细胞生长速率是一个受调控的过程，也是决定细胞生理状态的主要因素。利用恒化器进行连续培养，可通过营养限制对外部细胞生长速率进行控制，从而有助于研究调控细胞生长的分子网络，以及这些网络如何演化以优化细胞生长。
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摘要
摘要
细胞通过响应外部环境信号来调节其生长速率。随着细胞的生长，必须协调多种细胞过程，包括大分子合成、代谢活动，以及最终对细胞分裂周期的启动。恒化器（chemostat）是一种可实验性控制细胞生长速率的方法，为系统研究生长速率如何影响细胞过程——包括基因表达和代谢——以及调控细胞生长速率的调控网络提供了强有力的手段。当持续培养数百代时，恒化器可用于研究微生物在限制细胞生长的环境条件下发生的适应性进化。本文阐述了恒化器培养的基本原理，演示其操作方法，并举例说明其多种应用。在20世纪中叶被引入后经历了一段时期的沉寂，如今随着基因组规模研究技术的发展，以及人们对细胞生长调控和适应性进化分子基础的重新关注，恒化器在生物学研究中的应用正迎来复兴。
引言
细胞的生长受到复杂的遗传因素和环境因素相互作用网络的调控1,2。细胞生长的多因素调控特性要求必须采用系统层面的方法对其进行研究。然而，由于在实验中难以精确控制细胞生长速率，对受调控细胞生长的严格研究面临挑战。此外，即使在最简单的实验中，随着细胞不断增殖，其胞外环境也常常是动态且复杂的。化学恒浊器（chemostat）为此提供了一种解决方案：该方法能够在定义明确、恒定且可控的环境中培养细胞，从而实现对细胞生长速率的实验调控。
1950年，Monod3 与 Novick & Szilard4 分别独立描述了使用恒化器进行连续培养的方法。最初的设计是将细胞培养在固定体积的培养基中，通过持续添加新鲜培养基并同时移除旧培养基和细胞，实现培养体系的不断稀释（图1）。联立的常微分方程（图2）用于描述恒化器中细胞密度（x）和生长限制性营养物质浓度（s）的变化速率。重要的是，该方程组预测存在唯一的（非零）稳定稳态（图3），其显著含义在于：在稳态条件下，细胞的比生长速率（即 指数生长速率常数）等于培养物的稀释速率（D）。通过调节稀释速率，可以在不同的生长速率和不同营养限制条件下建立细胞的稳态种群。
利用恒化器对生长速率进行实验控制，对于理解细胞生理如何随生长速率变化至关重要5,6。然而，在20世纪后期分子生物学研究迅猛发展的过程中，这一微生物学方法的支柱技术逐渐被忽视。如今，随着人们对微生物和多细胞生物生长调控的兴趣重新兴起，以及基因组规模的系统水平分析方法的出现，恒化器的应用再次受到重视。本文中，我们介绍了三种应用，它们充分利用了恒化器在精确控制细胞生长速率和外部环境方面的独特优势。首先，我们描述了如何利用恒化器研究数千种生物分子（如转录本和代谢物）的丰度如何随生长速率协调调控。其次，我们阐述了如何通过竞争实验，在营养受限环境中利用恒化器精确估计不同基因型之间生长速率的差异。第三，我们说明了如何利用恒化器研究细胞在恒定贫营养环境中的适应性进化。这些实例展示了恒化器如何推动在系统水平上对细胞生长调控、基因与环境相互作用以及适应性进化的深入研究。
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方案
利用恒化器实现连续培养的原理可以通过多种方式实现。在所有恒化器中，必须具备以下条件：1）保持所有组件无菌的方法，2）充分混匀的培养体系，3）培养容器的适当通气，以及4）可靠的培养基添加和培养物移除手段。本文介绍使用Sixfors生物反应器（Infors Inc）作为恒化器的操作方法，这些方法可轻松适用于其他替代装置。
1. 组装恒化器装置
- 使用主开关打开 Sixfors。
- 用去离子水（DI 水）彻底冲洗恒化器反应罐、搅拌组件及连接的管路。检查所有管路和 O 形圈，更换任何磨损的部件。
- 确保驱动轴支撑底座朝上位于玻璃反应罐内，并且驱动轴顶部已卡入搅拌组件的外壳中。将搅拌组件放入玻璃反应罐，确保驱动轴底部已插入驱动轴支撑座中。使用夹具将搅拌组件固定在玻璃反应罐上。
- 向反应罐中加入约 300 ml 的去离子水。
- 取下溶氧（dO2）探头的保护帽，通过拧下底部外壳检查电解液液位，确保底部外壳内填充了半满的电解液。重新拧紧底部外壳，并将其插入恒化器反应罐的接口中，用手拧紧至合适位置。
- 取一支 pH 探头，从储存缓冲液（3 M KCl）中取出，取下 pH 探头帽，并将其连接至发酵罐 1。在 Sixfors 控制屏上进入发酵罐参数菜单，选择“校准 pH”。将 pH 探头插入标准 pH 7 缓冲液中，记录读数为高值（High Read）；再用 pH 4 缓冲液重复操作，记录读数为低值（Low Read）。校准完成后，将 pH 探头从发酵罐上取下，用去离子水冲洗，然后插入恒化器反应罐的接口中，用手拧紧至合适位置。
- 将恒化器反应罐放入支架中。在反应罐上注明该 pH 探头连接并校准所用的发酵罐编号（1-6）。将 pH 探头帽盖回 pH 探头上。用铝箔紧密包裹溶氧（dO2）探头顶部。
- 将连接在恒化器反应罐上的管路末端用铝箔包裹。
- 对所有反应罐重复步骤 1.2 至 1.8。
- 将反应罐置于高压灭菌器中，在液体循环模式下灭菌 15 分钟。
2. 准备培养基
- 通过在不同营养物浓度下培养分批培养物，确定营养物的限制浓度范围。当最终细胞密度与初始营养物浓度呈线性关系时，该范围即为营养物限制范围（图4）。选择一个处于该限制范围内且浓度适宜的营养物浓度。Saccharomyces cerevisiae 研究中常用培养基配方示例见文献7-11。
- 将一个带有橡胶塞的空储液瓶进行高压灭菌，橡胶塞上需装有通气口和培养基出口，并在灭菌前确保培养基管路末端已用铝箔包裹。
- 在另一个容器中配制10 L培养基。
- 将一个500 ml滤杯连接至一个100 ml培养基瓶上。用经乙醇灭菌的镊子移除棉质滤芯，并立即将其连接到培养基储液瓶的过滤接口上。
- 将培养基储液瓶连接至真空源，通过将培养基加入滤杯的方式进行过滤除菌。
- 当培养基过滤完成后，使用金属夹关闭过滤接口。
3. 校准溶解氧（dO2）探头并设置恒化器
- 在恒化器容器经过高压灭菌并冷却后，将其放入相应的加热套中。连接温度探针、pH探针和溶解氧探针2 探头。让容器在通电状态下静置至少6小时，以使溶解氧2 探针用于极化。
- 将每根流出管的末端放入单独的收集容器中。通过已灭菌的过滤器连接气源，并开启气流。每个容器中的水应从流出管流出，表明所有密封均完好。
- 根据所需的 working volume 调整流出管的高度（例如 300 ml）。我们使用带有刻度的直尺，其上标注了对应不同工作体积的试管放置位置。
- 将培养基瓶与恒化器反应 vessel 连接。使用乙醇以尽可能保持管路末端无菌。将蠕动泵管穿过泵体并打开夹子。手动按压泵体，直至培养基开始流入恒化器反应 vessel。松开泵上的管路，培养基应能自由流入恒化器反应 vessel。当培养基液面达到出流管时，重新将管路装回泵体并夹紧。
- 启动基础程序，将搅拌桨转速设为 400 rpm，温度设为 30 °C。
- 为了校准 dO2 探针，关闭空气供应并切换至氮气。等待至少一小时后记录测量值为“低读数”。切换回空气供应（即 （含环境氧浓度），再等待至少一小时后记录测量值为“高读数”。
- 使用 Iris 软件开始数据记录。
4. 接种
- 使用70%乙醇对培养容器顶部进行消毒。
- 拧开容器盖，用移液器将1 ml过夜培养物加入恒化器容器中，然后重新拧紧盖子。
- 在Iris系统中记录接种时间。
- 等待约24小时，使培养物达到早期稳定期。随着培养物生长，溶解氧和pH值会下降。在葡萄糖限制性培养基中，稳定期时溶解氧将回升至约100%；而对于其他营养限制条件，稳定期时溶解氧将保持在<100%。
5. 启动泵并达到稳态
- 稀释速率通过将流速（每小时流入反应器的培养基体积）除以培养体积来计算。例如，当培养体积为 300 ml 时，稀释速率 0.1 表示每小时向培养体系中加入 30 ml 培养基。由于系统处于正压状态，相同体积的液体将从反应器中排出，从而确保培养物持续被稀释。可使用的稀释速率（D）范围不得超过细胞的最大生长速率（μmax），否则细胞将被冲出恒化器。
- 设定泵的工作参数，即泵开启和关闭的时间（秒数），以建立所需的流速。该泵输送培养基的速率为约 0.11 ml/sec。
- 使用 Sixfors 界面定义一个程序，设定泵的运行时序、温度和搅拌桨转速，并启动该程序。
- 清空收集容器中的液体，并记录时间。
- 至少两小时后，使用量筒测量从反应器中排出的培养基体积。该体积等于添加到恒化器反应器中的体积。计算稀释速率（D = Veffluent/Vculture/time）。若计算得到的稀释速率与目标稀释速率不符，则调整泵的设置。
- 在稳态下，恒化器中的细胞密度不随时间变化。可通过取样流出液来测量该状态，且不会干扰培养体系。我们将稳态的达成操作性地定义为至少相隔一个群体倍增时间的两次细胞密度测量结果相同。在开始培养稀释后，大约需要经过八代培养才能达到稳态。在稳态下，细胞在营养受限条件下呈指数生长（即 生长速率随时间保持恒定）。群体的倍增时间（世代时间）为 ln(2)/D。
- 在整个实验过程中，持续定期测量流出液体积，以确保稀释速率保持恒定。
6. 应用示例1：在稳态条件下研究以不同速率生长的细胞
- 在恒化器的稳态条件下，细胞群体的生长速率等于稀释速率。通过系统地改变稀释速率，可以在不同生长速率下培养细胞。这使得能够系统性地研究随生长速率变化的生理参数，包括细胞体积、细胞周期阶段和抗应激能力。此外，还可检测在不同生长速率下生长的细胞中全局性的 mRNA、蛋白质和代谢物水平的稳态谱型。获取样品有两种方式：
- 可通过将流出管末端放入 1.5 ml 或 15 ml 离心管中被动获取少量样品。几分钟内（取决于流速）即可获得 1–5 ml 的样品。这些样品可用于测定多种生理参数。
- 基因表达或代谢物分析需要较大体积的样品，且必须尽快获取。将流出管末端放入一个 15 ml 的锥形离心管中，松开固定流出管金属端的螺丝并轻轻下压，约 10 ml 的样品将迅速充满离心管。需注意此时恒化器容器中的体积已发生变化。若连续多次取样，可能需要降低流速以维持恒定的稀释速率。
7. 应用实例2：利用基于流式细胞术的竞争实验在受控环境中精确测量不同基因型间生长速率的差异
- 恒化器可用于精确定量营养物质浓度对生长速率差异的影响即 不同遗传背景之间的适合度差异。通过共培养标记有不同荧光蛋白的菌株，测定其在指数生长期相对丰度变化的速率。在不同稀释率下进行该实验（D）可用于研究营养物质浓度的影响（s在适合度差异方面的研究。
- 在两个独立的恒化器中，分别建立两种菌株的稳态培养，保持相同的稀释速率和300 ml的培养体积。
- 从每个容器中被动吸取1 ml样品。离心收集细胞，重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于4 °C保存。这些样品含有均一的细胞样本，作为后续流式细胞术分析的对照。
- 将一个容器的出流管末端放入已灭菌的量筒中。松开固定出流管金属端的螺丝，轻轻下压以排出恒化器中的细胞。当液体体积达到150 ml时，将出流管的金属端恢复至原始位置（300 ml处）。对第二个容器重复此操作，使用另一个不同的量筒。
- 使用70%乙醇保持无菌，拆下恒化器容器顶部的螺丝。将漏斗放入开口，从另一培养物中倒入150 ml至恒化器容器中。重新拧紧螺丝。使用第二个漏斗对第二个容器重复上述操作。每个恒化器容器现在均含有两种菌株的混合物。
- 每隔2-6小时通过被动取样从每个容器中采集1 ml样品。离心收集细胞，重悬于PBS中，4 °C保存。持续取样2-3天，并准确记录每次取样的时间。
- 实验结束时，将样品超声处理并稀释至约 2 x 106 细胞/毫升。使用流式细胞术测定每个样品中两种菌株的比例。由于两种菌株均处于指数生长期，相对生长速率差异通过线性回归确定 ln(菌株1/菌株2) 与时间（以世代为单位测量）的关系。回归线的斜率表示生长速率的成比例差异（即 一种菌株相对于另一种菌株的适应性优势
- 由于混合培养达到新的稳态可能需要一定时间，早期时间点的数据与回归模型的拟合效果可能较差。这一问题的最佳解决方法是等待2-3个世代后再开始取样，或剔除明显偏离的早期异常数据点。相反，当其中一种菌株已完全淘汰另一种菌株后，数据将不再具有分析价值，这些时间点也应予以排除。
8. 应用实例3：实验进化
- 在恒化器中进行的实验进化会选择出在营养受限环境中适应性更强的突变体。选择过程通常持续数百代。
- 使用已知基因型（最好具有已知基因组序列）的菌株和明确的营养限制条件，建立稳态的恒化器培养体系。
- 为保留适应种群的“化石记录”，每隔2-3天被动取样一次恒化器培养物，并将样品置于含15%甘油的溶液中，于-80 °C保存。
- 监测培养基储液器，并根据需要补充新鲜培养基。
- 维持指数生长期的培养物生长数百代。
- 选择过程结束后，将细胞样品涂布于固体琼脂平板上。待菌落形成后，使用无菌牙签随机选取菌落，接种至含有100 μl培养基的96孔板的各个孔中。让克隆样品过夜生长后，加入100 μl 30%甘油，于-80 °C保存。
- 通过全基因组测序和表型分析对克隆进行表征，包括使用共荧光标记的参考菌株评估适应性，具体方法见应用示例2。
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结果
恒化器的一个主要优势是能够通过改变稀释速率来实验性地控制细胞的生长速率。在出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，细胞的形态可反映其在细胞分裂周期中的所处阶段。通过测定无出芽细胞所占比例可以发现，生长速率较高的群体中含有更高比例的正在活跃分裂的细胞（图 5A）。在恒化器培养物中对全局mRNA表达的分析表明，许多基因的表达随生长速率的不同而呈现差异表达图5B 和 图5C).
通过使用荧光标记细胞并结合流式细胞术分析，在恒化器中进行竞争实验可以测定不同基因型的相对适合度（图6A）。图6B 显示了一个代表性结果，其中突变株与荧光标记的野生型菌株进行竞争。在此示例中，突变株每代具有40%的生长速率优势。相比之下，未标记的野生型菌株与荧光标记的野生型菌株竞争时，其生长速率无差异。
恒化器可对细胞施加明确且持续的选择压力。通过全基因组测序分析，可以...
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讨论
恒化器能够实现微生物在受控生长的稳态条件下培养。细胞以恒定速率持续生长，从而维持外部环境不变。这与分批培养方法形成对比，在分批培养中，外部环境持续变化，细胞生长速率由环境与基因型之间的复杂相互作用决定。因此，与分批培养相比，恒化器培养微生物的一个主要优势在于能够实验性地控制细胞的生长速率。
细胞的生长速率是多种细胞过程相互作用的结果，包括营养感知、信号转导、大分子合成和代谢。通过将恒化器与全局分析方法相结合，可以研究生长速率如何影响细胞内的基本过程，反之亦然，即细胞如何调节和协调其细胞过程与生长速率之间的关系。在野生型细胞中的研究表明，RNA和蛋白质的细胞内浓度受到细胞生长速率的显著影响6，而最近的研究进一步表明，转录组10,12,13和代谢组8也受到细胞生长速率的显著调控。
在恒化器中研究突变体行为，为探索调控生长速率的重要通路提供了潜在的强有力手段14。利用对数千个突变体的分子条形码文库进行高通量测序15，现在已可...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由纽约大学的启动资金资助。我们感谢Maitreya Dunham和Matt Brauer，他们最初开发了将Sixfors生物反应器用作恒化器的方法。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Infors-HT Sixfors 恒化器 | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| 9.5 L 玻璃瓶 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-887-1 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 夹管阀 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 05-867 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 12 号绿色氯丁橡胶塞 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-62991-42 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 直通接头 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-30703-02 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 通用绑扎带，4 英寸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | NC9557052 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 硅胶管路 | Small Parts | B000FMWTDE | 用于培养基容器及管路连接 |
| 硅胶管路，外径 3/8 英寸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-587-1Q | 用于培养基容器及管路连接 |
| 硅胶管路，外径 7/32 英寸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-587-1E | 用于培养基容器及管路连接 |
| 不锈钢管路，外径 3/16 英寸 | McMaster-Carr | 6100K164 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 不锈钢管路，外径 3/8 英寸 | McMaster-Carr | 6100K161 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 钩形接头 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 14-66-18Q | 用于培养基容器及管路连接 |
| 棘轮夹 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-06403-11 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 鲁尔接头，雌性 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-45512-34 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 鲁尔接头，雄性 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-45513-04 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 密理博 Aervent MTGR05010 62 mm 滤膜，0.2 μm | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | MTGR05010 | 用于培养基容器及管路连接 |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm 滤膜，0.2 μm | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | NC9131037 | 用于培养基容器及管路连接 |
| 空气用直读式流量计 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-32047-77 | 用于氮气装置 |
| 氮气用直读式流量计 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-32048-63 | 用于氮气装置 |
| 多管式气体比例调节器框架 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-03218-50 | 用于氮气装置 |
| 两级分析级调压器 | Airgas | Y12-N145D580 | 用于氮气装置 |
| 不锈钢软管接头 | Airgas | Y99-26450 | 用于氮气装置 |
| 雄性软管接头 | Airgas | WES544 | 用于氮气装置 |
| Norprene 管路 | US Plastics | 57280 | 用于氮气装置 |
| 三脚架底座 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-03218-58 | 用于氮气装置 |
| 阀芯组件 | 科尔-帕默（Cole-Palmer） | EW-03217-92 | 用于氮气装置 |
| 10 L 塑料大瓶 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 02-963-2A | 用于培养基制备 |
| Steritop 无菌真空瓶顶过滤器，1,000 ml，PES 膜；适用于 45 mm 瓶口 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | SCGP-T10-RE | 用于培养基制备 |
| 培养基瓶，100 ml，45 mm 瓶口 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | FB-800-100 | 用于培养基制备 |
| 氯化钙·2H2O | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | C79-500 | 培养基试剂 |
| 氯化钠 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP358-1 | 培养基试剂 |
| 硫酸镁·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | 培养基试剂 |
| 磷酸二氢钾 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC424205000 | 培养基试剂 |
| 硫酸铵 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC423400010 | 培养基试剂 |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P9541 | 培养基试剂 |
| 硼酸 | Sigma Aldrich | B6768 | 培养基试剂 |
| 硫酸铜·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | 培养基试剂 |
| 碘化钾 | Sigma Aldrich | 60400 | 培养基试剂 |
| 氯化铁·6H2O | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | I88-100 | 培养基试剂 |
| 硫酸锰·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | 培养基试剂 |
| 钼酸钠·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | 培养基试剂 |
| 硫酸锌·7H2O | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | Z68-500 | 培养基试剂 |
| 生物素 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP232-1 | 培养基试剂 |
| 泛酸钙 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC24330-1000 | 培养基试剂 |
| 叶酸 | Sigma Aldrich | F7876 | 培养基试剂 |
| 肌醇（又称 myo-肌醇） | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC12226-1000 | 培养基试剂 |
| 烟酸（又称烟酰酸） | Sigma Aldrich | N4126 | 培养基试剂 |
| 对氨基苯甲酸 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AC14621-2500 | 培养基试剂 |
| 盐酸吡哆醇 | Sigma Aldrich | P9755 | 培养基试剂 |
| 核黄素 | Sigma Aldrich | R4500-25G | 培养基试剂 |
| 盐酸硫胺素 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP892-100 | 培养基试剂 |
| 亮氨酸 | Sigma Aldrich | L8000-100G | 培养基试剂 |
| 尿嘧啶 | Sigma Aldrich | U0750 | 培养基试剂 |
| 葡萄糖 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | DF0155-08-5 | 培养基试剂 |
参考文献
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