光遗传学技术使得研究特定神经元对行为的贡献成为可能。本文描述了一种在幼年斑马鱼中激活表达通道视紫红质变体（ChEF）的单个躯体感觉神经元的方法，该方法采用半导体泵浦固体（DPSS）激光器进行激活，并使用高速摄像机记录所引发的行为反应。
本文内容
摘要
摘要
幼年斑马鱼正逐渐成为描述简单神经回路发育与功能的模型。由于其体外受精、发育迅速且身体透明，斑马鱼特别适用于采用光遗传学方法来研究神经回路的功能。在该方法中，特定神经元中表达光敏感离子通道，使研究者能够随意激活或抑制这些神经元，从而评估它们对特定行为的贡献。在幼年斑马鱼中应用这些方法在概念上较为简单，但需要对技术细节进行优化。本文演示了一种在幼年斑马鱼体感神经元中表达一种通道视紫红质变体、光激活单个细胞并记录其行为反应的实验流程。通过在先前建立的方法基础上进行若干改进，该方法可用于诱导激活受精后至少4天内（dpf）单个神经元所引发的行为反应。具体而言，我们构建了一种转基因载体，利用体感神经元增强子CREST3驱动标记的通道视紫红质变体ChEF-tdTomato的表达。将该转基因注入单细胞期胚胎后，可在体感神经元中实现嵌合表达，并可通过共聚焦显微镜进行成像。利用473 nm的DPSS激光器发出的光，经由光纤导引，照射这些动物中已识别的细胞，可诱发可被高速摄像机记录并进行定量分析的行为反应。该技术可被调整用于研究激活任意斑马鱼神经元所引发的行为。将此方法与遗传学或药理学干预相结合，将是研究神经回路形成与功能的有力手段。
引言
利用特定波长的光来促进或抑制神经元兴奋性的光遗传学方法的发展，使得研究控制行为的神经回路中不同神经元群体的功能成为可能1, 19, 21。该技术常用于激活神经元群体，但也可用于激活单个神经元。斑马鱼幼体特别适用于这些方法，因为它们身体透明、神经系统发育迅速，且制备转基因动物快速且常规化。然而，要可靠地实现单个神经元的激活，仍需克服重大的技术难题。
为了优化对单个斑马鱼神经元进行光遗传学激活的实验流程，我们聚焦于体感神经元。斑马鱼幼体通过两类神经元群体来感知多种体感刺激：三叉神经元支配头部，而罗氏-比德（Rohon-Beard, RB）神经元则支配身体其余部分。每个三叉神经元和RB神经元均发出一条外周轴突，其在皮肤中广泛分支以感知刺激，同时还发出一条中枢轴突，连接至下游神经环路。动物在受精后21小时（hpf）即能对触觉刺激产生反应，表明功能协调的体感神经环路已经形成5, 18。在幼体发育过程中，至少部分三叉神经元和RB神经元会与Mauthner细胞形成突触，从而触发典型的逃避反应；但越来越多的证据表明，存在多种类型的体感神经元，其连接模式各不相同，可能引发多样化的逃避行为变体2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17。我们开发该方法的初衷是表征不同类型体感神经元的行为功能，但原则上，该方法也可用于研究斑马鱼幼体中几乎任何单个神经元或神经元群体的功能。
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方案
提前准备好以下物品。
1. 准备光纤线缆
- 通过在本生灯上熔化玻璃巴斯德移液管的锥形颈部，制成一个用于存放光纤的储存装置，使其形成约150°的夹角。
- 使用金属丝切割器或剃刀片，小心地将光纤切割为两段，每段应保留一端带有FC/PC接头，另一端为裸露的光纤端。将其中一段作为备用光纤妥善保存。
- 从光纤切割端起，剥离5.0 cm长的光纤护套和增强纤维，使光纤包层暴露（图1A）。
- 将光纤插入已准备好的巴斯德移液管中，确保光纤可在移液管尖端自由进出。
- 使光纤从巴斯德移液管尖端伸出，小心剥离玻璃纤维周围约2 mm处的包层。
- 使用金刚石笔或玻璃切割刀在玻璃纤维上刻痕，然后折断末端，以在光纤末端形成平整的切面（图1B）。
- 将光纤缩回巴斯德移液管中以储存。若光纤尖端出现崩裂或断裂不平整，需重复步骤（1.6）。
- 使用显微操作器将光纤在巴斯德移液管中进行精确定位（图1C）。
步骤2-8描述了一种将转基因注入胚胎的方法，该方法通常适用于多种斑马鱼实验。该方法的多种改良版本，如其他JoVE视频中所述6, 7, 8, 9, 22，同样有效。
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结果
图1. 光纤电缆装置。 (A) 光纤电缆的分层结构。(B) 置于巴斯德移液管中的去皮光纤电缆。(C) 使用显微操作器定位的置于巴斯德移液管中的光纤电缆。
图2. 注射模具模板。
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讨论
我们介绍了一种在活体斑马鱼中对单个 RB 神经元进行光遗传学激活的方法。本方法采用瞬时转基因技术，在特定的体感神经元中表达一种带荧光标记的通道视紫红质变体 ChEF-tdTomato13。该方法可轻松适用于其他斑马鱼幼体细胞群体。
采用该方法，我们能够持续诱导表达 ChEF-tdTomato 的 34–48 小时受精后（hpf）幼鱼产生行为反应。使用持续 5 毫秒、5 伏的蓝光脉冲，可成功激活单个 RB 神经元（图 7）。通过将光纤置于动物体的不同位置，我们发现必须将蓝光直接对准细胞体才能引发行为反应。在不表达 ChEF 的幼鱼中，光脉冲无法引发任何反应。此外，即使在幼龄幼鱼中，沿中枢轴突或外周轴突施加光脉冲也从未引发反应（数据未显示）。这一特性具有优势，使得我们能够可靠地激活多个神经元被标记动物中的单个神经元，即使其他神经元的中枢轴突经过目标神经元细胞体附近时亦如此（视频 4–6）。
为了检验该方法在评估运动学参数方面的可靠性，我们测定.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Fumi Kubo、Tod Thiele 和 Herwig Baier（UCSF/马克斯·普朗克研究所）在行为实验和 DPSS 激光装置方面的建议；感谢 MBL 神经生物学课程的 Heesoo Kim 和 Chiara Cerri 协助完成 ChEF-tdTomato 实验；感谢 Petronella Kettunen（哥德堡大学）在光遗传学实验初期的合作；感谢 Baljit Khakh、Eric Hudson、Mike Baca 和 John Milligan（加州大学洛杉矶分校）提供的技术建议；并感谢 Roger Tsien（加州大学圣地亚哥分校）提供 ChEF-tdTomato 载体。本研究得到了美国国家卫生研究院培训基金（NRSA：5F31NS064817）对 AMSP 的资助，以及美国国家科学基金会（NSF：RIG:0819010）对 AS 的项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 玻璃巴斯德移液管 | Fisher | 1367820B | 或等效产品（直径10-15 mm） |
| 200 μm 光纤 | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | 跳线，长度：3 m，端A：FC/PC，端B：FC/PC，护套：FT030 |
| 50 μm 光纤 | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | 跳线，长度：3 m，端A：FC/PC，端B：FC/PC，护套：FT030 |
| 可调式剥线工具 | ThorLabs | AFS900 | 或三孔剥线工具（FTS4） |
| 金刚石楔形刻划笔 | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown 微量移液管拉制仪 | Sutter Instruments | P-97 | 或等效产品 |
| 含丝硼硅酸盐玻璃管 | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| 注塑模具 | n/a | n/a | 图5 |
| 1.5 ml 离心管 | 任意 | 任意 | |
| 培养皿（100×15 mm） | 任意 | 任意 | |
| 培养皿（60×15 mm） | 任意 | 任意 | |
| 压力注射仪 | ASI | MPPI-3 | 或等效产品 |
| 显微操作器及金属支架 | Narashige | M152 | 或等效产品 |
| 一次性塑料移液管 | Fisherbrand | 13-711-7 | 或等效产品 |
| 探针（针夹和昆虫针） | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 和 26000-70 | 或等效产品 |
| 镊子 | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | 或等效产品 |
| 微量移液器加样头（Microloader） | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C 培养箱 | 任意 | 任意 | |
| 42 °C 加热块 | 任意 | 任意 | |
| 非无菌手术刀片 #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | 或等效产品 |
| 解剖显微镜 | Zeiss | Stemi | 或等效产品 |
| 带标准滤光片的荧光解剖显微镜 | 任意 | 任意 | 或等效产品 |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 510 或 710 | 或等效设备，配备GFP和RFP激光器，以及10x、20x和40x物镜 |
| 高速相机 | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | 或等效产品 |
| 473 nm 便携式激光器 | Crystal lasers | CL-473-050 | 或更高功率，带TTL选项 |
| S48 刺激器 | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | 或等效产品 |
| FC/PC 至 FC/PC 连接套筒 | ThorLabs | ADAFC1 | 可能需要用于光纤连接 |
| 激光防护眼镜 | ThorLabs | LG10 | 或等效产品 |
| 24孔培养板 | Genesee | 25-102 | 或等效产品 |
| 单凹载玻片 | Fisher | S175201 | 或等效产品 |
| 试剂 | |||
| Instant Ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| 亚甲蓝 | Fisher | S71325 | |
| 酚红 | Sigma | P4758 | |
| 琼脂糖 | EMD | 2125 | 或等效产品 |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma | A9045 | 或等效产品 |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| 三卡因（Tricaine） | Sigma | A5040 | |
| 蓝色/胚胎用水 | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6滴亚甲蓝 | ||
| 酚红 | (5 mg/ml 溶于 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O 70 °C下溶解，频繁振荡 分装并储存在 -20 °C | ||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml 蓝色/鱼用水 | ||
| 三卡因（Tricaine）储备液 | 400 mg 三卡因 97.9 ml ddH2O | ||
| 约2.1 ml 1M Tris，pH9.0 | 调节pH至约7.0 短期储存于4 °C，长期储存于-20 °C |
参考文献
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional start....
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