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方法文章

RNA 原位杂交在整装胚胎及细胞组织学中的应用：适用于海洋软骨鱼类

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DOI：

10.3791/50165

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2013年4月12日

1Department of Biological Sciences, Union College

本文内容

摘要

通过结合RNA整体染色的方法 原位 杂交与组织学技术可将基因表达与发育胚胎中的细胞命运决定相关联。这些方法已适用于海洋软骨鱼类，有助于将这些动物作为生物医学、毒理学及比较研究的模式生物。

摘要

海洋软骨鱼类是生物医学和基因组学研究中重要的动物模型，因为它们是最原始的具有适应性免疫系统的脊椎动物，同时具有独特的渗透压调节机制 1-3作为最原始的具有成对附肢的有颌脊椎动物，软骨鱼类在进化上具有重要的研究价值，尤其适用于进化与发育相关的研究。海洋软骨鱼类也被用于研究与气候变化相关的水生毒理学和应激生理学。 4因此，需要发展和改进相关方法，以促进并拓展这些原始脊椎动物在多个生物学领域中的应用。本文展示了RNA整体原位杂交技术的成功改进与应用 原位 杂交与组织学技术用于研究软骨鱼类的基因表达与细胞组织学。

监测基因表达是发育生物学家的标志性工具，广泛用于研究发育过程。 5RNA整体原位杂交 原位 杂交技术可用于在胚胎发育过程中对特定基因转录本进行可视化和定位。通过分析基因转录产物的表达模式，可深入了解该基因可能调控的发育过程及细胞命运决定。通过比较同一基因在不同发育阶段的表达模式，可进一步揭示该基因在发育过程中功能角色的动态变化。

尽管整体样本 原位提供了一种将基因表达定位到组织的方法，而组织学技术则可用于鉴定已分化的细胞类型和组织。组织学染色具有多种功能。普通染色用于突出细胞形态，例如苏木精和伊红分别用于细胞核和细胞质的常规染色。其他染色方法可特异性标记特定细胞类型。例如，本文报道的阿利新蓝染色是一种广泛使用的阳离子染料，用于识别黏多糖。用阿利新蓝对消化道进行染色，可显示产生黏多糖的杯状细胞的分布情况。黏多糖组分在短肽上的差异可进一步根据功能区分消化道内不同类型的杯状细胞。 6通过使用RNA整体染色 原位结合组织化学方法，可将细胞命运决定与基因特异性表达关联起来。

尽管 RNA 原位和组织化学在研究人员中被广泛使用，但其在海洋软骨鱼类中的应用适应性和使用效果却有限且参差不齐。本文介绍了我在实验室中常规使用的、针对软骨鱼类开发的实验方案。尽管RNA的进一步修饰仍有待完善 原位尽管杂交方法可能需要针对不同物种进行调整，但本文所述方案为希望将海洋软骨鱼类应用于科学研究的研究人员提供了一个良好的起点。

方案

I. RNA 整体原位杂交 原位 海洋软骨鱼类的杂交

1. 胚胎固定与制备

  1. 根据巴勒德分期法对鳐鱼胚胎进行分期 7检测基因表达的最佳时期取决于目标组织。为追踪基因在鳐鱼消化道中的表达，最佳时期为27至30期。 7.
  2. 将胚胎解剖至 PBS 中，分离胚胎与卵黄囊。
  3. 在50 ml锥形管中，加入30 ml新配制的4%多聚甲醛（PFA），于4 °C轻轻振荡固定24小时。
  4. 用PBT清洗胚胎，每次15分钟，共洗两次，室温下旋转洗涤。所有RNA整体染色实验所需溶液的配制方法 原位包括（表1).
  5. 通过在25%、50%和75%甲醇：PBT溶液中依次振荡洗涤，在室温下对胚胎进行脱水。洗涤时间取决于胚胎的发育阶段。对于神经胚形成前阶段的胚胎，每个甲醇浓度洗涤5分钟即可。对于发育阶段超过30期的胚胎，每次洗涤时间可延长至30分钟。为判断胚胎是否已充分渗透并适应当前洗涤液，可将离心管直立握于手中观察。若胚胎沉入管底，则可进行下一步洗涤；若胚胎漂浮于溶液上层，则需更换溶液并重复该脱水步骤。
  6. 用100%甲醇轻轻振荡洗涤两次，每次10分钟。
  7. 脱水至100%甲醇后，胚胎应在-20 °C下保存至少24小时，然后再进行后续实验步骤。胚胎在-20 °C下已成功保存长达1年，并可用于RNA整体原位杂交。

2. RNA 探针的合成

  1. 制备一段线性化的基因片段，用于检测其表达情况。可通过PCR扩增或酶切质粒获得该线性片段。若采用PCR扩增，应选择位于目的基因插入片段两侧、且扩增产物中保留有RNA聚合酶结合位点的引物。对于常用的质粒（如pBS或pGEM），M15正向和反向引物是理想选择。或者，可通过限制性内切酶消化15 μl的QIAGEN小量提取质粒DNA，在基因5'端进行线性化。随后使用相应的QIAquick试剂盒进行凝胶回收和纯化。
  2. 以8 μl线性化质粒或100 ng PCR产物作为模板，使用相应的RNA聚合酶进行RNA探针的反转录合成（转录反应条件参见表2）。
  3. 将反转录反应在37 °C孵育2小时。
  4. 为验证反应结果，取1 μl转录产物在1%琼脂糖/TAE凝胶上电泳。以100 mV电压电泳，直至染料刚好进入凝胶。应可见一条清晰的主条带，线性DNA模板可能在较高分子量位置微弱显现。
  5. 向转录反应体系中加入1 μl无RNA酶的DNA酶I，在37 °C孵育15分钟。
  6. 进行沉淀时，加入100 μl TE缓冲液（pH 8）、10 μl 4 M LiCl和300 μl 100%乙醇，于-20 °C孵育至少60分钟或过夜。
  7. 在4 °C下，以14,000 rpm离心10分钟。
  8. 用70%乙醇洗涤沉淀，并在空气中干燥。
  9. 将RNA探针重悬于20 μl去离子水（dH2O）中，再加入80 μl杂交缓冲液（杂交缓冲液应预先加热至70 °C）。探针可在80%杂交缓冲液中于-20 °C保存数月，或在-80 °C长期保存。

3. 胚胎预处理与杂交

  1. 从 -20 °C 取出保存在 100% 甲醇中的胚胎。对于较年轻的胚胎，继续进行步骤 (3.2)。对于较晚期的胚胎（29/30 期 <），可能会观察到表皮层已从胚胎体表“剥离”。在显微镜下，小心地将表皮层解剖去除，以最大程度促进探针渗透。
  2. 将胚胎放入干净的玻璃闪烁瓶中。按照上述逆向甲醇系列（75%、50%、25% 甲醇:PBT）重新水化胚胎，每步在室温下轻轻振荡 5–30 分钟。最后用 PBT 洗涤两次，每次 10 分钟，轻轻振荡，完成再水化。
  3. 为去除任何色素，用含 6% 过氧化氢的 PBT 在室温下漂白胚胎 1 小时，同时振荡。
  4. 用 PBT 洗涤三次，每次 10 分钟，室温振荡，以去除过氧化氢。
  5. 用蛋白酶 K 处理胚胎，以促进杂交过程中探针的渗透。蛋白酶 K 的用量和处理时间取决于所要检测的组织类型及胚胎的发育阶段。较表浅的组织和较年轻的胚胎需要更短时间和更低浓度的蛋白酶 K，而较深的组织和较老的胚胎则需要更高浓度和更长时间的处理，以充分通透胚胎，利于探针杂交。例如，检测 29 期鳐胚胎肠道内胚层中的 Shh 表达时，使用 30 μg/ml 蛋白酶 K/PBT，在室温下孵育 20 分钟。
  6. 迅速用 PBT 冲洗胚胎，以去除蛋白酶 K。
  7. 为灭活蛋白酶 K，用含 4% 多聚甲醛和 0.2% 戊二醛的 PBT 溶液在室温下轻轻振荡固定 20 分钟。
  8. 用 PBT 洗涤两次，每次 10 分钟。
    1. 预杂交时，向胚胎中加入 2–3 ml 预热的杂交液，以刚好覆盖胚胎为宜。在 70 °C 水浴中轻轻振荡孵育 1 小时。
    2. 配制杂交液时，先将 RNA 探针于 70 °C 预热 10 分钟，然后置于冰上冷却。将 15–20 μl RNA 探针加入 2 ml 新鲜预热的杂交液中，使终浓度为 0.5–1.0 μg/ml。吸除预杂交液，加入稀释后的 RNA 探针溶液，确保胚胎刚好被液体覆盖，必要时可补充杂交液。拧紧闪烁瓶盖，在 70 °C 水浴中轻轻振荡过夜进行杂交。

4. 杂交后洗涤及抗体杂交

  1. 从胚胎中移除含有探针的杂交溶液，并转移至新的闪烁瓶或微量离心管中。探针可于 -20 °C 保存，供日后重复使用。进行杂交后洗涤时，将胚胎置于置于6孔细胞培养板中的Netwell装置内。
  2. 用预热的溶液#1洗涤3次，每次30分钟，于70 °C 条件下振荡。
  3. 用预热的溶液#2洗涤3次，每次30分钟，于70 °C 条件下振荡。
  4. 用TBST洗涤3次，每次5分钟，室温振荡。
  5. 用含10%热灭活羊血清的TBST于室温封闭1小时，振荡。
  6. 将胚胎从Netwell转移至新的玻璃闪烁瓶中。加入用1%热灭活羊血清/TBST稀释的抗DIG Fab片段抗体（1:5,000），4 °C 振荡孵育过夜。

5. 抗体杂交后洗涤

  1. 移除抗体并弃去。将胚胎放回Netwell中进行洗涤。
  2. 在TBST中洗涤3次，每次5分钟，室温下摇动。
  3. 至少洗涤6次，每次1小时，室温下摇动。
  4. 在TBST中过夜洗涤，4 °C下摇动。由于抗体后洗涤有助于降低背景染色，因此增加洗涤次数和延长洗涤时间更为理想。通常胚胎会在4 °C的TBST中过周末持续洗涤。

6. 探针的检测

  1. 配制新鲜的NTMT溶液，并过滤除菌。
  2. 弃去TBST洗涤液，将胚胎转移至洁净的玻璃闪烁瓶中。用新鲜NTMT在室温下振荡洗涤胚胎3次，每次10分钟。
  3. 移除NTMT洗涤液，加入含1× NBT / 1× BCIP的NTMT反应混合液。由于这些试剂对光敏感，需用铝箔包裹闪烁瓶，并在室温下振荡反应。
  4. 每15分钟观察一次显色反应，直至目标基因表达清晰可见。强信号探针可能仅需10分钟即可显色，弱信号探针则可能需要1–2小时。反应时间不宜过长，否则会出现背景染色（整个胚胎呈现暗紫色或棕色）。
  5. 在PBT中室温振荡洗涤2次，每次10分钟。
  6. 用含4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的固定液在室温下后固定胚胎1小时。胚胎可在4 °C的固定液中长期保存。
  7. 使用解剖体视显微镜观察胚胎。如需获得浅蓝色背景以用于拍照，可将胚胎置于含有预先凝固的1%琼脂糖/PBS的培养皿中。

7. I. RNA 整体原位杂交的代表性结果 原位 海洋软骨鱼类的杂交

RNA整体原位杂交 原位表达的 Sonic hedgehog (Shh）和 Hoxa13 在鳐鱼胚胎中显示 图1表达 Shh 在高等脊椎动物中存在于脊索和肠内胚层，这种表达模式在鳐中是保守的图1a) 8,9 海洋软骨鱼类具有一种独特的渗透压调节方式，即通过直肠腺分泌盐分。 Hoxa13 在发育中的直肠腺中表达量较高（图1b) 10. Hoxa13 直肠腺体模式形成的基因产物作用仍不清楚。

II. 软骨鱼类组织的石蜡包埋与切片

1. 组织的收获与制备

  1. 解剖所需组织，并在10%福尔马林中固定24–48小时，室温下摇动。也可使用4%多聚甲醛（PFA）作为固定剂（见讨论部分）。
  2. 用PBS洗涤组织，每次30分钟，共洗3次，以去除固定剂。根据组织大小，洗涤时间可缩短至10分钟或延长至1小时。
  3. 通过在25%、50%和75%乙醇:PBS溶液中依次洗涤，进行胚胎脱水处理，室温下摇动。每次洗涤时间仍取决于组织大小。对于0.5 cm3的组织，每次洗涤孵育15分钟；较大组织块应相应延长洗涤时间。若需长期保存组织，可在75%乙醇中额外洗涤两次，随后于-20 °C保存，最长可达一年。否则继续进行下一步。
  4. 用100%乙醇洗涤3次，每次15分钟，持续摇动，进一步脱水。

2. 石蜡包埋与切片

  1. 在带螺旋盖的玻璃闪烁瓶中，用二甲苯清洗组织两次，每次5分钟，以澄清组织。二甲苯会使组织变脆，因此总清洗时间不得超过10分钟。将组织对着光源观察时应呈半透明状。如果经过两次清洗后组织仍然非常不透明，可再用二甲苯额外清洗5分钟，然后继续后续操作步骤。操作二甲苯时必须在通风橱内佩戴手套进行。
  2. 去除二甲苯，将闪烁瓶装至2/3满的熔融石蜡。在60 °C烘箱中孵育30分钟。将石蜡加入瓶中时，会观察到石蜡在瓶壁周围凝固。将瓶子放入烘箱，加热数分钟使石蜡重新溶解。取出瓶子，快速旋转混匀，再放回烘箱完成剩余孵育时间。
  3. 重复上述石蜡孵育步骤两次，每次30分钟。
  4. 再进行两次石蜡孵育，每次1小时。最后一次更换石蜡后，在60 °C烘箱中过夜孵育。
  5. 次日，将组织置于加热的石蜡浴室中，并在真空条件下处理2–3小时。此步骤有助于石蜡充分渗入组织并去除任何气泡。对于某些较薄的组织类型，可能无需真空处理；但对于完整胚胎、消化道或其他具有腔室结构的器官，则此步骤必不可少。
  6. 经真空辅助渗透后，将组织置于盛有熔融石蜡的金属模具中，在冰板上冷却。在尝试从模具中取出组织前，需在冰上或4 °C环境中静置过夜。组织石蜡块可在4 °C长期保存。
  7. 将石蜡包埋块置于切片机上，切取8 μm厚的切片。切片应在48 °C加热的水浴中展平，然后捞取至玻璃Superfrost*Plus载玻片上。
  8. 将载玻片置于37 °C烘箱中过夜干燥。
  9. 切片可在4 °C保存，直至后续使用。

III. 软骨鱼类组织的阿利新蓝/核固红染色

1. 黏蛋白的阿辛蓝染色

  1. 将切片朝上的载玻片置于载玻片加热板上，加热45分钟。
  2. 将载玻片放入载玻片架中。后续所有溶液均置于通风橱内的染色缸中。通过将载玻片从一个装有溶液的染色缸转移至另一个进行清洗。确保染色缸中的液面高于载玻片，使载玻片上的组织完全浸没。用二甲苯洗涤载玻片两次，每次5分钟，以溶解石蜡。
  3. 用100%乙醇洗涤载玻片两次，每次1分钟。
  4. 在乙醇梯度溶液（75%、50%、25%乙醇）中逐级复水，每种溶液洗涤1分钟。再用dH2O洗涤1分钟。
  5. 在pH 2.5的阿利新蓝染液中染色15分钟。
  6. 用流动的自来水冲洗3分钟以显色，随后在dH2O中浸洗一次。
  7. 用核固红复染液复染10分钟。
  8. 用流动的自来水冲洗3分钟，并在dH2O中浸洗一次。
  9. 在乙醇梯度溶液（25%、50%、75%、100%、100%）中脱水，每个浓度20次浸洗（或每级1分钟）。用二甲苯洗涤两次，每次5分钟。使用DPX封片剂和盖玻片封片。封片后将载玻片置于通风橱中静置48小时，待封片剂完全干燥硬化后再进行后续操作。

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结果

不同部位的L. erinacea消化道中阿尔新蓝染色的示例如图2所示。在整个消化道中，含酸性黏液的杯状细胞经阿尔新蓝染色后清晰可见。酸性黏液在消化道不同区域的分布存在差异，反映了各区域功能的不同。螺旋肠和泄殖腔中酸性黏液产生较少，而在远端肠中酸性黏液浓度较高（比较图2a和2c与2b）。

PBT1 x PBS
0.1% Tween-20
使用 Nalgene 类型组织培养滤器过滤除菌。
20 x SSC，pH 4...

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讨论

所介绍的方案是监测基因表达和鉴定已分化细胞类型的经典方法，且已针对海洋软骨鱼类进行了适应性调整。进一步修改这些方案可能有助于适用于不同的软骨鱼类物种。

关于RNA整体原位杂交（in situ）最常见的问题是RNase污染的风险，这可能导致RNA探针和内源性RNA分子的降解。需要考虑两个方面：一是核糖探针的合成及其与胚胎RNA的杂交过程，二是RNA操作的一般技术。通常情况下，可通过使用未开封容器中的塑料器皿和未曾使用过的玻璃器皿来避免RNase污染。若无法获得新的玻璃器皿，应使用RNase-AWAY（VWR#17810-491）处理所有玻璃器皿。洗涤步骤可通过将溶液轻轻倾倒过带孔的勺子，并向小瓶中加入新鲜溶液完成。 alternatively，非常小的胚胎或器官/组织可置于适配于6孔细胞培养板的Netwell装置中。通过简单地将Netwell从一个孔转移至下一个孔，即可实现组织在不同溶液间的转移。这种方法有助于防止倾倒过程中组织丢失，并保持组织结构的完整性。有关RNA操作及防止RNase污染的更多建议，可参见《分子克隆：实验室手册》（Molecular Cl...

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致谢

我谨向许多在本实验室工作并为这些实验方案的发展做出贡献的本科学生表示感谢。NAT 获得了斯基德莫尔-联合网络的支持，该网络是通过美国国家科学基金会（NSF）ADVANCE PAID 项目资助建立的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 x 转录缓冲液Roche11-465-384-001
DIG-RNA 标记混合物Roche11-277-073-910
RNase 抑制剂Roche03-335-399-001
RNA 聚合酶 - SP6Roche10-810-274-001
DNAseI，无 RNaseRoche10-776-785-001
酵母 RNAInvitrogen15401-029
CHAPSEMD-Millipore220201
肝素Sigma-AldrichH4784
DEPC（焦碳酸二乙酯）Research Organics2106D
Moria 穿孔勺Fine Science Tools10370-17
Netwell 插件Electron Microscopy Sciences64713-00用于 6 孔组织培养板的 Netwell
6 孔组织培养板Corning3516
带螺旋盖的玻璃闪烁瓶Weaton Science Products986540
甲酰胺FisherBP227500
蛋白酶 KInvitrogen59895 (AM2542)
NBT11585029001
BCIPRoche11585002001
过氧化氢，30%EMDHX0635-1
羊血清VWR101301-478
戊二醛Sigma-AldrichG5882
tRNARoche10-109-541-001
抗 DIG Fab 片段Roche1137-6623
表 3. RNA 整体原位杂交所用试剂与设备in situ 杂交。
1% 阿辛蓝 8GS，pH 2.5Electron Microscopy Sciences26323-01
核固红Electron Microscopy Sciences26078-05
DPX 封片剂Electron Microscopy Sciences13510
石蜡（Paraplast X-tra）McCormick Scientific39503002
10% 甲醛，NBFVWR95042-908
带螺旋盖的玻璃闪烁瓶Weaton Science Products986540
不锈钢底模Tissue-Tek4161-4165提供多种尺寸。
包埋盒Tissue-Tek4170
载玻片烘片仪Fisher-Scientific12-594Q
组织包埋机Leica MicrosystemsEG1160
轮转式切片机Leica MicrosystemsRM2235
Tissue-Tek 载玻片染色套装Electron Microscopy Sciences62540-01
Tissue-Tek 24 片载玻片架Electron Microscopy Sciences62543-06
Superfrost*Plus 载玻片Fisherbrand12-550-17
表 4. 阿辛蓝染色所用试剂与设备。

参考文献

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