microRNA 在脑结构和功能中具有重要作用。本文介绍一种通过立体定位注射表达 microRNA 的慢病毒载体以实现海马区 microRNA 过表达的方法。该方法可作为相对快速评估 microRNA 功能的手段 体内 特定脑区中过表达miRNA的影响
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摘要
摘要
microRNA（miRNA）是一类长约22个核苷酸的小型单链调控性RNA分子，每种miRNA可靶向多个mRNA转录本，并通过诱导这些靶标的降解和/或抑制其翻译，从而减弱整个基因表达通路。多种miRNA在维持神经元结构与功能以及高级脑功能中发挥关键作用，因此人们亟需开发调控其表达水平的方法以深入探究这些功能。本文介绍一种直接的体内方法，通过立体定位注射编码miRNA的病毒颗粒，在小鼠中强制过表达miRNA，进而研究其对认知功能的影响。具体而言，本实验方案涉及将病毒注射至海马CA1区，该区域参与哺乳动物的记忆巩固、学习和应激反应，且适合作为注射位点。注射坐标以小鼠前囟为基准进行测量，病毒灌注过程由数字系统精确控制，并保持极慢流速。注射完成后缝合手术切口，动物恢复正常。为明确观察到的表型是否由特定miRNA与其靶标之间的相互作用引起，可使用编码相应mRNA靶标抑制元件的慢病毒进行验证；对照组包括未处理小鼠、注射生理盐水的小鼠以及注射“空载”慢病毒载体的小鼠。注射后一个月，采用莫里斯水迷宫（MWM）测试小鼠的空间导航学习与记忆能力。MWM是一个圆形水箱，内盛染色水，其中放置一个隐藏平台，平台顶端位于水面下1 cm处。水箱周围设置稳定的视觉线索，供小鼠进行空间定位（声音和地球磁场也可能辅助动物导航）。通过视频摄像系统记录小鼠游泳路径、找到并登上平台所需的时间。实验首先训练小鼠学会登上隐藏平台可作为强制游泳后的逃生途径；随后测试其利用该逃生策略的能力；最后移除平台，进行探测试验以评估小鼠是否记得平台先前的位置。连续数天的重复测试可揭示实验组小鼠表现改善，表现为更短的潜伏期找到并登上平台，以及更直接的游泳路径趋近平台或其原位置。若小鼠未能表现出此类进步，则提示存在学习记忆障碍和/或焦虑样行为，可进一步通过其他特异性行为学测试（例如高架十字迷宫）加以验证。该方法可用于验证特定miRNA及其靶转录本在认知功能和/或应激相关过程中的作用。
引言
近年来，多项研究通过慢病毒注射技术，对特定miRNA在神经系统功能中的作用提出了新的挑战。研究发现，miRNA对于维持和重塑突触结构1、突触形成2以及突触的重塑与维持3具有关键作用。这些研究表明，miRNA通过多层次的调控机制，参与了神经系统主要输出功能——认知功能的形成与维持。通过立体定位注射将慢病毒颗粒注入啮齿类动物大脑的特定区域，可用于研究突触形态和神经元活动的变化，并已用于确立过表达转录本的功能意义4,5。在脑部明确定义的区域直接对神经元进行表达miRNA的慢病毒感染，可能有助于衰老、脑部疾病及神经退行性病变的研究；而在行为调控领域对miRNA的研究6-8尚处于相对初级阶段，通过立体定位注射表达miRNA的慢病毒颗粒并结合行为学测试，可能对这类研究具有重要价值。另一种更为繁琐的诱导过表达或低表达的方法是利用基因工程构建的基因敲入或敲除小鼠模型。基因系统可实现条件性和时间性的表达调控（例如 Cre-Lox、Tet系统），但这些方法几乎无法达到注射操作所具有的空间特异性，且通常存在一定程度的泄漏表达。此外，基因工程方法无需手术操作，在不同实验室之间具有相对良好的可重复性；然而，其周期较长，且需要更多的人力与资金投入。相比之下，在注射小鼠模型中对过表达或低表达的时间控制则更为精确。
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方案
1. 慢病毒制备
- 将 HEK-293FT 细胞培养至 90% 汇合度。
- 转染当天，更换细胞培养基为无血清 DMEM，添加 1 mM 谷氨酰胺和 50 mg/ml 青霉素-链霉素。
- 使用 10 μl 浓度为 1 mg/ml 的聚乙烯亚胺作为载体，将 pLKO.1-Puro 载体、编码 delta R8.2 和 VSV-G 结构域的质粒以及目的 miRNA 的质粒共同转染细胞9。
- 在转染后 24 小时和 48 小时收集包装好的慢病毒，经 0.45 μm 滤器过滤。
- 在 15 °C 条件下，以 70,000 × g 超速离心 2 小时浓缩慢病毒，分装后于 -70 °C 保存。
- 通过将系列稀释的病毒液（每孔 1 至 10-6 ml 载体）感染 HEK-293T 细胞来测定病毒滴度。根据嘌呤霉素筛选结果及通过计数表达 GFP 的细胞来定量表达目的基因的病毒，评估滴度（建议最低滴度约为 1×109 个感染性颗粒/毫升）。
有关慢病毒制备的更详细方案，请参见10。
2. 手术前动物准备
- 外科医生应穿戴手术衣、无菌手套、帽子和口罩。
- 称量动物体重，然后根据每种药物规定的剂量，按体重比例通过腹腔注射给予氯胺酮混合物。对于氯胺酮/赛拉嗪混合物，小鼠通常使用的剂量范围为氯胺酮 80–200 mg/kg 和赛拉嗪 7–20 mg/kg。
- 等待动物完全麻醉后，通过伸展其后肢并用手指按压，检查后肢是否无退缩反射。
- 根据药品说明书，皮下注射力美达（Rimadyl）以缓解疼痛。力美达的典型剂量范围为 5–10 mg。
- 将动物置于加热垫上以维持稳定的体温，并用眼膏润湿眼睛。
- 使用修毛机剃除两耳之间的毛发。
- 用聚维酮碘对皮肤进行消毒。
3. 暴露颅骨与钻孔
- 将动物置于立体定位仪中，调整耳杆插入动物耳前的缝隙处。
- 使用手术刀在两耳之间做一条长约1.5 cm的前后向切口，并用手术钳（serfines）固定切口以保持开放。
- 用棉签清洁颅骨表面，直至冠状缝与矢状缝的交界处； 即 前囟点与冠状缝和人字缝交点； 即 λ，可见。
- 将固定在立体定位仪上的注射器针尖对准前囟点的三个轴向位置，记录下坐标值。该点将作为三个轴向的零点。
- 将注射器沿垂直轴抬起，以避免平面移动时划伤颅骨，并将注射器头部移至正确位置。海马CA1区注射相对于前囟的坐标（单位：mm）如下：前后轴 -2，内外侧轴 ±1.8，背腹轴 -1.5。
- 将注射器针尖 lowered 至接触颅骨，并用记号笔标记该位置。随后将注射器撤回，以避免刺伤。
- 使用精细钻头仅在颅骨上钻一个浅孔。操作时应稳定握持钻头，防止其继续钻入下方的软组织。可通过另一只手辅助固定持钻手，并以短促脉冲方式钻孔来避免此问题。
4. 慢病毒的注射
- 吸取0.5 ml浓缩的慢病毒溶液。
- 将注射器置于孔上方，缓慢垂直下降，直至接触颅骨表面。继续非常缓慢地将注射器插入脑组织。此步骤中可能出现少量出血，但这并不一定表示穿刺失败。若发生出血，可用棉签轻轻吸除。
- 将数字泵设置为0.02 ml/min（0.5 μl需在25分钟内注射完毕），开始输注。缓慢输注有助于病毒在组织中有效扩散，并防止回流。对于某些类型的注射器，可考虑在开始输注前，先将注射器额外深入0.5 mm，再退回到原定坐标位置进行注射。
- 输注完成后，额外等待5分钟，以使注射物质充分扩散至脑组织，而非回流至注射器形成的通道中。
- 非常缓慢地拔出注射器，并观察是否有回流现象。若在此步骤中观察到回流，则可能已有部分注射物质损失。
5. 伤口封闭与恢复
- 使用组织胶（histoacryl）封闭伤口，注意避免组织胶渗入眼睛。
- 通过腹腔注射（IP）给予动物 1 ml 预热的生理盐水，以防止脱水。
- 将动物置于放置在加热垫上的恢复笼中，并在恢复期间持续观察至少一小时。
若动物出现体重减轻、食欲减退、虚弱或无法获取饲料或饮水、濒死状态或感染等情况，应实施安乐死。可接受的啮齿类动物安乐死方法包括巴比妥类药物、吸入性麻醉剂、CO2、CO，或在全身麻醉基础上使用氯化钾。
4到6周后，在莫里斯水迷宫中评估动物的导航记忆能力。慢病毒通常会感染注射区域内的大多数细胞。
6. 莫里斯水迷宫中的行为学评估
- 在莫里斯水迷宫中训练动物。具体的训练和测试方案参见 11每次试验后，用干毛巾将动物擦干，放回笼中，并更换水箱中的水。
- 连续3天对动物进行莫里斯水迷宫测试，每天4次试验。每天将动物按迷宫的四个方向（东、南、西、北）依次放入，顺序每天轮换，例如第一天：东-西-北-南，第二天：西-南-北-东。每次试验后擦干动物。
- 在测试阶段，使用跟踪系统（如Noldus跟踪系统）追踪动物的运动轨迹。
- 12 小时后th 测试试验：将动物放入无平台的水箱中，持续一分钟，用于分析动物采用的搜索策略。
- 按照建议分析数据 12.
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结果
按照方案部分所述流速，向小鼠海马CA1区注射0.5 μl慢病毒，可在喙尾轴方向形成直径约1 mm、在内外侧轴和前后轴方向形成直径约0.5 mm的感染区域（图3）。
图 1. 前囟点与注射装置。（a）图示为切口完成后可见的前囟（冠状缝与矢状缝交点）和后囟（人字缝与矢状缝交点）的示意图。（b）显示立体定位仪主要机械部件的照片。
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讨论
立体定向注射慢病毒是一种相对较快的方法 体内 评估不同基因和miRNA的上调或下调。另一种主要方法是使用基因工程小鼠，但与直接注射慢病毒相比，该方法更为繁琐且耗时。此外，慢病毒注射可在成年小鼠的特定时间点实现基因表达调控，避免了发育过程中可能出现的渗漏表达问题，而这类渗漏在具有时间控制功能的基因工程小鼠中普遍存在。在研究神经退行性疾病中不同基因的功能时，精确的时间控制至关重要，因为这些疾病相关的基因表达改变通常发生在动物生命后期。此外，慢病毒注射还能实现精确的空间控制，而在基因工程系统中，空间特异性往往存在一定限度的渗漏。基因工程小鼠系统依赖于内源性转录因子的特异性，通过插入特定启动子序列，使其仅在特定脑区或细胞类型中激活表达。相比之下，慢病毒注射无需改变载体即可实现空间限制性表达。慢病毒注射的缺点在于需要进行复杂的手术操作，并且在不同实验室之间的可重复性尚存疑问。注射手术后，需等待一周至三周时间，以确保病毒充分发挥作用且动物完全恢复，之后方可进行行为学或生化等后续检测。对于要求诱导时间与各项检测时间紧密接近的研究，可采用带有时间控制系统的慢病毒载体，例如Cre-Lox系统，并在动物完全恢复后，使用抗生素作为诱导剂进行...
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本研究得到了埃德蒙和莉莉·萨夫拉脑科学中心（SB奖学金）、以色列科学基金会的遗产遗产生物医学科学合作伙伴计划（资助编号378/11，授予HS）以及德国以色列科学基金会（G.I.F）（资助编号1093-32.2/2010，授予HS）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>仪器设备 | |||
| 啮齿类动物体重秤 | Burtons（英国） | 115-455 | |
| 加热垫 | FIRst技术 | DCT-25 | |
| 修枝机 | Stoelting | 51465 | |
| 立体定位 | 斯托尔廷 | 51730 | |
| 手术刀和刀片 | Kent scientific | INS500348 | |
| 哈兰德注射器 | Hamilton | 7632-01 | |
| 钻孔器 | 斯托尔廷 | 51449 | |
| 数字泵 | 哈佛仪器 | 704507 | |
| 水箱和平台 | 斯托尔廷 | 60135 | |
| <强>试剂 | |||
| 氯胺酮 | Vetoquinol（法国吕尔） | 3055503 | |
| domitor | Orion 制药 | 107140-10 | |
| Rimadyl | 辉瑞动物健康 | 24751 | |
| 润肤软膏 - 合霉素 5% | 瑞卡制药 | 195 | |
| 组织胶（Histoacryl） | 布劳恩 | 112101 | |
| 生理盐水 | Sigma Aldrich | D8662 |
参考文献
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- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
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重印与许可
