蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac 已被构建为一个开放获取的平台，并开发了标准操作程序以最大化其应用价值。
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摘要
摘要
蛋白质组学研究以前所未有的细节揭示了真核生物蛋白质组的惊人复杂性。目前普遍认为，细胞中的蛋白质大多并非以孤立形式存在，而是通过与许多其他蛋白质相互作用来发挥其生物学功能；在人类中，这种相互作用通常涉及十个或更多的蛋白质，从而在细胞内形成执行大部分甚至全部生命功能的组装线。1,2 要深入了解这些多蛋白复合物的功能与结构，需要获得高质量且足量的复合物样品，以便进行详细分析。然而，许多蛋白质复合物在细胞内的含量极低，尤其是在真核生物中，这使得从天然来源提取变得不可行，因而必须依赖重组表达手段进行生产。杆状病毒表达载体系统（BEVS）已被证明在表达真核蛋白方面特别有效，因为这些蛋白的功能往往依赖于翻译后修饰，而其他常用的表达系统通常难以支持此类修饰。3 BEVS利用一种重组杆状病毒，将目标基因插入该病毒基因组中，再用其感染昆虫细胞培养物，从而让细胞表达目标蛋白。MultiBac 是一种专门优化用于表达包含多个亚基的真核蛋白复合物的BEVS系统。4 高效表达蛋白质及其复合物的关键前提，是建立针对表达实验各步骤的稳健实验方案，理想情况下可作为标准操作程序（SOP）实施，并能被非专业用户相对轻松地遵循。欧洲分子生物学实验室（EMBL）的 MultiBac 平台为多蛋白复合物表达实验的各个环节均制定了标准操作程序，涵盖从将基因插入经过工程化改造、优化用于异源蛋白表达的杆状病毒基因组，到对所获得蛋白样品进行小规模分析的全过程。5-8 该平台以开放访问模式部署于EMBL格勒诺布尔分部，已支持了来自学术界和工业界的众多科研人员，加速了蛋白质复合物研究项目的进展。
引言
生物活性由蛋白质及其他生物分子的复合体协同调控，这些复合体共同作用以催化细胞功能。典型的例子包括将DNA中的遗传信息转录为信使RNA的分子机器。在人类中，超过100种蛋白质通过特定且受调控的过程协同作用以转录基因，形成包含10个或更多亚基的大型多蛋白复合物，其中包括RNA聚合酶II以及通用转录因子如TFIID、TFIIH等9。其他例子包括由多种蛋白质和RNA分子组成的核糖体，其催化蛋白质的合成；以及在真核生物中负责将生物分子穿梭通过核膜的核孔复合物。对细胞中几乎所有多组分分子机器进行详细的结构与生化解析，对于理解其功能至关重要。例如，原核与真核核糖体的结构解析即为里程碑式的研究，为这些大分子机器如何在细胞内执行特定功能提供了前所未有的深入见解10,11。
由于核糖体可占细胞质量的30%，因此通过从培养细胞中纯化内源性物质，可以获得足量且高质量的核糖体用于深入研究。相比之下，RNA聚合酶II的丰度则低几个数量级，为获得该转录核心复合物的原子分辨率结构，曾需处理数千升的酵母培养物12。然而，绝大多数其他必需复合物在天然细胞中的含量极低，因而无法从天然来源材料中充分纯化。要使这些复合物能够进行深入的结构与功能分析，必须借助重组技术进行异源表达生产。
重组蛋白的生产对生命科学研究产生了重大影响。许多蛋白质通过重组技术得以表达，并在高分辨率下对其结构和功能进行了深入....
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方案
1. 用于构建多基因表达载体的串联重组工程（TR）
- 设计共表达策略。设计将目标基因插入供体（Donors）和受体（Acceptors）的方法。复合物中潜在的生理功能亚模块应分别集中于特定的受体和供体上。使用由归巢内切酶（Homing endonuclease, HE）- BstXI 对组成的乘法模块，将表达盒组合到单个供体和受体质粒上。7,8 在开展实验前，应在计算机中（in silico）构建所有相关载体，并对策略进行充分验证。例如，应检查目标基因是否不含HE或其他限制性酶切位点，并确认开放阅读框（ORFs）的正确性。可考虑订购针对昆虫细胞密码子偏好和mRNA二级结构优化的合成基因，以提高蛋白表达水平，同时去除目标基因中已有的HE位点。根据文献中关于目标蛋白N端或C端柔性或暴露区域的数据，考虑在合适位置添加纯化标签。若因复合物中各蛋白的化学计量关系需要精确控制各亚基的相对表达量，可考虑采用多聚蛋白（polyprotein）策略，以在同一转录本中表达多个蛋白亚基。4 准备详细的“操作指南”文档（建议使用电子实验记录本），记录从起始到构建完整多基因载体的全部实验步骤。创建Cre-LoxP融合质粒的电子文件，例如使用Berger课题组提供的Cre-ACEMBLER软件（可从其主页下载：
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结果
MultiBac 系统实现异源蛋白的高效共表达，结果如图1d所示（在感染悬浮细胞培养物后48小时取样）。在全细胞提取物（SNP）和澄清裂解液（SN）中，过表达的蛋白条带清晰可辨。所获得蛋白样品的质量和数量通常足以支持蛋白质复合物的结构解析，例如如图1e所示的有丝分裂检验点复合物MCC。17
图2展示了通过机器人辅助串联重组工程（TR）进行基因组装实验的工作流程。稳健的DNA组装方案已被编写为机器人操作程序，用于平行化组装多基因表达载体。各个机器人操作步骤以快照形式展示（图2c，I - IV）。待组装的DNA组分通过PCR生成，并利用电子凝胶进行质量控制（图2d，左侧）；组装完成的多基因载体同样通过特异性设计的引物组进行PCR验证（图2d，右侧）。14,15
重组杆状病毒的生成与扩增遵.......
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讨论
图 2 和 3 中的视频截图展示了从cDNA开始，通过机器人辅助生成多基因表达载体，直至感染昆虫细胞培养物以进行蛋白质生产的完整过程。研究人员已开发出新的试剂（质粒和病毒）以及稳健的实验方案，从而建立了一条依赖标准操作程序（SOP）的实验流程。该完整流程已在位于格勒诺布尔的欧洲分子生物学实验室（EMBL）作为平台技术得以实施。许多来自学术界和工业界、从事多蛋白研究的科学家均已使用过MultiBac平台。该平台的培训使用由欧洲委员会资助的专项访问计划（P-CUBE、BioSTRUCT-X）提供支持。
提供利用MultiBac系统进行蛋白复合物表达的标准操作流程（SOP），使得该技术也易于非专业用户使用。当需要并行生成大量复合物（例如感兴趣样本的变体和突变体）时，机器人辅助操作尤其能够加速多蛋白复合物的生产。然而，即使在低至中等通量的手动操作中，SOP的可用性也带来了显著优势。根据我们的经验，要将流程成功编写为机器人操作程序，必须首先投入大量努力进行优化，直至获得足够稳健且适用于机器人操作的实验方案。此类方案构成了我们.......
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披露
IB 是本文件所述技术部分的专利和专利申请的发明人。
致谢
感谢Christoph Bieniossek、Simon Trowitzsch、Daniel Fitzgerald、Yuichiro Takagi、Christiane Schaffitzel、Yvonne Hunziker、Timothy Richmond以及Berger实验室所有过去和现在的成员提供的帮助与建议。MultiBac平台及其开发工作一直得到多个资助机构的慷慨支持，包括瑞士国家科学基金会（SNSF）、法国国家研究署（ANR）、法国国家科学研究中心（CNRS）以及欧洲委员会在第六和第七框架计划（FP6和FP7）中的资助。跨国访问支持由欧洲委员会FP7项目P-CUBE（www.p-cube.eu）和BioStruct-X（www.biostruct-x.eu）提供。特别感谢法国科学部通过“未来投资计划”FRISBI项目对EMBL的MultiBac平台给予的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| 四环素 | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000倍溶液，浓度为10 mg/ml |
| 卡那霉素 | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000倍溶液，浓度为50 mg/ml |
| 庆大霉素 | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000倍溶液，浓度为10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000倍溶液，浓度为1 M |
| Cre重组酶 | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP 转染试剂 | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 昆虫细胞培养基 | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6孔板 Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml 移液管 Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml 移液管 Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml 移液管 Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml 移液管 Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml 移液管 Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml 离心管 Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml 离心管 Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml 冻存管 Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml 摇瓶 Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml 摇瓶 Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml 摇瓶 Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L 摇瓶 Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat 轨道摇床 + 平台 | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| 35 L 液氮杜瓦罐 | Fisher Scientific | M76801 | |
| 生物安全柜 Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| 光学显微镜 | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 昆虫细胞 | |||
| Hi5 昆虫细胞 | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO 配备 Evoware plus 系统 | TECAN | ||
| 10 μl 导电吸头（黑色） | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl 导电吸头（黑色） | TECAN | 10 612 510 | |
| 一次性试剂槽，100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec 96孔PCR板，带裙边 | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96孔V型底板，非无菌 | BD falcon | 353263 | |
| 96深孔板，自然色，聚丙烯材质 | Fisher | M3752M | |
| 聚苯乙烯微孔板，96孔平底 | Greiner | 655101 | |
| 96深孔板 | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24孔反应块 RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI 限制性内切酶 | NEB | R0176L | 20 U/μL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X Phusion 高保真预混液 | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X Phusion GC 预混液 | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | 自制 | 含7.5%甘油、0.031%溴酚蓝、0.031%二甲苯蓝FF | |
| 高分子量DNA Marker（用于E-gel） | Life Technologies | 10496-016 | |
| 低分子量DNA Marker（用于E-gel） | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1%琼脂糖凝胶GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin-robot-96 质粒提取试剂盒 | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR产物纯化试剂盒，Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq Green 预混液 | Promega | M7113 | |
| T4 DNA聚合酶（适用于LIC克隆） | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | 自制 | ||
| 尿素 2 M | 自制 | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | 自制 | ||
| LB培养基（Miller配方），500 g | Athena ES | 103 |
参考文献
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay,....
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重印与许可
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