫细胞培养物，从而让细胞表达目标蛋白。MultiBac 是一种专门优化用于表达包含多个亚基的真核蛋白复合物的BEVS系统。⁴ 高效表达蛋白质及其复合物的关键前提，是建立针对表达实验各步骤的稳健实验方案，理想情况下可作为标准操作程序（SOP）实施，并能被非专业用户相对轻松地遵循。欧洲分子生物学实验室（EMBL）的 MultiBac 平台为多蛋白复合物表达实验的各个环节均制定了标准操作程序，涵盖从将基因插入经过工程化改造、优化用于异源蛋白表达的杆状病毒基因组，到对所获得蛋白样品进行小规模分析的全过程。^5-8 该平台以开放访问模式部署于EMBL格勒诺布尔分部，已支持了来自学术界和工业界的众多科研人员，加速了蛋白质复合物研究项目的进展。

引言

生物活性由蛋白质及其他生物分子的复合体协同调控，这些复合体共同作用以催化细胞功能。典型的例子包括将DNA中的遗传信息转录为信使RNA的分子机器。在人类中，超过100种蛋白质通过特定且受调控的过程协同作用以转录基因，形成包含10个或更多亚基的大型多蛋白复合物，其中包括RNA聚合酶II以及通用转录因子如TFIID、TFIIH等⁹。其他例子包括由多种蛋白质和RNA分子组成的核糖体，其催化蛋白质的合成；以及在真核生物中负责将生物分子穿梭通过核膜的核孔复合物。对细胞中几乎所有多组分分子机器进行详细的结构与生化解析，对于理解其功能至关重要。例如，原核与真核核糖体的结构解析即为里程碑式的研究，为这些大分子机器如何在细胞内执行特定功能提供了前所未有的深入见解^10,11。

由于核糖体可占细胞质量的30%，因此通过从培养细胞中纯化内源性物质，可以获得足量且高质量的核糖体用于深入研究。相比之下，RNA聚合酶II的丰度则低几个数量级，为获得该转录核心复合物的原子分辨率结构，曾需处理数千升的酵母培养物¹²。然而，绝大多数其他必需复合物在天然细胞中的含量极低，因而无法从天然来源材料中充分纯化。要使这些复合物能够进行深入的结构与功能分析，必须借助重组技术进行异源表达生产。

重组蛋白的生产对生命科学研究产生了重大影响。许多蛋白质通过重组技术得以表达，并在高分辨率下对其结构和功能进行了深入解析。结构基因组学项目利用多种生物基因组的解析成果，以高通量（HT）模式系统性地研究整个生物体的基因产物谱。因此，已有数千种蛋白质结构被确定。迄今为止，最广泛使用的重组蛋白表达系统是E. coli，多年来已针对该宿主开发并优化了多种表达系统。携带大量功能元件、用于在E. coli中实现蛋白表达的质粒，已占据商业供应商产品目录的整册篇幅。

然而，E. coli 存在某些局限性，使其不适合表达许多真核蛋白，特别是由多个亚基组成的蛋白复合物。因此，近年来在真核宿主中进行蛋白表达已成为首选方法。其中，杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system, BEVS）是一种特别适用于表达真核蛋白的系统，该系统利用携带异源基因的重组杆状病毒感染在实验室中培养的昆虫细胞。MultiBac 系统是近年来发展起来的一种 BEVS，专为表达具有多个亚基的真核蛋白复合物而优化设计（图1）。MultiBac 于2004年首次被提出¹³。自推出以来，该系统不断得到改进和简化，通过制定高效的标准操作程序（SOPs），使操作更便捷、目标蛋白质量更高，并让非专业用户也能轻松使用⁴。目前，MultiBac 已在全球范围内的学术界和工业界众多实验室中得到应用。在位于格勒诺布尔的欧洲分子生物学实验室（EMBL），欧盟委员会设立了跨国访问项目，为希望利用该表达系统推进研究的科学家提供 MultiBac 平台的专业培训。许多此前难以获得的蛋白复合物的结构与功能，正是通过 MultiBac 表达的样品得以解析⁴。下文将概述在 EMBL 格勒诺布尔 MultiBac 平台实际运行中所采用的 MultiBac 表达关键步骤的操作方案。

方案

1. 用于构建多基因表达载体的串联重组工程（TR）

1. 设计共表达策略。设计将目标基因插入供体（Donors）和受体（Acceptors）的方法。复合物中潜在的生理功能亚模块应分别集中于特定的受体和供体上。使用由归巢内切酶（Homing endonuclease, HE）- BstXI 对组成的乘法模块，将表达盒组合到单个供体和受体质粒上。^7,8 在开展实验前，应在计算机中（in silico）构建所有相关载体，并对策略进行充分验证。例如，应检查目标基因是否不含HE或其他限制性酶切位点，并确认开放阅读框（ORFs）的正确性。可考虑订购针对昆虫细胞密码子偏好和mRNA二级结构优化的合成基因，以提高蛋白表达水平，同时去除目标基因中已有的HE位点。根据文献中关于目标蛋白N端或C端柔性或暴露区域的数据，考虑在合适位置添加纯化标签。若因复合物中各蛋白的化学计量关系需要精确控制各亚基的相对表达量，可考虑采用多聚蛋白（polyprotein）策略，以在同一转录本中表达多个蛋白亚基。⁴ 准备详细的“操作指南”文档（建议使用电子实验记录本），记录从起始到构建完整多基因载体的全部实验步骤。创建Cre-LoxP融合质粒的电子文件，例如使用Berger课题组提供的Cre-ACEMBLER软件（可从其主页下载：www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies/cre-acembler）。
2. 使用限制性内切酶与连接酶，或依据已发表的方案采用无需连接的方法，将目标基因插入选定的供体和受体中。^5,6,14 若具备液体处理工作站，并计划构建大量载体（例如用于组合式策略），可考虑使用Berger课题组开发并实现的机器人操作脚本（图2）。^14,15 若无液体处理工作站，也可通过手工操作结合微孔板，以高通量类似的方式完成基因插入。
3. 在需要控制表达亚基化学计量比的情况下，可能会遇到实际限制。若蛋白复合物中各亚基的表达水平存在化学计量失衡，可考虑采用多聚蛋白策略，将多个亚基与特定蛋白酶（例如烟草蚀刻病毒NIa蛋白酶）通过特定的蛋白酶切割位点连接，构成单一的长开放阅读框（ORF）。^4,8 若复合物结构庞大、亚基数量众多且各亚基分子量差异显著，可考虑将一个多聚蛋白与单个表达盒共同表达。若某一蛋白表达产量较低，可考虑在同一多聚蛋白中重复表达多个相同基因，或构建多个相同的表达盒进行共表达，以提高其表达量。^4,13
4. 通过限制性酶切图谱分析（可选高通量方式）和测序，验证所有构建的供体和受体载体。随后通过Cre-LoxP重组将供体与受体组合融合，构建所需的多基因表达载体。使用Cre-ACEMBLER或类似软件生成的电子序列作为参考，通过限制性酶切图谱验证纯化的受体-供体融合质粒。
5. 将纯化并验证后的供体、受体及供体-受体融合质粒储存于-20 °C或-80 °C。妥善归档质粒及其序列信息（如使用Microsoft Excel、Filemaker等工具），以备后续使用。

2. 复合型多基因杆状病毒的构建、扩增与保存

1. 通过将多基因转移载体转化至携带病毒基因组及Tn7转座所需功能的DH10细胞中，将其整合至MultiBac杆状病毒基因组。需注意，MultiBac杆状病毒基因组可在其自身的LoxP位点（经工程改造位于Tn7插入位点远端）预先装载特定目的基因（如YFP标记、分子伴侣等），通过 体内 Cre 反应先于 Tn7 整合。¹³ 转座Tn7后，通过蓝/白筛选选择含有目的基因的复合型杆状病毒的细胞（成功的Tn7转座导致β-半乳糖苷酶的α-互补功能丧失；因此，在含有X-gal的选择性琼脂平板上，正确完成Tn7转座的菌落保持白色），随后通过碱裂解及乙醇/异丙醇沉淀法提取基因组。^5,6
2. 转染与初始病毒制备将6孔组织培养板放入无菌操作台中。从对数生长期的Sf21昆虫细胞培养物中取细胞等分试样接种于各孔中，并按照所述方法，在培养基中加入纯化的杆状病毒基因组和转染试剂混合物进行转染。⁶ 48–60 小时后通过移除培养基收获初始病毒（高质量、低滴度病毒 V）₀，通常每孔加入3 ml）。补充新鲜培养基，继续培养额外2-3天后检测蛋白表达（如果含有YFP标记，则同时检测荧光）。^6,7
3. 病毒扩增，低感染复数方案. 使用 V₀ 病毒用于感染处于对数生长期的 25-50 ml 细胞（细胞密度 <1×10⁶ 每毫升细胞数）置于小型（100–250 ml）锥形摇瓶中，在轨道摇床平台上振荡培养（图3）。计数细胞，每24小时传代一次，直至细胞停止倍增（增殖停滞）。采用低感染复数（multiplicity of infection，MOI） 即 每个细胞的病毒颗粒数）方案：细胞必须至少倍增一次（MOI < 1），否则使用更小体积的V重复实验₀ 加入。通常，加入 3 ml 的 V₀ 用于感染25 ml密度为0.5×10⁶个/ml的Sf21昆虫细胞⁶ 细胞/毫升。这是防止病毒过度扩增和自删除的关键步骤，可避免目标异源基因的丢失。收获 V₁ 病毒（25-50 ml），于48-60小时后通过离心收集细胞并移除含病毒的培养基。更换新鲜培养基，并通过取1×10⁶细胞检测YFP及蛋白表达情况。⁶ 每12或24小时收集细胞，离心沉淀并验证蛋白表达及标记蛋白（YFP）信号。⁶，扩增病毒（至 V₂若目标是获得更大表达量，可通过在2 L摇瓶中感染最多400 ml细胞来进一步实现₁ 病毒，遵循上述低感染复数（MOI）方案（细胞在感染V后必须至少倍增一次）₁严格检测扩增过程中的蛋白质表达及标记蛋白信号，以避免缺陷型病毒（不再含有目的基因）的积累。^5-7 利用每次扩增步骤中已积累的细胞沉淀，建立目标表达蛋白复合物的纯化方案。
4. 生产病毒的BIIC储存我们强烈建议储存 V₂ 使用BIIC方法将病毒作为生产病毒B杆状病毒-i感染的 i昆虫 c细胞）方法，以防止修饰（例如 目的基因的缺失）以及维持高水平的表达。¹⁶ 在增殖停滞后24小时收集感染的细胞——此阶段的细胞含有完整的病毒颗粒，即将通过出芽方式释放到培养基中。移除培养基，将细胞沉淀分装后用液氮速冻，并可长期保存。^7,16

3. 蛋白质生产与下游处理

1. 感染较大培养物并监测YFP. 使用 V₁，V₂ 或使用冻存的 BIIC 分装样品感染更大体积的细胞培养物以进行生产（通常为 2 L 三角瓶中的 400 ml）。遵循低 MOI 操作方案（调整用于感染的病毒体积，使感染后的细胞至少倍增一次）。必要时可通过增加三角瓶数量来扩大感染培养体积。若存在 YFP 标记蛋白，则在预定时间间隔内取样 1×10⁶ 细胞⁶ 细胞，离心收集并裂解细胞，监测YFP信号的变化，直至信号达到平台期，表明重组蛋白的表达达到最大量。YFP水平可在标准的96孔板荧光酶标仪上测定，该仪器需具备记录荧光信号的功能（例如 Tecan SPECTRAFluor）。在此阶段收获细胞。将细胞沉淀物储存于 -20 °C（短期）或 -80 °C（长期）。
2. 细胞裂解与分馏采用适合目标蛋白特性的常用方法裂解细胞（如冻融法、超声破碎法、法国压滤法或其他方法）。^5-7 分离细胞质和细胞核组分，并检测目标蛋白的存在。根据实验结果制定纯化方案，以简化蛋白纯化流程。若目标蛋白定位于细胞核，可考虑在高KCl条件下采用浸提方法从核组分中提取蛋白。^7,18
3. 蛋白质纯化（微规模，大规模）请注意，由于杆状病毒/昆虫细胞系统中异源蛋白的表达水平通常较高或非常高（每升培养物常可产生10–100 mg甚至更多的蛋白），因此通常仅需少量细胞培养物（10或25 ml）即可获得足够量的细胞沉淀，用于纯化目标蛋白。结合微量纯化技术（如多孔板、微探针方法、GE Healthcare ÄKTAmicro系统等），可获得生化与活性数据，且通常还能获得足量的目标蛋白及蛋白复合物，用于纳升级别的高通量结晶（HTX）。建议在目标蛋白复合物的暴露亚基上添加寡聚组氨酸标签（6–10个残基），并采用金属亲和层析（如Clonetech Takara TALON、Qiagen NiNTA金属螯合树脂），再结合离子交换层析和凝胶过滤层析，在小体积条件下进行纯化，例如使用ÄKTAmicro或类似的微量纯化设备。图4）。此外，根据目标蛋白的生化特性及个人偏好，还可并应考虑采用其他亲和纯化步骤以及离子交换层析（IEX）步骤，与带有寡聚组氨酸标签或其他标签（可选自GST、MBP、CBP等）的亲和纯化联用。可考虑对多个亚基同时进行亲和标签标记，以提高纯化效率。浓缩纯化的蛋白复合物，并建立储存方案，例如添加或不添加甘油进行冷冻保存。建立可标准化应用的质量控制标准（如活性测定、生物化学及生物物理检测），用于评估纯化蛋白批次间的差异。

结果

MultiBac 系统实现异源蛋白的高效共表达，如图1d所示（在感染悬浮细胞培养物后48小时取样）。在全细胞提取物（SNP）和澄清裂解液（SN）中，过表达的蛋白条带清晰可辨。所获得蛋白样品的质量和数量通常足以支持蛋白复合物的结构解析，例如图1e所示的有丝分裂检验点复合物MCC。¹⁷

图2展示了通过机器人辅助串联重组工程（TR）进行基因组装实验的工作流程。稳健的DNA组装方案被编写为机器人操作程序，以实现多基因表达载体的并行组装。各个机器人操作步骤以快照形式展示（图2c，I - IV）。待组装的DNA组分通过PCR扩增，并利用电泳凝胶进行质量控制（图2d，左侧）；组装完成的多基因构建体同样通过特异性设计的引物组进行PCR验证（图2d，右侧）。^14,15

重组杆状病毒的制备与扩增遵循标准...

讨论

图 2 和 3 中的视频截图展示了从cDNA开始，通过机器人辅助生成多基因表达载体，直至感染昆虫细胞培养物以进行蛋白质生产的完整过程。研究人员已开发出新的试剂（质粒和病毒）以及稳健的实验方案，从而建立了一条依赖标准操作程序（SOP）的实验流程。该完整流程已在位于格勒诺布尔的欧洲分子生物学实验室（EMBL）作为平台技术得以实施。许多来自学术界和工业界、从事多蛋白研究的科学家均已使用过MultiBac平台。该平台的培训使用由欧洲委员会资助的专项访问计划（P-CUBE、BioSTRUCT-X）提供支持。

提供利用MultiBac系统进行蛋白复合物表达的标准操作流程（SOP），使得该技术也易于非专业用户使用。当需要并行生成大量复合物（例如感兴趣样本的变体和突变体）时，机器人辅助操作尤其能够加速多蛋白复合物的生产。然而，即使在低至中等通量的手动操作中，SOP的可用性也带来了显著优势。根据我们的经验，要将流程成功编写为机器人操作程序，必须首先投入大量努力进行优化，直至获得足够稳健且适用于机器人操作的实验方案。此类方案构成了我们...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
四环素	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000倍溶液，浓度为10 mg/ml
卡那霉素	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000倍溶液，浓度为50 mg/ml
庆大霉素	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000倍溶液，浓度为10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000倍溶液，浓度为1 M
Cre重组酶	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP 转染试剂	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 昆虫细胞培养基	Thermo Scientific	SH 30913.02
6孔板 Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml 移液管 Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml 移液管 Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml 移液管 Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml 移液管 Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml 移液管 Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml 离心管 Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml 离心管 Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml 冻存管 Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml 摇瓶 Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml 摇瓶 Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml 摇瓶 Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L 摇瓶 Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat 轨道摇床 + 平台	Sartorius	4445110, 4445233
35 L 液氮杜瓦罐	Fisher Scientific	M76801
生物安全柜 Faster	Sodipro	FASV20000606
光学显微镜	Zeiss	451207
Sf21 昆虫细胞
Hi5 昆虫细胞	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO 配备 Evoware plus 系统	TECAN
10 μl 导电吸头（黑色）	TECAN	10 612 516
200 μl 导电吸头（黑色）	TECAN	10 612 510
一次性试剂槽，100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec 96孔PCR板，带裙边	Eppendorf	0030 128.648
96孔V型底板，非无菌	BD falcon	353263
96深孔板，自然色，聚丙烯材质	Fisher	M3752M
聚苯乙烯微孔板，96孔平底	Greiner	655101
96深孔板	Thermo scientific	AB-0932
24孔反应块 RB	Qiagen	19583
DpnI 限制性内切酶	NEB	R0176L	20 U/μL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X Phusion 高保真预混液	Finnzyme	ref F-531L
2X Phusion GC 预混液	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	自制		含7.5%甘油、0.031%溴酚蓝、0.031%二甲苯蓝FF
高分子量DNA Marker（用于E-gel）	Life Technologies	10496-016
低分子量DNA Marker（用于E-gel）	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1%琼脂糖凝胶GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin-robot-96 质粒提取试剂盒	Macherey Nagel	740 708.24
PCR产物纯化试剂盒，Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq Green 预混液	Promega	M7113
T4 DNA聚合酶（适用于LIC克隆）	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	自制
尿素 2 M	自制
EDTA 500 mM pH 8.0	自制
LB培养基（Miller配方），500 g	Athena ES	103