啮齿类动物跑轮活动昼夜节律的记录与分析

摘要

哺乳动物自主转轮跑动活动的昼夜节律与大脑主时钟的分子振荡紧密耦合。因此，这些行为上的日节律可用于研究遗传、药物和环境因素对昼夜节律时钟功能的影响。

摘要

当啮齿类动物在饲养笼内可自由接触跑轮时，其对跑轮的自发使用行为会因一天中的不同时段而异^1-5。夜行性啮齿类动物（包括大鼠、仓鼠和小鼠）在夜间活跃，而在白天相对不活跃。许多其他行为和生理指标也表现出昼夜节律，但在啮齿类动物中，跑轮活动是下丘脑视交叉上核（SCN）这一主昼夜节律起搏器输出信号的一种特别可靠且便捷的测量指标。通常情况下，通过一种称为“同步化（entrainment）”的过程，跑轮活动的每日模式会自然地与环境中的光暗周期（LD周期；例如 12小时光照：12小时黑暗）保持一致。然而，昼夜节律是机体内部产生的、周期约为24小时的行为节律，即使在持续黑暗条件下仍能持续存在。因此，在缺乏光暗周期的情况下，通过记录和分析跑轮活动可用于确定个体的主观日间时间。由于这些节律由昼夜节律钟调控，该主观日间时间被称为昼夜节律时间（circadian time, CT）。相反，当存在光暗周期时，由环境光暗周期所决定的日间时间则称为授时因子时间（zeitgeber time, ZT）。

尽管跑轮活动中的昼夜节律通常与SCN生物钟相关^6-8，但大脑和身体其他多个区域的昼夜振荡器^9-14也可能参与调控日常活动节律。例如，食物预期性活动的昼夜节律并不依赖SCN^15,16，而是与SCN以外振荡器活动的变化相关^17-20。因此，跑轮活动记录不仅可提供关于主导性SCN生物钟输出的重要行为学信息，还能反映SCN以外振荡器的活动状态。下文将介绍用于记录、分析和展示实验啮齿类动物昼夜运动活动节律所使用的设备与方法。

方案

1. 动物饲养

1. 笼具： 为了记录单个啮齿类动物的转轮活动，每个笼子应单独饲养一只啮齿类动物并配备一个转轮。由于转轮可被视为一种环境富集形式，因此在任何研究中，所有啮齿类动物都应具有相似的转轮使用条件。
2. 更换垫料： 动物操作以及更换笼具或垫料均可能对昼夜节律产生非光效应^21-23因此，使用网底笼具是理想选择，因为它可最大限度减少与动物的接触。尽管此类托盘系统可用，但在实验的关键阶段仍应避免更换垫料。替代方案包括使用持久性更长的垫料，以减少换笼频率，或按照伪随机时间表更换笼具。
3. 隔离箱： 笼子应放置在隔音、光照可控且通风良好的隔离箱中。根据隔离箱的尺寸和结构，每个箱内通常可容纳1至8个笼子。当在同一个隔离箱中饲养多个笼子时，应注意来自其他动物的各种气味和声音可能对个体动物的昼夜节律行为产生混杂影响。为避免此类问题，应尽量做到每个隔离箱内只饲养一个笼子。
4. 通气： 充足的空气流通对于为啮齿类动物创造舒适的箱内生活环境至关重要。每个箱子内的风扇应加装遮罩，以防止外部光线进入箱内。此外，风扇通常会将箱内空气抽出并排入室内。小型避光通风口可使空气从多个位置进入隔离箱，有助于避免产生令人不适的气流。为确认通风是否充足，可将隔离箱关闭数小时并开启灯光，此时箱内温度应与所处房间的温度基本相同。
5. 照明： 环境光照强度应在所有笼具中保持一致。在每个笼具上方的相似位置安装单个光源，并始终使用相同品牌/类型的灯泡。笼具水平面的光照强度应为中等（100–300 勒克斯）。避免使用过高的光照强度，以免引起由光照本身而非昼夜节律系统所致的行为直接改变。 本身 (例如 遮蔽）
6. 黑暗/微弱红光： 如果需要在黑暗中处理或对待动物（例如 在持续黑暗或夜间环境中，应使用夜视镜。或者，由于昼夜节律系统对红光波长相对不敏感，可使用弱红光照明。所使用的特定红光应经过测试，以确保其不会改变跑轮活动（例如 遮蔽）或调节昼夜节律（例如 产生相位偏移）。

2. 数据采集（见图1 - Vitalview硬件配置）

1. 跑轮：跑轮的直径和人体工学设计会影响其使用频率²⁴。因此，对小鼠应使用较小且较轻的跑轮，对大鼠则应使用较大且较重的跑轮。在清洗并重新安装跑轮时，应确保跑轮能够无阻碍地旋转，不出现“晃动”现象，并且每次转动都能触发记录用的微动开关。
2. 微动开关：跑轮每旋转一圈都应触发一个磁性或机械式微动开关。微动开关的信号通过单通道传输，并由计算机按时间间隔（例如 每2、5、6或10分钟）对数据进行分段记录。
3. 计算机硬件：我们的跑轮记录使用Vitalview系统完成，该系统是由Mini Mitter公司开发的软硬件平台（http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm）。然而，也存在其他记录平台，例如由Actimetrics公司开发的ClockLab系统（http://www.actimetrics.com/ClockLab/）。这两个平台均可将来自多个单通道的数据源（例如 由单个跑轮触发的单个微动开关）整合至同一个计算机文件中。之后可对各个通道的数据分别进行绘图和分析。

3. 数据记录

1. 文件：上述软件平台可用于分离单个通道，从而为每个转轮记录生成独立的文件。此类数据最好使用专门设计的程序进行可视化和绘图，例如 Actiview（Minimitter, Bend, OR）、Circadia 或 Clocklab（Actimetrics, Wilmette, IL），这些程序均可生成周期图和活动图。然而，单通道文件也可使用通用电子表格程序（如 Excel（Microsoft, Redmond, WA））打开并进行分析。
2. 计算昼夜节律时间（CT）：根据定义，CT 12 是夜行性啮齿类动物转轮活动开始的时刻。与24小时一天相对应，按照惯例，一个昼夜节律周期被划分为24个昼夜节律小时。因此，如果通过时钟测量得到的自由运行昼夜节律周期为24小时30分钟，则CT 0 将大约出现在CT 12之后的12小时15分钟。

结果

1. 计算机程序：在生成活动图谱和计算昼夜节律周期时，通常会使用专门的计算机程序。这些程序包括但不限于 Actiview（Minimitter, Bend, OR）和 Circadia。
2. 活动图谱（Actograms）：活动图谱以图形方式展示跑轮活动的每日模式。活动图谱可分为单绘图型（横轴 = 24 小时）和双绘图型（横轴 = 48 小时）。两种方法均从上至下依次绘制连续的天数，但双绘图型活动图谱在每条水平线上绘制两天的数据。具体而言，双绘图型活动图谱在每行最右侧显示“第二天”的数据，同时也在下一条水平线的起始位置显示，依此类推。双绘图法特别有助于可视化非24小时的节律。
3. 周期图（Periodogram）：周期图是通过对随时间变化的跑轮活动进行频谱分析而构建的。周期图显示一系列预设周期的相对功率，常用于确定自由运行周期（free-running period）。
4. 结果：在实验室中，啮齿类动物通常饲养在24小时明暗循环（LD cycle）条件下。在此条件下，其活动节律被环境周期所...

讨论

利用跑轮监测每日活动节律是评估夜行性啮齿类动物主昼夜节律钟输出的最常用且最可靠的方法。然而，跑轮活动仅是可连续监测的行为和生理多个方面之一。尽管绝大多数跑轮活动发生在夜间，但超过30%的总清醒时间出现在白天^25,26。其他可用于评估昼夜节律的指标包括总体活动、食槽接近行为、饮水、睡眠以及体温。因此，根据研究性质的不同，研究人员可同时记录多种节律。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vitalview 卡 &硬件与软件	Mini Mitter	#855-0030-00	（美国俄勒冈州本德）
DP24 数据端口	Mini Mitter	#840-0024-00	（美国俄勒冈州本德）
QA4-模块	Mini Mitter	#130-0050-00	（美国俄勒冈州本德）
磁性开关	Mini Mitter	#130-0015-00	美国俄勒冈州本德
C-50 电缆组件	Mini Mitter	#060-0045-10	（美国俄勒冈州本德）
大鼠跑轮装置组装	Mini Mitter	#640-0700-00	（美国俄勒冈州本德）
笼具与托盘支架	Mini Mitter	#640-0400-00	（美国俄勒冈州本德）
可使用的剖开式笼具	Mini Mitter	#664-2154-00	（美国俄勒冈州本德）
笼具的格栅地板	Mini Mitter	#676-2154-00	（美国俄勒冈州本德）
废液盘	Mini Mitter	#684-2154-00	（美国俄勒冈州本德）
灯箱	Microlites Scientific	#R-101	（加拿大安大略省多伦多）
4W 荧光灯管	Microlites Scientific	#F4T5/CW	（加拿大安大略省多伦多）
隔离室	定制构建		28"H × 20"W × 28"D ½" 黑色三聚氰胺