一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。
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摘要
摘要
在哺乳动物细胞生物学领域，一种主要的研究方法是在特定细胞系中调控目的基因的表达水平，通过目的基因的瞬时/稳定过表达或表达敲低，以揭示其一种或多种功能。然而，当基因表达的调控导致细胞生长/增殖缺陷或非预期的细胞分化时，该方法在多种细胞生物学研究中并不适用。因此，研究人员借鉴了来自大肠杆菌（E. coli）四环素抗性操纵子1的四环素阻遏蛋白（TetR），构建出高效且严密的基因调控系统，用于在哺乳动物细胞中表达cDNA2,3。简而言之，TetR已被改造为两种形式：（1）在加入四环素后结合启动子区域的四环素操纵序列（TO），从而阻断转录起始（称为Tet-off系统）；或（2）在无四环素存在时结合TO（称为Tet-on系统）（图1）。由于Tet-off系统需要持续存在四环素（其在组织细胞培养基中的半衰期约为24小时），使用上较为不便，因此Tet-on系统得到了更广泛的优化，从而发展出如本研究所采用的极为严密且高效的cDNA表达载体系统。
在哺乳动物细胞中建立RNA干扰（RNAi）以实现基因敲低后不久4，即有研究报道了表达短发夹RNA（shRNA）的载体，其功能与siRNA非常相似5-11。然而，这些由shRNA介导的敲低方法与传统的基因敲除策略具有相同的局限性，因为当目的基因对细胞存活至关重要时，无法实现稳定的基因耗竭。为克服这一局限性，van de Wetering et al.12 对shRNA表达载体pSUPER5进行了改造，在其启动子区域插入了一个四环素操纵子（TO），从而能够构建出可诱导四环素调控的目标基因稳定敲低的细胞系。
本文介绍一种高效生成稳定的人源Tet-on细胞系的方法，该方法可可靠地诱导目的基因的过表达或敲低。利用该方法，我们已成功构建了多个Tet-on细胞系，显著促进了对中心体13,14和凋亡信号通路中MST/hMOB/NDR级联反应的分析15,16。在本报告中，我们除介绍所选用的载体外，还将详细描述高效构建人源Tet-on细胞系所需的两个连续操作步骤（图2）。此外，除了概述人源Tet-on细胞系的构建方案外，我们还将讨论与技术操作及Tet-on细胞鉴定相关的关键要点。
方案
1. pcDNA6_TetR_IRES_blast 的克隆
- 如图3所示，使用限制性内切酶XbaI 和 NcoI 对 pcDNA6/TR 质粒（V1025-20，Invitrogen）进行部分消化，以去除 TetR 基因及杀稻瘟菌素抗性（BlastR）基因的启动子。分离出 4.6 kb 的载体片段。
- 为去除 TetR 基因的多聚腺苷酸化序列，通过 PCR 在 TetR cDNA 的终止密码子后立即引入一个 XhoI 位点，同时保留 cDNA 5'端的 XbaI 位点。将所得片段通过限制性内切酶 XbaI 和 XhoI 亚克隆至 pMigR117 中，构建 pMigR1_TetR 质粒。
- 使用限制性内切酶 XbaI 和 NcoI 消化 pMigR1_TetR 载体，释放 TetR_IRES 片段。分离出 1.25 kb 的插入片段。
- 将 4.6 kb 的 pcDNA6/TR 片段与 1.25 kb 的 TetR_IRES 片段进行连接。将连接产物转化至感受态 E.coli 中，并利用标准分子生物学技术鉴定所需的 pcDNA6_TetR_IRES_blast 构建体。
2. 稳定表达 TetR 细胞系的构建
- 第1天，接种1x10⁶细胞至每孔6 每10厘米组织培养皿使用标准培养基接种细胞（例如 DMEM 培养基中添加 10% FCS。接种两块培养板，一块用于转染 pcDNA6_TetR_IRES_blast，另一块作为杀稻瘟菌素筛选的阴性对照。应使用尽可能低的传代次数，并采用推荐的生长培养基。
- 第2天，使用Fugene 6（E2691，Promega）按照制造商说明书，将2 μg pcDNA6_TetR_IRES_blast转染至其中一个培养板中。另一个培养板不进行转染。
- 第3天，向两块培养板中加入含有5 μg/ml杀稻瘟菌素的标准生长培养基。请注意，不同细胞系的最佳筛选浓度可能有所不同，需预先确定。
- 第4天，使用含5 mg/ml杀稻瘟菌素的完全培养基，将细胞按1/5、1/25、1/50和1/100的比例接种于10 cm培养皿中。务必正确标记含有未转染或转染细胞的培养皿。每个稀释比例准备两个培养皿。
- 每天检查细胞，确保未转染的培养板中所有细胞在第一周内均已死亡。每2-3天更换一次筛选培养基。
- 1至2周后，应开始出现抗杀稻瘟菌素的克隆。选择含有5至50个克隆的培养皿，以确保可挑取单个克隆。
- 当菌落直径达到约5 mm（或更大）时，使用克隆环分离至少12个独立的克隆，挑取单个菌落。将每个克隆转移至24孔组织培养板中的单独孔内。待细胞长至融合后，将每孔中的细胞分种至6孔组织培养板中的一个单独孔内。
- 继续在筛选培养基中培养克隆。当细胞长至融合时，将每个孔中的细胞分种到6孔组织培养板的两个单孔中。
- 针对每个待检测的克隆，将一孔汇合的细胞冻存，另一孔细胞用于后续免疫印迹检测。
- 使用小鼠单克隆 anti-TET02 抗体（MoBiTec GmbH）通过 Western 印迹检测 TetR。请务必以亲本细胞系的裂解液作为阴性对照。
- 选择TetR表达水平最高的3个克隆，分别扩大培养。尽快冻存每个有潜力克隆的菌种。最后，通过比较亲本细胞系与表达TetR的克隆，检测目标分子和细胞生物学参数。从中选出TetR表达最高且目标分子和细胞生物学参数未发生任何改变的“最佳”克隆。
3. 表达shRNA或cDNA的pTER和pT-Rex DEST30载体的初步测试
- 按照文献12所述方法构建含有shRNA插入片段的pTER质粒。利用Gateway技术（Invitrogen）构建含有目的cDNA的pT-Rex DEST30载体（12301-016，Invitrogen）。若进行cDNA表达，可在cDNA上添加标签，以便后续检测外源表达的蛋白质。
- 使用所选转染试剂，将pTER或pT-Rex DEST30质粒（分别表达目标shRNA或cDNA）瞬时转染至亲本靶细胞系中。在测试shRNA表达质粒时，应确保实现较高的转染效率。
- 收集转染后的细胞，并使用适当的抗体进行免疫印迹分析，预期可检测到目的基因的表达降低或过表达。
4. 使用 pTER 或 pT-Rex DEST30 载体构建可诱导型四环素（Tet-on）shRNA 或 cDNA 稳定表达细胞系
- 第1天，使用添加了经认证的无四环素血清（例如 Invitrogen 的 FBS；货号 16000-014）的标准培养基，将“最佳”的 TetR 表达克隆细胞以每10 cm培养皿 1×106 个细胞的密度接种。接种一个培养皿用于 pTER（或 pT-Rex DEST30）转染，另一个培养皿作为双重筛选的阴性对照。务必使用尽可能低的传代次数。
- 第2天，使用 Fugene 6 将 2 μg 的 pTER（或 pT-Rex DEST30）质粒转染至其中一个培养皿，另一个培养皿不进行转染。
- 第3天，在标准培养基中加入 5 μg/ml 杀稻瘟菌素（blasticidin）和 500 μg/ml 博来霉素（zeocin）（或 1 mg/ml G418），并更换培养基。
- 第4天，将细胞以 1/5、1/25、1/50 和 1/100 的比例传代至新的 10 cm 培养皿中，使用含 5 μg/ml blasticidin 和 500 μg/ml zeocin（或 1 mg/ml G418）的标准培养基。每个稀释梯度准备两个培养皿。
- 每天观察细胞状态，确保在第一周内未转染的培养皿中所有细胞均已死亡。每 3–4 天更换一次含 blasticidin 和 zeocin（或 G418）的标准培养基。
- 2–3 周后，应出现对 blasticidin/zeocin（或 blasticidin/G418）双重抗性的细胞克隆。选择每个培养皿中克隆数在 5 至 50 个之间的培养皿，用于挑取单克隆。
- 当克隆直径达到约 5 mm（或更大）时，使用克隆环挑取单个克隆。至少分离 24 个独立的单克隆，并将每个克隆转移至 24 孔细胞培养板的一个独立孔中。
- 在含维持浓度的 blasticidin（5 μg/ml）和 zeocin（250 μg/ml）[或 G418（0.5 mg/ml）] 的培养基中培养克隆。当细胞达到汇合状态时，将每孔细胞传代至 6 孔细胞培养板中的一个孔。
- 对于每个待检测的克隆，将 6 孔板中一个汇合的孔细胞分至三个新的孔中。当细胞再次汇合后，冻存其中一个孔的细胞，其余两个孔用于检测四环素诱导表达。向其中一个孔加入浓度为 1 μg/ml 的四环素，另一个孔则不加四环素。
- 四环素处理 24 至 96 小时后，收集细胞并使用适当的抗体进行免疫印迹分析。在筛选 cDNA 表达诱导时，建议采用较短的四环素处理时间；而在检测 shRNA 介导的内源蛋白耗竭时，则需更长的处理时间。
- 选择至少两个具有理想蛋白耗竭或过表达效果的克隆进行扩增培养。尽快冻存每个有潜力克隆的细胞储备。在后续实验中培养 Tet-on 克隆时，务必始终使用添加了无四环素血清以及相应筛选抗生素（维持浓度）的培养基。
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结果
在图4中展示了稳定表达TetR的RPE-1细胞系的初步表征示例。请注意，所有RPE-1克隆均表达不同水平的TetR（比较泳道2和5），而亲本细胞系（作为阴性对照）不表达外源性TetR蛋白（图4，泳道1）。RPE-1 Tet-on细胞克隆间TetR表达水平的差异是预期之中的，因为表达TetR的质粒的表达水平高度依赖于质粒的整合位点。
对表达靶向MST3激酶shRNA的稳定RPE-1 Tet-on细胞克隆进行表征的结果表明，需要测试多个克隆，以确定目标基因敲低效率最高的细胞系（图5）。在本示例中（图5），选择克隆#1、#2和#3进行进一步分析。敲低效率存在差异是预期现象，因为shRNA的表达水平高度依赖于质粒的整合位点。
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讨论
我们认为，Tet-on 系统极大地促进了基因功能的研究，特别是在难以操作的细胞体系中，或当目标基因对细胞存活至关重要时尤为适用。此外，利用高度特异性的 Tet-on 系统调控基因表达的能力，使得研究人员能够在不同发育阶段（例如细胞周期进程或明确的分化过程）研究基因功能。本文所介绍的方法将使研究人员能够在合理的时间范围内（通常为 3–6 个月，具体时长主要取决于对 TetR 阳性细胞系进行分子和细胞生物学表征所需的程度）建立所需的稳定 Tet-on 细胞系。然而，Tet-on 细胞系的成功构建与应用在很大程度上依赖于多个关键因素。
首先，需要筛选出 TetR 表达水平足够高的细胞，以确保在无四环素存在的情况下对转录产生严格抑制。同样重要的是，对表达 TetR 的目标细胞进行初始表征时，应涵盖所有将在长期研究中涉及的分子和细胞生物学参数。根据我们的经验，一个经过充分表征的 TetR 阳性细胞系是开展多项研究项目的良好起点。
第二，在测试和分析用于 shRNA/cDNA 表达的 Tet-on 克隆时，必须尽可能保持四环素浓度最低，以...
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致谢
我们感谢实验室所有成员的有益讨论。感谢Joanna Lisztwan和Christina Gewinner对稿件的审阅。本工作由英国生物技术和生物科学研究所（BBSRC）资助项目BB/I021248/1以及惠康信托（Wellcome Trust）资助项目090090/Z/09/Z支持。A.H. 是伦敦大学学院（UCL）癌症研究所的惠康信托研究职业发展研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 16000-044 | 经测试无四环素 |
| 杀稻瘟菌素（Blasticidin） | Invivogen | ant-bl-1 | |
| 博莱霉素（Zeocin） | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 培养基中浓度为 100 mg/ml |
| 抗-TET02 抗体（anti-TET02） | MoBiTec GmbH | TET02 | 用于 WB 时稀释比例为 1/1000 至 1/2000 |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| 四环素（Tetracycline） | Sigma | 87128 | 乙醇中浓度为 2 mg/ml |
| 多西环素（Doxycycline） | Sigma | D9891 | 水中浓度为 2 mg/ml |
| 克隆环（Cloning cylinders） | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | 可重复使用 |
参考文献
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