我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile red）的光谱特性，实现对脂滴的荧光成像。随后，我们介绍了采用固相萃取结合气相色谱-质谱联用法对甘油三酯和磷脂进行的生化测定。
本文内容
摘要
摘要
线虫 C. elegans 已成为研究调控脂肪代谢的保守遗传通路的重要模型，该通路与人类肥胖及其相关病理密切相关。此前开发的多种用于可视化 C. elegans 富含甘油三酯的脂肪储存的方法已被证明存在错误，会突出显示脂滴以外的细胞区室。其他方法则需要专用设备、耗时较长或结果不一致。我们介绍一种基于固定剂的快速、可重复的尼罗红染色法，可准确且快速地检测 C. elegans 中的中性脂滴。在40%异丙醇中进行短暂固定，可使线虫完全通透尼罗红，随后用该染料对线虫进行染色。这种亲脂性染料的光谱特性使其仅在富含脂质的环境中强烈且特异性地在黄绿色光谱范围内发出荧光，而在极性更强的环境中则不发光。因此，仅需在异丙醇中进行短暂的尼罗红染色，即可在配备简单GFP成像功能的荧光显微镜下观察脂滴。本方案具有快速、经济、可重复的优点，非常适用于高通量筛选。我们还展示了一种配对方法，即利用气相色谱-质谱联用技术进行甘油三酯和磷脂的生化测定。这一更为严格的方法应用于验证尼罗红显微镜脂质检测所得的结果。我们预计这些技术将成为 C. elegans 代谢研究领域的新标准。
引言
人类与线虫Caenorhabditis elegans之间代谢通路的高度保守性，使其成为研究肥胖的有力模式生物。尽管C. elegans不像哺乳动物那样具有专门用于脂肪储存的脂肪细胞，但它们仍以脂滴形式储存甘油三酯，并拥有许多与脂肪储存和能量利用相同的调控因子12,3。为检测C. elegans中的脂肪含量，已有多种方法被提出，其操作简便性和成功率各不相同。过去常用的荧光活体染料4-7最近受到质疑，这些试剂实际上标记的是与C. elegans主要脂肪储存库不同的细胞区室1,8-11。基于固定剂的非荧光染料（如苏丹黑和油红O）虽能有效显示线虫中的脂滴12-14，但在定量分析方面的动态范围不如荧光染料宽广8,13,15。此外，目前针对荧光和非荧光染料所采用的固定方法均耗时较长，且涉及多次冻融步骤和/或使用有毒化学物质1,9,10。已有研究报道，将特定的BODIPY标记脂类类似物饲喂活体线虫，可在短期标记中突出脂滴15。然而该方法依赖于染料的摄取，因此易受C. elegans对BODIPY脂肪酸类似物的处理和代谢过程的影响。另一种成熟的替代方法是无需标记的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）或受激拉曼散射（SRS）显微技术，该技术利用脂分子特有的振动特性来可视化脂肪储存10,16,17。然而，该方法需要昂贵的专业设备，且通量极低。
为满足对秀丽隐杆线虫中性脂质储存进行快速、可扩展分析的需求 C. elegans 代谢研究中，我们介绍了一种基于固定剂的尼罗红脂质染色新方法，具有高度可重复性。脂溶性染料尼罗红的光谱与理化特性使其激发-发射峰发生黄-金光谱偏移，从而仅在富含脂质的环境中于绿色发射光谱范围内产生荧光，而在极性较强的环境中则不产生荧光18,19 因此，仅需使用绿色荧光蛋白（GFP）滤光片组进行荧光显微镜观察，即可在简单染色后检测脂滴。该技术操作简便、成本低廉，非常适用于高通量筛选。我们还展示了一种配对的、更为严谨的生化方法，通过固相萃取结合气相色谱-质谱联用技术对甘油三酯和磷脂进行生化测定。生化脂质定量结果与基于尼罗红染色的显微检测结果具有良好的相关性。 C. elegans 脂肪质量，应作为显微镜下脂质测定结果的验证手段。
方案
1. 矩形Amp/Tet（A/T）LB琼脂平板和NGM IPTG RNAi平板的制备
A/T 平板应在使用前 1 至 4 周制备，并在 4 °C 避光保存。
- 配制 1 L 培养基时，加入 1 L 去离子水、32 g LB 琼脂、1.5 ml 2 M NaOH 和 2 g Bacto 琼脂。液体循环条件下高压灭菌 40 分钟。冷却至 60 °C 后，加入 3 ml 四环素和 0.5 ml 氨苄青霉素。每块平板倒入 45 ml 培养基。
提前3天至2周制备96孔RNAi平板。
- 制备1 L线虫生长培养基（NGM）以倾注25块96孔RNAi平板：1 L去离子水、3 g NaCl、17 g琼脂糖和2.5 g细菌蛋白胨。加入搅拌子，于121 °C高压灭菌40分钟。灭菌后置于60 °C加热板上搅拌冷却。
- 当温度冷却至60 °C时，加入以下储备液：1 ml 1 M MgSO4、1 ml 5 mg/ml胆固醇、25 ml 1 M KH2PO4（pH 6.0）、1 ml 1 M CaCl2、1 ml 200 mg/ml羧苄青霉素和5 ml 1 M IPTG（配方见材料表）。
- 使用电子多通道移液器将150 μl RNAi培养基加入平底96孔板的每个孔中。避免产生气泡。分装过程中将培养基置于60 °C水浴中的无菌不锈钢容器内保温。
- RNAi平板需保持水平直至琼脂糖完全凝固。平板可提前最多2周制备，并于4 °C保存。
第1天
2. 将冻存文库平板点种到长方形氨苄青霉素/四环素（A/T）LB 琼脂平板上
- 将A/T平板置于室温下预热，并避光保存。
- 将96孔RNAi文库板从-80 °C转移至干冰中。在本生灯附近打开铝膜封口的板子。
- 通过依次将96针复制器的针头浸入10%次氯酸钠溶液（每步10秒）、去离子H2O和70%乙醇中，并随后过火，对针头进行灭菌。重复乙醇浸泡和过火步骤一次。
- 将复制器插入冷冻的96孔RNAi甘油菌种库中，确保每个针头均接触到各孔表面。
- 将菌种影印至A/T平板上，每个针头轻轻划出小圆圈，注意不要损伤琼脂表面。
- 重新密封文库板并放回-80 °C保存。将影印后的A/T平板于37 °C过夜培养，以促进细菌生长。
第2天
3. 在深孔板中过夜培养RNAi细菌克隆
- 从37 °C取出A/T平板，确认细菌生长情况。
- 向96孔深孔板的每孔中加入1.5 ml含200 μg/ml羧苄青霉素的LB培养基。
- 对96针复制器进行灭菌（参见步骤2.3）。
- 将复制器压在A/T平板表面，确保每根针接触到各个细菌RNAi克隆。提起复制器后，将针浸入深孔板中，轻轻旋转混匀，并缓慢取出，注意避免污染相邻孔。
- 用透气膜密封深孔板，在37 °C下振荡培养过夜（推荐使用MT Infors Microtiteron II摇床，转速950 rpm；或使用振幅25 mm的摇床培养箱，转速250 rpm）。
第3天
4. 将RNAi细菌克隆接种到96孔NGM RNAi平板上
- 从 4 °C 取出 96 孔 RNAi 板，恢复至室温。
- 取出深孔块，以 4,000 × g 离心 10 分钟。
- 迅速将深孔块倒置在水槽中排尽培养基，并倒扣在纸巾上以去除多余液体。
- 在超净工作台内，向每孔加入含 200 μg/ml 羧苄青霉素的 LB 培养基 40 μl，并用无菌封膜密封。
- 将深孔块放回室温细菌摇床振荡 10 分钟以重悬菌体沉淀，或通过小心移液手动重悬菌体沉淀。
- 在超净工作台内，去除封膜，将深孔块中的菌液转移至 96 孔 RNAi 板。向 'A' 行和 'H' 行每孔加入 40 μl 重悬菌液，其余各行每孔加入 35 μl。向 96 孔 RNAi 板边缘孔加入较多液体，以防止琼脂糖过度干燥和开裂。
- 将平板敞口置于超净台内干燥 4–6 小时，并定期检查干燥程度。干燥后的细菌呈透明状而非浑浊状。干燥完成后封膜，倒置平板，并于室温过夜培养。
5. 准备同步化的线虫群体
每制备6块96孔RNAi板所需的虫卵，需使用两块10 cm培养皿，皿内应含有大量处于产卵期的线虫。确保线虫至少经过两代（7天）未处于饥饿状态。
- 按照先前所述方法制备同步化的L1期群体20。配制20 ml漂白液时，使用4 ml漂白剂、1 ml NaOH（10 M）、5 ml去离子H2O和10 ml M9缓冲液。
- 将线虫在15 ml无菌聚丙烯管中加入10 ml M9缓冲液，于20 °C旋转培养过夜以实现同步化。
第4天
6. 将线虫加入RNAi平板
- 将卵制备物在 3,000 × g 条件下离心 1 分钟。吸除上清液，注意避免触及 L1 幼虫沉淀。将沉淀重悬于 5 ml 含 0.0005% Triton X-100 的 M9 缓冲液中。加入少量去垢剂可防止线虫黏附移液管，且对脂肪染色无影响。
- 在显微镜下计数线虫。必要时，调整浓度至每微升含 10–15 条线虫。
- 在超净工作台内，针对每块待接种的 96 孔板，将 75 μl 重悬的线虫加入浅孔检测板的一整行各孔中。使用手动多通道移液器，将 50–75 条线虫（体积为 5 μl）加入 RNAi 96 孔板的每一孔中。
- 在超净台内使平板干燥 30 至 60 分钟。干燥后，在显微镜下观察，线虫应呈爬行状态，而非剧烈扭动。
- 将线虫在 20 °C 条件下培养于 RNAi 平板中约 64 小时。
第7天
7. 用尼罗红固定并染色线虫
- 从培养箱中取出RNAi平板。在显微镜下检查，记录饥饿或剧烈运动（湿润）的孔，这些孔应排除在后续分析之外，因为这些条件会影响脂肪含量。
- 使用电子多通道移液器，向RNAi平板的每孔中加入150 μl含0.01% Triton X-100的PBS。用手动多通道移液器混合并将含有线虫的液体转移至96深孔PCR板的对应行中。避免破坏琼脂。每孔重复操作，最终使每孔含有300 μl PBS中的线虫。
- 当完成四块平板的转移后，以500 rpm离心1分钟。
- 使用96针真空吸头吸取上清液，每孔底部保留约25 μl液体和线虫沉淀。
- 向每孔加入150 μl 40%异丙醇以固定线虫。确保移液器速度足够高，使线虫沉淀与40%异丙醇充分混合。室温孵育3分钟。
- 将平板敞口以500 rpm离心1分钟。
- 使用96针吸头或手动吸取上清液，每孔底部仅保留25 μl 40%异丙醇加线虫沉淀。
- 向每孔加入150 μl Nile red染色液，该溶液需现配现用：每1 ml 40%异丙醇中加入6 μl浓度为0.5 mg/ml的Nile red丙酮母液。
- 用非无菌粘性封板膜密封平板，并在避光条件下染色至少2小时。
8. 在高通量显微镜上洗涤并成像线虫
- 以 500 rpm 离心 1 分钟，吸除除 25 μl 尼罗红染料外的全部液体。
- 向每个孔中加入 150 μl 含 0.01% Triton X-100 的 PBS，并在避光条件下孵育至少 30 分钟。
- 以 500 rpm 离心 1 分钟。
- 使用 12 通道移液器，以两次快速吹打（每次 7 μl）吸取每孔底部的线虫，并转移至 96 孔特氟龙印刷玻片上。小心地从玻片的每孔中移除 9.5 μl PBS，避免移走线虫。若您的玻片无法直接适配显微镜载物台，则必须使用定制的铝制玻片夹持器来固定线虫样本。
- 缓慢将盖玻片盖在 96 孔玻片上。此步骤可能需要练习以避免产生气泡或线虫在孔间交叉污染。使用粘性胶固定盖玻片四角。
- 在自动显微镜上使用明场和 GFP/FITC 滤光片组对玻片进行荧光成像。脂质信号易发生光漂白，因此应在所有孔中系统性地进行成像，而非手动操作，以免因光漂白导致孔间出现人为差异。有关分析的更多细节，请参见“代表性结果”与“讨论”部分。
9. 使用固相萃取（SPE）和气相色谱-质谱联用（GC/MS）进行生物化学脂质测定
为了基于尼罗红荧光验证脂质水平，可对来自线虫沉淀物中三酰甘油（TAG）和磷脂（PL）衍生的脂肪酸甲酯（FAME）进行气相色谱-质谱联用分析（GC/MS）。涉及有机溶剂的操作步骤应在通风橱中进行。由于脂质极易发生氧化，在长期储存或孵育过程中应将脂质置于氮气保护下并避光。实验输入材料为2,500–5,000条同步发育的线虫所获得的虫体沉淀，制备方法与前述完全相同，唯一区别在于线虫需在10 cm的RNAi平板上培养。
- 用10 ml M9缓冲液将每个10 cm培养皿中的2,500–5,000条线虫洗入一个15 ml锥形聚丙烯管中。在500 × g下离心1分钟以沉淀线虫，再用10 ml M9缓冲液洗涤沉淀一次。在500 × g下再次离心沉淀线虫。吸除上清液，保留总体积250 μl，可立即在液氮中速冻后于-80 °C氮气环境中保存以备后续处理，或直接进行下一步操作。
- 若需将甘油三酯质量归一化为磷脂质量，则可直接将线虫沉淀转入步骤9.38,13,21。然而，若研究者希望以蛋白质含量或DNA含量进行归一化，则应将线虫沉淀在4 °C条件下，使用最高强度的水浴超声仪进行超声处理，每次超声30秒，间隔30秒，总时长10分钟。若需进行蛋白质或DNA归一化，可取出5 μl等分试样，使用Bradford试剂或类似方法测定总蛋白浓度，或在柱纯化后使用紫外分光光度计测定总DNA含量。
- 将线虫加入装有1.5 ml 2:1氯仿:甲醇的螺口硼硅酸盐玻璃管中。所有有机溶剂的转移均应使用玻璃移液管进行。
- 使用Wiretrol 50 μl移液器，加入50 μl含25 nM磷脂标准品的溶液和50 μl含16.7 nM甘油三酯标准品的溶液。两种标准品均应溶解于2:1氯仿:甲醇中，密封后在避光条件下置于-80 °C冰箱中充氮保护保存，以防止氧化。
- 用酚醛盖密封后涡旋混匀。在室温下提取1小时，每15分钟涡旋一次。
- 在1,000 rpm下离心5分钟。将不含残渣的下层有机相转移至一个硼硅酸盐培养管中。
- 加入0.3 ml 0.9% NaCl溶液，涡旋混匀后在1,000 rpm下离心5分钟。
- 将下层有机相转移至一个新的硼硅酸盐培养管中，注意避免转移任何水相成分。
- 在氮气流下干燥有机相。为开始固相萃取（SPE），将干燥的脂质重新悬浮于1 ml氯仿中。或者，若需对不同脂类（包括磷脂亚类、糖脂、鞘脂、二酰甘油、三酰甘油、游离脂肪酸和胆固醇酯）进行详细分离与分析，可采用Watts实验室在C. elegans中首创的薄层色谱法替代SPE22。脂质也可通过高效液相色谱（HPLC）分离，并用GCMS分析各组分。此外，也可采用液相色谱/质谱法（LCMS）进行复杂的全脂质组分析23–26。
- 在SPE装置上安装硅胶SPE柱。用3 ml氯仿预平衡柱子，让溶剂依靠重力自然流下。
- 将脂质样品加载至SPE柱上，收集流出液至一个螺口硼硅酸盐管中，作为第一组分（TAG组分）。大多数中性脂质将在最初的1 ml流出液中被洗脱。加入3 ml氯仿以充分洗脱TAG组分，将流出液收集至TAG组分管中。
- 取下并密封第一个收集管，更换为一个新的洁净收集管。用5 ml 9:1丙酮:甲醇洗脱糖鞘脂。我们通常不常规分析该组分的脂肪酸组成，但该组分可能含有重要信息，可保存用于制备甲酯和游离鞘氨醇碱基，以便通过与TAG和PL分析不同的专门方法进一步分析27。
- 将糖鞘脂收集管更换为第二个螺口硼硅酸盐收集管。用3 ml甲醇洗脱磷脂（PL组分）。
- 此时各组分可在充氮密封条件下于-80 °C保存。在氮气流下干燥纯化的脂质。为加快干燥速度，可将其置于33 °C的干燥加热块中。切勿将脂质以干燥状态长期储存，因为干燥状态下的脂质特别容易发生氧化。
- 通过涡旋将干燥的脂质组分重新悬浮于2 ml含2% H2SO4的甲醇溶液中，密封后在55 °C水浴中孵育过夜，以生成脂肪酸甲酯（FAMEs）。必须确保FAME反应体系中完全无水，否则会严重抑制脂质的衍生化。我们发现过夜孵育可实现更高效的衍生化，且文献表明在较低温度下进行FAME制备时脂质氧化程度更低28。另一种更快捷的方法是使用2 ml含2.5% H2SO4的甲醇溶液，在70或80 °C下衍生化1小时21,22,29。
- 次日早晨从水浴中取出反应管，使其冷却。向每个TAG和PL组分中加入1.5 ml H2O（以终止反应），然后加入0.3 ml正己烷（以萃取FAMEs）。剧烈振荡后在1,000 rpm下离心5分钟。
- 使用标准移液器或巴斯德移液器小心仅吸取上层正己烷层。将其分装至自动进样瓶中。务必避免混入酸化甲醇，因其会破坏GC柱和质谱检测器（MSD）。
- 盖紧瓶盖并将样品装入GC/MS系统。样品以正己烷转移至Agilent微插管小瓶中，使用PTFE-硅胶-PTFE螺帽密封。样品注入配备Supelcowax-10（24079）30米、250微米熔融石英毛细管柱的Agilent GCMS 6890/5973N型号仪器。进样量为1 μl，采用不分流进样口，设定温度为250 °C，压力为13.33 P.S.I。载气为高纯氦气。运行程序如下，流速保持恒定为每分钟1 ml：
| 步骤 | 操作说明 | 目标温度 |
| 1 | 保持 2 分钟 | 150 °C |
| 2 | 以每分钟 10 °C 升温 | 200 °C |
| 3 | 保持 4 分钟 | 200 °C |
| 4 | 以每分钟 5 °C 升温 | 240 °C |
| 5 | 保持 3 分钟 | 240 °C |
| 6 | 以每分钟 10 °C 升温 | 270 °C |
| 7 | 保持 5 分钟 | 270 °C |
在质谱检测器（MSD）中采用3分钟的溶剂延迟，以最大限度减少对灯丝的损耗。随后，在离子源温度为230 °C、辅助加热温度为270 °C、四极杆温度为150 °C的条件下，检测50至550道尔顿之间的质荷比。
结果
经过脂肪染色工作流程成像的培养板示例显示于 图1. 高脂饮食的特异性对照daf-2 胰岛素受体RNAi），低脂（lpd-3 肠道中脂质储存颗粒所需的蛋白质RNAi），体型小且脂肪含量低（fasn-1 脂肪酸合成酶RNAi）和空载体（对照）显示了根据动物脂肪水平变化的荧光强度差异，以及通过GC/MS分析测定的相应脂质含量（图2）。需要注意的是，导致发育停滞、体型变小的基因失活，通常会使得动物体脂含量明显低于成年对照动物，而无论其是否与脂肪代谢存在关联。图3）。应对相同发育阶段的野生型对照动物进行次级分析，包括染色分析以及采用固相萃取-气相色谱-质谱法（SPE-GCMS）进行脂质生物化学分析，以确保微小表型或发育停滞的阳性结果具有可靠性。对于 fasn-1 RNAi（图2），动物停滞在L2或L3幼虫阶段，其脂肪染色强度低于成虫对照RNAi组，但与L2-L3阶段对照RNAi动物的脂肪染色水平相似（脂肪染色占成虫对照RNAi的百分比：49.9 ± 4.5%） fasn-1 RNAi组为20.2 ± 2.1%，L3对照RNAi组为64.7 ± 1.3）。生化分析结果表明，与L2期N2对照动物相比，其TAG/PL比值较低（TAG/PL：22.5 ± 2.9） fasn-1 RNAi 以及 46.1 ± 3.4（对应发育阶段的对照 RNAi）， P ≤ 0.05）。因此，通过生化分析可证实，在此情况下，fasn-1 在脂质储存中发挥作用，而不仅仅是脂肪量的阶段特异性减少。
对成像线虫的后续分析在很大程度上依赖于使用 WormToolbox30 的计算平台（如 Cell Profiler）。对于数量较少的图像，可使用美国国立卫生研究院（NIH）提供的公共图像分析平台 ImageJ。在我们的分析中，首先使用定制的 Matlab 脚本识别孔位，随后排除空孔或含气泡的孔，并区分微小碎片与线虫。对于因上述原因被标记为需排除的图像，需进行人工质量控制。我们通过实验发现，将整个孔中线虫像素强度的第90百分位数归一化为该孔中线虫的总面积，可提供一个在所有线虫发育阶段均一致的染色强度度量指标（图3）。相反，若将总脂肪量在整个线虫面积上积分，则倾向于将体积小但明亮的线虫与体积大但暗淡的线虫评分等同。由于本方法并未对线虫区域内的总荧光信号进行积分，而是采用强度百分位数，因此线虫尺寸本身的变化不会对测得的强度造成偏差。取而代之的是，测量的是像素强度分布的差异。然而，尽管如此，不同发育阶段动物之间的染色像素强度分布仍存在显著差异，因此在研究RNA干扰对任一基因的影响时，必须使用发育阶段相近的动物进行比较（图3）。重复样本间的平均变异性如图4所示，表明该脂肪染色方法具有高度可重复性。需要注意的是，该方法的效果高度依赖于在均匀照明条件下、使用相同的曝光时间，并尽量减少气泡、碎片或线虫交叉污染至其他孔的情况下，为每块板获得高质量图像。
采用预混合的纯化标准品进行固相萃取（SPE），以确定甘油三酯（TAG）与磷脂（PL）的分离程度（图5A）。在此分析中，TAG与PL实现了100%的分离，表现为TAG样品中完全不存在来源于PL的17:0脂肪酸，而PL样品中也完全不存在来源于TAG的13:0脂肪酸（图5A）。因此，SPE在分离脂质类别方面具有很高的效率。该分析并未表明不同碳链长度的所有TAG均能通过SPE以相同效率被纯化，并通过气相色谱-质谱联用（GCMS）以相似效率检测。它仅能保证总体上的TAG与PL脂质彼此之间实现了完全分离。
野生型N2动物样品经固相萃取和脂肪酸甲酯（FAME）制备后的气相色谱-质谱（GC-MS）图谱如图所示 图5B对于TAG和PL，可根据保留时间以及质谱中的母离子和子离子来鉴定各峰，并将鉴定出的峰面积总和相对于相应内标峰面积进行归一化。为确定归一化的TAG含量，将TAG色谱图中除13:0内标峰外的所有峰面积相加，再除以13:0峰的面积。同样，为确定归一化的总PL含量，将所有峰面积（除17:0内标峰外）相加后除以17:0峰的面积。随后，利用TAG和PL样品的归一化值计算样品的最终TAG/PL比值：
需要注意的是，SPE-GCMS 数据能够对各脂质组分中所含脂肪酸进行远比简单计算总 TAG 与 PL 比值更为深入的分析。例如，研究者可对对应于单一脂肪酸的单个峰进行积分，并在不同样本间比较其归一化后的丰度（例如，在 N2 野生型与 daf-2 RNAi 样本之间，比较 18:0 峰的积分面积除以 13:0 内标峰面积，并归一化为总 PL 质量除以 PL 17:0 内标峰面积）：
若研究者需要，也可计算任一特定脂肪酸在TAG或PL组分中占所测定总脂肪酸含量的百分比（例如，N2线虫TAG组分中的18:0）：
图1. 整体实验的典型工作流程。 第1天，将冻存的RNAi文库平板点接到含氨苄青霉素/四环素的LB琼脂平板上，并在37 °C下培养。第2天，用含氨苄青霉素/四环素的平板接种深孔块中的RNAi克隆液体培养物。第3天，通过离心浓缩细菌，并将其转移至96孔RNAi平板中。第4天，将L1期孵化的C. elegans加入液体中的RNAi平板，待其干燥。第7天，将线虫收集到液体中，用40%异丙醇中的尼罗红染色，置于96孔聚四氟乙烯载玻片上，并使用高通量显微镜成像。
图 2. 基于固定剂的尼罗红染色显示 C. elegans 主要脂肪储存情况。 展示了以 fasn-1（体积小，脂肪含量低）、lpd-3（脂肪含量低）、对照组（空载体）或 daf-2（脂肪含量高）RNAi 克隆喂养的 N2 线虫的代表性明场和 GFP 荧光图像。样品按照本方案处理（示意图见 图 1）。经固定、尼罗红染色并成像后，所得脂质水平与生化脂质测定结果相当。第一行显示来自至少 6 次生物学重复的异丙醇固定后尼罗红荧光水平。第二行显示来自 4 次生物学重复的定量甘油三酯水平，该值在归一化至总磷脂水平（TAG/PL）后可反映整体中性脂质储存情况。需要注意的是，固定剂处理后尼罗红染色与生化脂质测定所获得的绝对定量结果通常并不完全一致。在此例中，尽管定性趋势相似，但通过生化方法检测，fasn-1(RNAi) 组相对于对照组的甘油三酯质量差异比显微镜观察所显示的更大，lpd-3 组差异程度相近，而 daf-2(RNAi) 组差异较小；尽管如此，所有差异均具有高度统计学显著性，且测量结果高度可重复。图中数据表示为均值 ± 标准误（*，P ≤ 0.01；**，P ≤ 0.0001，相对于对照组，采用假设方差相等的非配对双尾 t 检验确定）。
图3. 通过尼罗红固定染色法测定不同幼虫阶段的脂肪含量。 动物在 OP50 细菌上培养，并在 L1、L2、L3、L4 及怀卵成虫发育阶段收集。固定染色后采集图像，并使用定制的 Matlab 脚本进行分析，以确定 90th 像素强度在已识别的线虫区域内的百分位数。需要注意的是，随着线虫从L2期发育至L4期，其脂质水平显著升高；而在成虫期，由于机体开始将能量分配至生殖系增殖，脂质水平则略有下降。所示数据为6–8次重复实验的均值±标准误（**， P 与怀卵成虫相比，P ≤ 0.0001，由非配对双尾T检验确定。
图4. 不同生物学重复之间具有高度可重复性。 图中显示了尼罗红荧光强度在不同生物学重复样本中的散点图（n = 6-8）。每个重复样本的所有数值均归一化至空载体对照组的平均强度。数据表示为均值 ± 标准误（**，P ≤ 0.0001，相对于对照组，采用双尾非配对T检验，假设方差相等）。
图 5. SPE 分离标准品及野生型 TAG 和 PL 丰度的 GC-MS 色谱图。(A) 显示了通过 SPE 分离 TAG 和 PL 标准品的 GC-MS 谱图。注意 PL 谱图中完全不存在 13:0 脂肪酸，而 TAG 谱图中相应地完全不存在 17:0 脂肪酸，表明 TAG（三十三烷酸甘油酯）与 PL（1,2-二十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)）实现了完全分离。(B) 来自喂食载体对照 RNAi（含 L4440 空载体 RNAi 的 HT115 细菌）的 N2 野生型动物样品中 TAG 和 PL 的代表性全谱图。按照实验方案，将 1 µL 样品注入 Agilent 6890/5973N 气质联用仪（GCMS），并通过保留时间和各自质谱图鉴定各个峰。缩写：cyclo，环丙烷脂肪酸；iso，异甲基支链脂肪酸；GLA，γ-亚麻酸；ALA，α-亚麻酸；DGLA，二高-γ-亚麻酸；EPA，二十碳五烯酸。 点击此处查看大图。
讨论
本方案可用于对 C. elegans 的脂质水平进行快速、大规模的筛选，并可轻松适应高通量筛选。与以往使用的方法不同，传统方法需经长时间的多聚甲醛固定，再进行多次冻融循环8,10，而本方案仅需在异丙醇中进行3分钟的简单固定。我们发现，在40%异丙醇中对 C. elegans 进行尼罗红染色时，线虫组织可完全通透染料，无需额外的冻融或固定步骤。此外，由于尼罗红在疏水性环境中的绿色光谱范围内具有选择性荧光18,19,31，因此无需进行脱色处理。总体而言，从RNAi平板取样到完成染色并准备成像的整个过程仅需略多于2.5小时。该方法成本较低，且具有高度的可重复性。该方法不依赖于 C. elegans 对染料的摄取或富集能力，因此不受基于活体染料喂养方法的相同限制。鉴于其可重复性和测量精确性，该方法适用于通过RNAi筛选大量基因失活效应。若需基于固定剂处理后的尼罗红染色对脂质水平进行定量分析，我们建议设置4–6个生物学重复，并配备适当的对照组及统计学检验。
许多基因失活会导致动物体型变小（由于RNAi克隆引起发育延迟或停滞），因此在筛选脂肪调控因子时，这些基因很可能会被检出，而不论其是否真正参与脂肪代谢。尽管我们所使用的图像分析程序通过将荧光强度归一化到线虫面积，已对不同大小的线虫进行了校正，但研究人员仍可考虑将体型较小的线虫与处于相似发育阶段的野生型线虫进行脂肪染色水平的比较。对于明显脂肪含量较低的小型或发育停滞的线虫，我们建议单一检测方法不足以证明其脂质代谢发生改变，可能需要包括固相萃取-气相色谱-质谱联用（SPE-GCMS）在内的多项后续实验，以确认这些基因的脂质调控功能。以已知的代谢调控基因fasn-1为例，必须将其SPE-GCMS分析结果与发育阶段匹配的N2 L2期对照线虫进行比较，才能确认在与成虫对照比较时所观察到的低脂肪表型。虽然尼罗红脂肪染色显示fasn-1的脂肪水平相对于对照成虫RNAi有所降低，但当与相同发育阶段（L2期）的对照RNAi线虫比较时，并未观察到明显差异。因此，需要采用第二种方法，即三酰甘油/磷脂（TAG/PL）比值的生化定量分析，来确认fasn-1确实是脂肪含量的真正调控因子，因为fasn-1 RNAi线虫在生化特征上可与同阶段L2对照RNAi线虫区分开来。
尽管我们展示了适用于高通量平台的成像与图像处理方法，但也可使用传统的直立显微镜轻松采集置于琼脂糖垫上20或常规尺寸聚四氟乙烯印制的8至12孔载玻片上的线虫图像。唯一的限制是，经尼罗红染色的脂滴绿色荧光容易迅速发生光漂白，因此必须采用系统化、一致的曝光条件，以确保图像间的可比性。我们发现，具备统一图像采集条件的全自动显微镜在此方面效果最佳。
本方案的一大优势在于，采集图像后可保存以供未来重新分析。同一组图像除可用于测定脂肪含量外，还可用于确定虫体大小。此外，随着计算程序的不断进步，有望实现对单条线虫的分析，从而从单个孔中获得具有统计学意义的结果。因此，我们所采用的高通量显微技术相比已发表的、利用 Copas Biosort 定量荧光信号的筛选方法32,33 具有一定优势。然而，这些方法之间显然是互补的。
通过固相萃取与气相色谱-质谱联用技术对脂质含量进行精确的生化测定，可验证尼罗红染色法对主要脂肪储存的检测结果 秀丽隐杆线虫尽管固定剂处理的尼罗红染色法与生化脂质测定法所获得的绝对定量结果往往不完全一致，但两种方法均能产生高度可重复且具有统计学意义的结果，并在定性上保持一致。此外，该方法可根据不同研究人员的具体需求进行调整，以进一步分析各样品中存在的糖鞘脂、磷脂或甘油三酯等不同脂质类别。需要注意的是，其他研究团队在进行GC/MS分析前，已采用固相萃取（SPE）以外的技术对脂质类别进行分离。22薄层色谱（TLC）和高压液相色谱（HPLC）相较于固相萃取（SPE）的优势在于，它们可能能够更有效地分离不同的中性脂质。例如 TAG、二酰基甘油、游离脂肪酸和胆固醇酯）与极性脂质（磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺）及糖鞘脂分离。我们选择固相萃取法（SPE），因其所需起始材料极少（2,500–5,000 条线虫），且能重点富集主要的长期能量储存物质——三酰甘油（TAGs），后者构成了中性脂质组分的绝大部分4，且快速，无需特殊设备或培养板。需要强调的是，基于标准混合物，SPE 可完全将甘油三酯（TAGs）与磷脂（PLs）分离，具有高度的可重复性和可靠性（见 图 5A）。虽然脂肪酸甲酯的定量与分析需要使用气相色谱-质谱联用仪（GC/MS），但该设备通常易于获取；若本地不具备，可按上述方法制备样品并储存于-80℃ °在氮气保护下保存至由合作者或商业GC/MS服务安排分析。
GCMS 输出结果包含每种脂质物种中各脂肪酸的高分辨率数据，从而能够确定所比较样品之间的详细差异。例如，研究者可以判断在 daf-2、lpd-3 或 fasn-1 RNAi 与载体对照相比时，某些脂肪酸的丰度变化是否显著大于其他脂肪酸。因此，这一极为强大的工具可提供详细信息，揭示在任何实验干预下哪些脂质物种的丰度发生了改变。
在我们的分析中，通常将三酰甘油（TAG）质量归一化为磷脂（PL）质量。尽管在对超声处理后的线虫沉淀物分样进行脂质质量测定后，也可使用蛋白质或DNA作为归一化依据，但我们发现这些方法在所有移液步骤及各提取步骤的样品回收过程中容易引入人为误差。正因如此，我们选择使用PL质量作为归一化因子。在实验流程开始时加入的非天然内标物（TAG使用三十三烷酸三酯，PL使用1,2-二十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)），会贯穿固相萃取和脂肪酸甲酯（FAME）制备的所有步骤，从而确保TAG和PL组分的定量和代表性回收。若研究者使用蛋白质或DNA来归一化TAG质量，则无法提供同等的保证。我们认为PL是跨样本比较TAG水平最可靠的参照指标，因为已有研究表明，PL的含量几乎不受导致TAG质量发生显著变化的相同刺激因素的影响，例如长期饥饿或增加运动量34-36。PL被认为主要发挥结构作用，用于维持膜流动性、细胞完整性以及信号传导功能，而非作为能量储存物质37-39。在我们的实验中，TAG/PL比值与基于固定剂的尼罗红脂质染色结果最为接近，并与其他研究团队的结果一致21。瓦茨（Watts）实验室采用另一种策略，即计算TAG占总脂质的百分比9,22,29。
使用非内源性的甘油三酯（TAG）和磷脂（PL）标准品可确保归一化计算中不包含任何内源性脂肪酸。选择特定碳链长度的标准品完全是基于避免这些标准品对内源性脂肪酸质谱信号产生干扰的需求。我们发现，13:0 和 17:0 的脂肪酸最能满足这一目的。由于短链脂肪酸具有不同的化学特性，我们所使用的非天然脂肪酸标准品可能无法完全代表所有碳链长度或不同不饱和度脂肪酸的回收率。因此，在固相萃取（SPE）或气相色谱-质谱联用（GCMS）过程中，不同碳链长度的脂质在纯化或检测效率上可能存在差异。基于此，以及不同脂肪酸在GCMS中离子化效率的差异，无法对任一特定脂肪酸的绝对丰度做出确切判断。因此，我们仅在同一次实验的不同样品之间比较任一特定脂肪酸的相对丰度。若需对某一脂肪酸进行绝对定量，一种可行的方法是将已知量的稳定同位素标记的13C该种或类似脂肪酸加入按上述方法制备的样品中，使其可通过质谱检测器（MSD）中母离子质量差异加以区分。鉴于我们仅比较脂质类别或任一特定脂肪酸的相对含量，13:0 TAG 和 17:0 PL 标准品已足以满足此目的，并以最低成本确保各类脂质得到充分且具代表性的回收。
迄今为止，对于通过不同方法获得的某些结果的解释，以及主流研究方法应为何种方式，尚未达成共识。总体而言，应当注意到，单一方法均无法理想地适用于独立研究 C. elegans 中的脂肪代谢。然而，通过结合多种筛选与验证手段，可提高对脂质调控基因相关数据的可信度。因此，我们希望本实验方案能成为未来 C. elegans 脂肪代谢研究领域的基准方法。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Michael Kacergis提供的技术协助，以及Lianfeng Wu在讨论和文稿审阅中的贡献。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK）职业发展奖（A.A.S.，项目编号K08DK087941）、NIH/NIDDK培训基金（E.C.P.，项目编号5T32DK007028）、艾略森医学基金会老龄化新学者奖（A.A.S.）和查尔斯·H·胡德基金会儿童健康研究奖（A.A.S.）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96针复制器 | Nunc | 250520 | |
| LB 琼脂 | US Biologicals | L1500 | |
| 琼脂糖 | Invitrogen | 16500500 | |
| 机械移液器 | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |
| 电子移液器 | Biohit E 系列 | E1200 | |
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0，经高压灭菌 |
| 1 M MgSO₄4 | Sigma | M2643 | 经高压灭菌消毒 |
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | 经高压灭菌处理 |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| 5 mg/ml 胆固醇 | Sigma | C8667 | 在100%乙醇中 |
| 200 mg/ml 羧苄青霉素 | US Biologicals | C1100 | 过滤除菌 0.2 μ |
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | 过滤除菌 0.2 μ |
| 100 mg/ml 氨苄青霉素 | 过滤除菌 0.2 μ | ||
| 5 mg/ml 四环素 | 在 100% 乙醇中 | ||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |
| 96孔TC板 | BD-Falcon | 353072 | 96孔RNAi实验 |
| 矩形 A/T 培养板 | 赛默飞世尔科技 | 242811 | 用于RNAi印迹 |
| LB培养基 | US Biologicals | L1530 | 按照制造商说明进行配制 |
| 96孔深孔培养板 | 康宁 | Costar 3960 | 矩形V型底检测板 |
| 96孔浅孔检测板 | 康宁 | Costar 3956 | 圆底V形酶标板 |
| 无菌密封膜 | VWR | 89134-432 | |
| 铝封膜 | 康宁 | Costar 6570 | 96孔板用热封膜密封胶带 |
| M9 缓冲液 | See Hope 等人20 | 见下文配方 | |
| Triton X-100 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0407 | |
| 尼罗红 | Invitrogen | N-1142 | |
| 异丙醇 | Fisher | BP2632-4 | |
| 96孔移液器 | VP Scientific | VP177A-1 | |
| 96孔特氟龙遮蔽显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 定制 | 也可订购Trevigen 96孔Cometslide |
| 96孔Gold-Seal盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 定制 | 也可使用第二个 96 孔 Cometslide |
| 深孔PCR板 | VWR | 89049-178 | |
| 非无菌粘性膜 | VWR | 60941-070 | |
| 高通量显微镜 | Leica | DM6000 全自动显微镜，配备 Prior 96 孔板载物台 | 使用 Chroma 49002 GFP 滤光片组和 2 倍物镜 |
| 浴式超声波清洗器 | Diagenode | Bioruptor XL | |
| 氯仿 | Sigma | 366927-4L | |
| 甲醇 | Fisher | Optima F456-4 | |
| 磷脂标准品 | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-二十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油 |
| 甘油三酯标准品 | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin |
| Wiretrol 50 μ移液管 | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientific |
| 丙酮 | Sigma | 320110-4L | |
| 硫酸 | Fisher | A300-500 | |
| 己烷 | Fisher | Optima H306-1 | |
| SPE 硅胶柱 | 赛默飞世尔科技 | 60108-317 | Hypersep SI，100 mg 树脂床 |
| 固相色谱装置 | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL |
| 硼硅酸盐移液管 | Fisher | 13-678-27F | 10 ml 规格 |
| 硼硅酸盐巴斯德移液管 | Fisher | 13-678-8B | |
| 硼硅酸盐培养管 | Fisher | 14-961-27 | |
| 螺纹硼硅酸盐玻璃管 | VWR | 14235-460 | 8 ml 容量 |
| 培养管用酚醛帽 | Fisher | 14-823-211 | |
| GC/MS 自动进样瓶 | 安捷伦 | 5188-6592 | |
| 自动进样瓶瓶盖 | Agilent | 5185-5861 | |
| GC/MS | 安捷伦 | 6890 GC / 5973 MSD | 配备 Supelcowax-10 柱 |
线虫生长培养基（NGM）：为制备25块96孔RNAi板，准备1 L NGM： <表格 边框="1"> | |||
| 试剂 | 量 | ||
| 去离子水 | 1 L | ||
| NaCl | 3 g | ||
| 琼脂糖 | 17 g | ||
| 胰蛋白胨 | 2.5 g | ||
| 高压灭菌液体循环 121 °C，搅拌40分钟。冷却至60 °60℃加热板上搅拌 °C. 然后加入以下成分： | |||
| 1 M MgSO₄4 | 1 ml | ||
| 5 mg/ml 胆固醇 | 1 ml | ||
| 1 M KH2PO4 （pH 6.0） | 25 ml | ||
| 1 M CaCl2 | 1 ml | ||
| 200 mg/ml 羧苄青霉素 | 1 ml | ||
| 1 M IPTG | 5 ml | ||
| 分装至96孔RNAi板中，4℃保存 °C，最多可保存2周。 |
含氨苄青霉素/四环素的LB琼脂矩形平板（A/T）：配制20块A/T平板，需准备1 L培养基：
<表格 边框="1"> 试剂 量 去离子水 1 L LB 琼脂（US Biologicals） 32 g 2 M NaOH 1.5 ml Bacto琼脂 2.5 g 高压灭菌液体循环 121 °60°C，搅拌40分钟。然后冷却至60°C °60℃热板上搅拌 °C. 然后加入以下成分： 四环素 3 ml 100 mg/ml 氨苄青霉素 0.5 ml 每个培养皿中加入45 ml，避光保存于4℃ °4°C 保存，最多可保存 4 周。LB细菌培养基：配制4 L，足以用于培养和重悬25块96孔板
将62 g LB粉末（US Biologicals）、4 L蒸馏水和4.8 ml 2 M NaOH混合。分装为1 L或0.5 L等份，经液体循环程序高压灭菌40分钟。可于室温下密封瓶中保存最多1年。若出现浑浊则弃用。
100 mg/ml 氨苄青霉素
将5 g氨苄青霉素粉末与去离子水混合至总体积50 ml，0.2 μm滤膜过滤除菌 μ，分装为每份1 ml，于-20℃保存 °C 保存至使用。
5 mg/ml 四环素
将1.25 g四环素粉末加入250 ml 100%乙醇中，充分混匀至完全溶解，于-20℃保存 °在避光容器中保存。
200 mg/ml 羧苄青霉素
将10 g羧苄青霉素粉末与去离子水混合至总体积50 ml，用0.2 μm滤膜过滤除菌 μ，分装为每份1 ml，于-20℃冷冻保存 °C下保存至使用。
5 mg/ml 胆固醇
将1.25 g胆固醇加入250 ml 100%乙醇中。充分混匀，4℃保存 °C，最长可达6个月。
1 M MgSO₄4
溶解 120.37 g MgSO₄·7H₂O 于 500 mL 去离子水中4 加入800 ml去离子水中，定容至1 L。液体循环条件下高压灭菌40分钟，室温保存。
1 M CaCl2
溶解 110.98 g CaCl₂2 在800 ml去离子水中溶解，定容至1 L。121°C湿热灭菌40分钟，室温保存。
1 M KH2PO4，pH 6.0
溶解 136.09 g KH2PO4 在800 ml去离子水中，调节pH至6.0，并定容至1 L。121°C湿热灭菌40分钟，室温保存。
M9 缓冲液：配制 1 L—我们通常制备 8-10 L 的批次
溶解 3 g KH2PO4，6 g Na2高通量筛选4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO₄4 在900 ml中，加水至终体积1 L。分装至100-500 ml瓶中，液体循环下高压灭菌40分钟，室温保存。
10 N NaOH
将400 g NaOH溶于800 ml去离子水中，冷却后定容至1 L。室温下储存于50 ml离心管中。
1 M IPTG
加入 23.81 g IPTG 至去离子水中，定容至 100 ml。0.2 μm 滤膜过滤除菌 μ，分装为每份1 ml，于-20℃保存 °C，直至使用。
卵制备漂白/NaOH溶液：20 ml，足够一次卵制备使用
加入 4 ml 次氯酸钠溶液、1 ml 10 N NaOH、5 ml H2O，并将10 ml M9缓冲液加入50 ml聚丙烯圆锥管中。使用前立即配制。
尼罗红储存液
将50 ml 100%丙酮加入25 mg Nile red粉末中，充分混匀，置于避光、封有Parafilm的容器中室温保存。此溶液可在此条件下保存数月。
尼罗红染色液：500 ml，足以用于30块96孔板的染色
将3 ml Nile red储存液加入500 ml体积分数为40%的异丙醇中。用锡箔包裹的玻璃瓶于室温保存。使用前立即配制。
磷脂标准品
称取7.6 mg磷脂标准品，1,2-二十七烷酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油）于玻璃烧杯中。溶于20 ml 2:1 氯仿:甲醇溶液中（每50 μl含25 nmol） μl). 避光保存于铝箔中，直至使用。标准品也可保存于 -80 °在带有酚盖的密闭玻璃小瓶中，于 -20°C 下保存 1 年。
甘油三酯标准品
称取6.8 mg甘油三酯标准品tritridecanoin至玻璃烧杯中，溶于30 ml 2:1氯仿:甲醇溶液中（每50 μl含16.7 nmol） μl). 用铝箔覆盖，直至使用。标准品也可在 -80 保存 °C，置于带酚盖的密封玻璃小瓶中，可保存1年。
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重印与许可
