细胞生长速率是一个受调控的过程，也是决定细胞生理状态的主要因素。利用恒化器进行连续培养，可通过营养限制对外部细胞生长速率进行控制，从而有助于研究调控细胞生长的分子网络，以及这些网络如何演化以优化细胞生长。
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本文内容
摘要
摘要
细胞通过响应外部环境信号来调节其生长速率。随着细胞的生长，必须协调多种细胞过程，包括大分子合成、代谢活动，以及最终对细胞分裂周期的启动。恒化器（chemostat）是一种可实验性控制细胞生长速率的方法，为系统研究生长速率如何影响细胞过程——包括基因表达和代谢——以及调控细胞生长速率的调控网络提供了强有力的手段。当持续培养数百代时，恒化器可用于研究微生物在限制细胞生长的环境条件下发生的适应性进化。本文阐述了恒化器培养的基本原理，演示其操作方法，并举例说明其多种应用。在20世纪中叶被引入后经历了一段时期的沉寂，如今随着基因组规模研究技术的发展，以及人们对细胞生长调控和适应性进化分子基础的重新关注，恒化器在生物学研究中的应用正迎来复兴。
引言
细胞的生长受到复杂的遗传因素和环境因素相互作用网络的调控1,2。细胞生长的多因素调控特性要求必须采用系统层面的方法对其进行研究。然而，由于在实验中难以精确控制细胞生长速率，对受调控细胞生长的严格研究面临挑战。此外，即使在最简单的实验中，随着细胞不断增殖，其胞外环境也常常是动态且复杂的。化学恒浊器（chemostat）为此提供了一种解决方案：该方法能够在定义明确、恒定且可控的环境中培养细胞，从而实现对细胞生长速率的实验调控。
1950年，Monod3 与 Novick & Szilard4 分别独立描述了使用恒化器进行连续培养的方法。最初的设计是将细胞培养在固定体积的培养基中，通过持续添加新鲜培养基并同时移除旧培养基和细胞，实现培养体系的不断稀释（图1）。联立的常微分方程（图2）用于描述恒化器中细胞密度（x）和生长限制性营养物质浓度（s）的变化速率。重要的是，该方程组预测存在唯一的（非零）稳定稳态（图3），其显著含义在于：在稳态条件下，细胞的比生长速率（即 指数生长速率常数）等于培养物的稀释速率（D）。通过调节稀释速率，可以在不同的生长速率和不同营养限制条件下建立细胞的稳态种群。
利用恒....
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方案
利用恒化器实现连续培养的原理可以通过多种方式实现。在所有恒化器中，必须具备以下条件：1）保持所有组件无菌的方法，2）充分混匀的培养体系，3）培养容器的适当通气，以及4）可靠的培养基添加和培养物移除手段。本文介绍使用Sixfors生物反应器（Infors Inc）作为恒化器的操作方法，这些方法可轻松适用于其他替代装置。
1. 组装恒化器装置
- 使用主开关打开 Sixfors。
- 用去离子水（DI 水）彻底冲洗恒化器反应罐、搅拌组件及连接的管路。检查所有管路和 O 形圈，更换任何磨损的部件。
- 确保驱动轴支撑底座朝上位于玻璃反应罐内，并且驱动轴顶部已卡入搅拌组件的外壳中。将搅拌组件放入玻璃反应罐，确保驱动轴底部已插入驱动轴支撑座中。使用夹具将搅拌组件固定在玻璃反应罐上。
- 向反应罐中加入约 300 ml 的去离子水。
- 取下溶氧（dO2）探头的保护帽，通过拧下底部外壳检查电解液液位，确保底部外壳内填充了半满的电解液。重新拧紧底部外壳，并将其插入恒化器反应罐的接口中，用手拧紧至合适位置。
- 取一支 pH 探头，从储存缓冲液（3 M KCl）中取出，取下 pH 探头帽，并将其连接至发酵罐 1。在 Sixfors 控制屏上进入发酵罐参数菜单，选择“校准 pH”。将 pH 探头插入标准 pH 7 缓冲液中，记录读数为高值（High Read）；再用 pH ....
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结果
恒化器的一个主要优势是能够通过改变稀释速率来实验性地控制细胞的生长速率。在出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，细胞的形态可反映其在细胞分裂周期中的所处阶段。通过测定无出芽细胞所占比例可以发现，生长速率较高的群体中含有更高比例的正在活跃分裂的细胞（图 5A）。在恒化器培养物中对全局mRNA表达的分析表明，许多基因的表达随生长速率的不同而呈现差异表达图5B 和 图5C).
通过使用荧光标记细胞并结合流式细胞术分析，在恒化器中进行竞争实验可以测定不同基因型的相对适合度（图6A）。图6B 显示了一个代表性结果，其中突变株与荧光标记的野生型菌株进行竞争。在此示例中，突变株每代具有40%的生长速率优势。相比之下，未标记的野生型菌株与荧光标记的野生型菌株竞争时，其生长速率无差异。
恒化器可对细胞施加明确且持续的选择压力。通过全基因组测序分析，可以.......
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讨论
恒化器能够实现微生物在受控生长的稳态条件下培养。细胞以恒定速率持续生长，从而维持外部环境不变。这与分批培养方法形成对比，在分批培养中，外部环境持续变化，细胞生长速率由环境与基因型之间的复杂相互作用决定。因此，与分批培养相比，恒化器培养微生物的一个主要优势在于能够实验性地控制细胞的生长速率。
细胞的生长速率是多种细胞过程相互作用的结果，包括营养感知、信号转导、大分子合成和代谢。通过将恒化器与全局分析方法相结合，可以研究生长速率如何影响细胞内的基本过程，反之亦然，即细胞如何调节和协调其细胞过程与生长速率之间的关系。在野生型细胞中的研究表明，RNA和蛋白质的细胞内浓度受到细胞生长速率的显著影响6，而最近的研究进一步表明，转录组10,12,13和代谢组8也受到细胞生长速率的显著调控。
在恒化器中研究突变体行为，为探索调控生长速率的重要通路提供了潜在的强有力手段14。利用对数千个突变体的分子条形码文库进行高通量测序15，现在已可.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由纽约大学的启动资金资助。我们感谢Maitreya Dunham和Matt Brauer，他们最初开发了将Sixfors生物反应器用作恒化器的方法。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Infors-HT Sixfors 恒化器 | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| 9.5 L 玻璃瓶 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-887-1 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 夹管阀 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 05-867 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 12 号绿色氯丁橡胶塞 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-62991-42 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 直通接头 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-30703-02 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 通用绑扎带，4 英寸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | NC9557052 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 硅胶管路 | Small Parts | B000FMWTDE | 用于培养基容器及管路连接 |
| 硅胶管路，外径 3/8 英寸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-587-1Q | 用于培养基容器及管路连接 |
| 硅胶管路，外径 7/32 英寸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-587-1E | 用于培养基容器及管路连接 |
| 不锈钢管路，外径 3/16 英寸 | McMaster-Carr | 6100K164 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 不锈钢管路，外径 3/8 英寸 | McMaster-Carr | 6100K161 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 钩形接头 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 14-66-18Q | 用于培养基容器及管路连接 |
| 棘轮夹 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-06403-11 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 鲁尔接头，雌性 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-45512-34 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 鲁尔接头，雄性 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-45513-04 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 密理博 Aervent MTGR05010 62 mm 滤膜，0.2 μm | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | MTGR05010 | 用于培养基容器及管路连接 |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm 滤膜，0.2 μm | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | NC9131037 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 空气用直读式流量计 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-32047-77 | 用于氮气装置 |
| 氮气用直读式流量计 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-32048-63 | 用于氮气装置 |
| 多管式气体比例调节器框架 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-03218-50 | 用于氮气装置 |
| 两级分析级调压器 | Airgas | Y12-N145D580 | 用于氮气装置 |
| 不锈钢软管接头 | Airgas | Y99-26450 | 用于氮气装置 |
| 雄性软管接头 | Airgas | WES544 | 用于氮气装置 |
| Norprene 管路 | US Plastics | 57280 | 用于氮气装置 |
| 三脚架底座 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-03218-58 | 用于氮气装置 |
| 阀芯组件 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-03217-92 | 用于氮气装置 |
| 10 L 塑料大瓶 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-963-2A | 用于培养基制备 |
| Steritop 无菌真空瓶顶过滤器，1,000 ml，PES 膜；适用于 45 mm 瓶口 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | SCGP-T10-RE | 用于培养基制备 |
| 培养基瓶，100 ml，45 mm 瓶口 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | FB-800-100 | 用于培养基制备 |
| 氯化钙·2H2O | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | C79-500 | 培养基试剂 |
| 氯化钠 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP358-1 | 培养基试剂 |
| 硫酸镁·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | 培养基试剂 |
| 磷酸二氢钾 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC424205000 | 培养基试剂 |
| 硫酸铵 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC423400010 | 培养基试剂 |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P9541 | 培养基试剂 |
| 硼酸 | Sigma Aldrich | B6768 | 培养基试剂 |
| 硫酸铜·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | 培养基试剂 |
| 碘化钾 | Sigma Aldrich | 60400 | 培养基试剂 |
| 氯化铁·6H2O | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | I88-100 | 培养基试剂 |
| 硫酸锰·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | 培养基试剂 |
| 钼酸钠·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | 培养基试剂 |
| 硫酸锌·7H2O | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | Z68-500 | 培养基试剂 |
| 生物素 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP232-1 | 培养基试剂 |
| 泛酸钙 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC24330-1000 | 培养基试剂 |
| 叶酸 | Sigma Aldrich | F7876 | 培养基试剂 |
| 肌醇（又称 myo-肌醇） | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC12226-1000 | 培养基试剂 |
| 烟酸（又称烟酰酸） | Sigma Aldrich | N4126 | 培养基试剂 |
| 对氨基苯甲酸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC14621-2500 | 培养基试剂 |
| 盐酸吡哆醇 | Sigma Aldrich | P9755 | 培养基试剂 |
| 核黄素 | Sigma Aldrich | R4500-25G | 培养基试剂 |
| 盐酸硫胺素 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP892-100 | 培养基试剂 |
| 亮氨酸 | Sigma Aldrich | L8000-100G | 培养基试剂 |
| 尿嘧啶 | Sigma Aldrich | U0750 | 培养基试剂 |
| 葡萄糖 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | DF0155-08-5 | 培养基试剂 |
参考文献
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950). <....
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