一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。
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摘要
摘要
在哺乳动物细胞生物学领域，一种主要的研究方法是在特定细胞系中调控目的基因的表达水平，通过目的基因的瞬时/稳定过表达或表达敲低，以揭示其一种或多种功能。然而，当基因表达的调控导致细胞生长/增殖缺陷或非预期的细胞分化时，该方法在多种细胞生物学研究中并不适用。因此，研究人员借鉴了来自大肠杆菌（E. coli）四环素抗性操纵子1的四环素阻遏蛋白（TetR），构建出高效且严密的基因调控系统，用于在哺乳动物细胞中表达cDNA2,3。简而言之，TetR已被改造为两种形式：（1）在加入四环素后结合启动子区域的四环素操纵序列（TO），从而阻断转录起始（称为Tet-off系统）；或（2）在无四环素存在时结合TO（称为Tet-on系统）（图1）。由于Tet-off系统需要持续存在四环素（其在组织细胞培养基中的半衰期约为24小时），使用上较为不便，因此Tet-on系统得到了更广泛的优化，从而发展出如本研究所采用的极为严密且高效的cDNA表达载体系统。
在哺乳动物细胞中建立RNA干扰（RNAi）以实现基因敲低后不久4，即有研究报道了表达短发夹RNA（shRNA）的载体，其功能与siRNA非常相似5-11。然而，这些由shRNA介导的敲低方法与传统的基因敲除策略具有相同的局限性，因为当目的基因对细胞存活至关重要时，无法实现稳定的基因耗竭。为克服这一局限性，van de Wetering et al.12 对shRNA表达载体pSUPER5进行了改造，在其启动子区域插入了一个四环素操纵子（TO），从而能够构建出可诱导四环素调控的目标基因稳定敲低的细胞系。
本文介绍一种高效生成稳定的人源Tet-on细胞系的方法，该方法可可靠地诱导目的基因的过表达或敲低。利用该方法，我们已成功构建了多个Tet-on细胞系，显著促进了对中心体13,14和凋亡信号通路中MST/hMOB/NDR级联反应的分析15,16。在本报告中，我们除介绍所选用的载体外，还将详细描述高效构建人源Tet-on细胞系所需的两个连续操作步骤（图2）。此外，除了概述人源Tet-on细胞系的构建方案外，我们还将讨论与技术操作及Tet-on细胞鉴定相关的关键要点。
方案
1. pcDNA6_TetR_IRES_blast 的克隆
- 如图3所示，使用限制性内切酶XbaI 和 NcoI 对 pcDNA6/TR 质粒（V1025-20，Invitrogen）进行部分消化，以去除 TetR 基因及杀稻瘟菌素抗性（BlastR）基因的启动子。分离出 4.6 kb 的载体片段。
- 为去除 TetR 基因的多聚腺苷酸化序列，通过 PCR 在 TetR cDNA 的终止密码子后立即引入一个 XhoI 位点，同时保留 cDNA 5'端的 XbaI 位点。将所得片段通过限制性内切酶 XbaI 和 XhoI 亚克隆至 pMigR117 中，构建 pMigR1_TetR 质粒。
- 使用限制性内切酶 XbaI 和 NcoI 消化 pMigR1_TetR 载体，释放 TetR_IRES 片段。分离出 1.25 kb 的插入片段。
- 将 4.6 kb 的 pcDNA6/TR 片段与 1.25 kb 的 TetR_IRES 片段进行连接。将连接产物转化至感受态 E.coli 中，并利用标准分子生物学技术鉴定所需的 pcDNA6_TetR_IRES_blast 构建体。
2. ....
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结果
在图4中展示了稳定表达TetR的RPE-1细胞系的初步表征示例。请注意，所有RPE-1克隆均表达不同水平的TetR（比较泳道2和5），而亲本细胞系（作为阴性对照）不表达外源性TetR蛋白（图4，泳道1）。RPE-1 Tet-on细胞克隆间TetR表达水平的差异是预期之中的，因为表达TetR的质粒的表达水平高度依赖于质粒的整合位点。
对表达靶向MST3激酶shRNA的稳定RPE-1 Tet-on细胞克隆进行表征的结果表明，需要测试多个克隆，以确定目标基因敲低效率最高的细胞系（图5）。在本示例中（图5），选择克隆#1、#2和#3进行进一步分析。敲低效率存在差异是预期现象，因为shRNA的表达水平高度依赖于质粒的整合位点。
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讨论
我们认为，Tet-on 系统极大地促进了基因功能的研究，特别是在难以操作的细胞体系中，或当目标基因对细胞存活至关重要时尤为适用。此外，利用高度特异性的 Tet-on 系统调控基因表达的能力，使得研究人员能够在不同发育阶段（例如细胞周期进程或明确的分化过程）研究基因功能。本文所介绍的方法将使研究人员能够在合理的时间范围内（通常为 3–6 个月，具体时长主要取决于对 TetR 阳性细胞系进行分子和细胞生物学表征所需的程度）建立所需的稳定 Tet-on 细胞系。然而，Tet-on 细胞系的成功构建与应用在很大程度上依赖于多个关键因素。
首先，需要筛选出 TetR 表达水平足够高的细胞，以确保在无四环素存在的情况下对转录产生严格抑制。同样重要的是，对表达 TetR 的目标细胞进行初始表征时，应涵盖所有将在长期研究中涉及的分子和细胞生物学参数。根据我们的经验，一个经过充分表征的 TetR 阳性细胞系是开展多项研究项目的良好起点。
第二，在测试和分析用于 shRNA/cDNA 表达的 Tet-on 克隆时，必须尽可能保持四环素浓度最低，以.......
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致谢
我们感谢实验室所有成员的有益讨论。感谢Joanna Lisztwan和Christina Gewinner对稿件的审阅。本工作由英国生物技术和生物科学研究所（BBSRC）资助项目BB/I021248/1以及惠康信托（Wellcome Trust）资助项目090090/Z/09/Z支持。A.H. 是伦敦大学学院（UCL）癌症研究所的惠康信托研究职业发展研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 16000-044 | 经测试无四环素 |
| 杀稻瘟菌素（Blasticidin） | Invivogen | ant-bl-1 | |
| 博莱霉素（Zeocin） | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 培养基中浓度为 100 mg/ml |
| 抗-TET02 抗体（anti-TET02） | MoBiTec GmbH | TET02 | 用于 WB 时稀释比例为 1/1000 至 1/2000 |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| 四环素（Tetracycline） | Sigma | 87128 | 乙醇中浓度为 2 mg/ml |
| 多西环素（Doxycycline） | Sigma | D9891 | 水中浓度为 2 mg/ml |
| 克隆环（Cloning cylinders） | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | 可重复使用 |
参考文献
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene....
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