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方法文章

在 Aplysia californica 中通过细胞外记录识别特定肌肉运动池的运动神经元

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DOI：

10.3791/50189

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2013年3月25日

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

在具有大型可识别神经元的动物中例如 软体动物）的运动池分析采用细胞内记录技术进行1,2,3,4最近，我们开发了一种在细胞外刺激并记录单个神经元的技术 Aplysia californica5我们现描述一种利用该技术对运动池内运动神经元进行特异性鉴定与表征的实验方案。

摘要

在具有大型已鉴定神经元的动物中例如 软体动物），运动神经元池的分析采用细胞内记录技术进行1,2,3,4最近，我们开发了一种在细胞外刺激并记录单个神经元的技术 Aplysia californica5我们现描述一种利用该技术对运动池内运动神经元进行特异性鉴定与表征的实验方案。

这种细胞外技术具有多项优势。首先，细胞外电极能够透过鞘膜刺激并记录神经元5，因此无需去除鞘膜。因此，在细胞外实验中神经元的状态比在细胞内实验中更为健康。其次，若通过适当固定鞘膜使神经节旋转，则细胞外电极可接触神经节两侧的神经元，从而在同一制备样本中更简便、高效地识别多个神经元。第三，细胞外电极无需穿入细胞，因此可在不同神经元之间轻松移动，对神经元造成的损伤更小。当需要在持续时间仅数分钟的重复运动模式期间记录多个神经元时，这一特点尤为有用。第四，细胞外电极在肌肉运动过程中比细胞内电极更具灵活性。细胞内电极可能在肌肉收缩时被拉出，从而损伤神经元；而细胞外电极仅轻柔地压在神经元上方的鞘膜上，通常能在肌肉收缩期间保持在同一个神经元上方，因此可用于结构更完整的制备样本。

为了使用细胞外电极唯一鉴定运动神经元池（特别是Aplysia中的I1/I3肌肉）中的运动神经元，可采用无需细胞内记录即可获取的特征作为鉴定标准：胞体大小和位置、轴突投射路径以及肌肉支配方式4,6,7。针对本技术示例所用的特定运动神经元池，我们通过记录口神经2和3的信号来测定轴突投射，同时测量I1/I3肌肉的收缩力，以确定各个运动神经元对肌肉的支配模式。

我们展示了首先利用肌肉神经支配来鉴定运动神经元，然后表征其在运动模式中的放电时序，进而建立一种简化的快速鉴定方法的完整过程。这种简化且更快速的诊断方法更适用于结构更完整的标本，例如悬吊式口器团块标本8或在体9实验。该方法也可应用于Aplysia的其他运动神经元群10,11,12，或其他动物系统中的运动神经元群2,3,13,14。

方案

1. 记录皿的准备

  1. 在力传感器实验过程中，将口部神经节、脑神经节和口球肌肉组织置于一种专为力学研究设计的圆形派热克斯（Pyrex）培养皿中。
  2. 为了在实验中诱导出类似摄食的行为模式，需要将不可水解的胆碱能激动剂卡巴胆碱（carbachol）施加于脑神经节15。为避免卡巴胆碱直接接触口部神经节和口球肌肉组织，必须使用独立的隔室，将脑神经节与口部神经节及口球肌肉组织分离开来（图1）。
  3. 由于口球肌肉组织比口部神经节厚得多，二者无法放置在同一水平面上。因此，该培养皿应设有后部隔室用于放置脑神经节（图1中的区域A）、中部平台用于放置口部神经节（图1中的区域C），以及更深的前部腔室用于容纳口球肌肉组织（图1中的区域D）。
  4. 制作该培养皿时，首先准备一个圆形的100×15 mm派热克斯培养皿（高15 mm，直径100 mm）。培养皿的构建需分多次浇注Sylgard硅胶。请遵循Sylgard产品附带的使用说明，并确保每次浇注之间留有足够时间使Sylgard充分固化。
  5. 第一次浇注用于在培养皿中形成最高处的Sylgard结构（图1中的区域B），即中部平台与后部隔室之间的隔墙。
  6. 使用两块造型黏土作为模具，界定出Sylgard隔墙的浇注区域（图1中的区域B）。在黏土与Sylgard接触的部分包裹塑料薄膜，以便后续更容易移除黏土。确保黏土与培养皿边缘接触处密封严密，以尽量减少漏液。
  7. 将Sylgard浇注至两块造型黏土之间的区域，高度接近培养皿顶部。让Sylgard静置过夜完全固化。将培养皿置于温暖环境中可加快固化速度。随后移除造型黏土，并清理Sylgard表面残留的黏土碎屑。
  8. 接下来，浇注后部隔室（图1中的区域A）和中部平台（图1中的区域C）。
  9. 在已固化的Sylgard前端约5 mm处，用造型黏土围出中部平台（区域C）的浇注区域。
  10. 向后部隔室（区域A）和中部平台（区域C）区域浇注Sylgard，使其高度比第一次形成的Sylgard隔墙（区域B）顶部低约3–5 mm。后部隔室的Sylgard表面应略低于中部平台，以防止含有卡巴胆碱的溶液从前部泄漏至中部平台。再次静置过夜使Sylgard完全固化，然后移除造型黏土模具。
  11. 最后一步是在Sylgard隔墙的中央切出一个凹槽，为脑-口连接神经（CBCs）提供通道，使其能穿过中部平台与后部隔室之间的隔墙。该凹槽宽度应约为3–4 mm，足以容纳CBCs。凹槽底部不得低于中部平台的Sylgard表面，以防液体泄漏。可使用手术刀片进行切割。

2. 电极制备

  1. 使用Flaming-Brown微电极拉制仪，按照McManus et al.8在第3.1节中所述的方法，用单通道毛细玻璃管拉制细胞外玻璃电极。当拉制仪中使用FT345B灯丝时，我们通常的程序设置为：加热480，拉力50，速度13，时间20；但需注意，不同灯丝的设置会有所不同。该程序通过一次拉制完成电极制备，无需火焰抛光步骤。电极尖端的尺寸应小于细胞体的大小。对于胞体直径在50 μm至400 μm之间的运动神经元，细胞外玻璃电极的内径应约为40 μm，当充满Aplysia生理盐水时，其电阻应约为0.1 MΩ。
  2. 使用本生灯从聚乙烯管上拉制吸吮电极。截取一段长约10 cm的聚乙烯管，用手握住管子两端，将其靠近本生灯产生的火焰，并同时旋转管子，直至其受热变软。在将管子缓慢移离火焰的同时，沿其长度方向小心拉伸。随着拉伸，管子的中部将被拉长并变细。
  3. 将拉细的管子从中剪断，形成两个吸吮电极。吸吮电极通常应用于神经或肌肉的切断端，但有时也可用于旁路记录（en passant）。
  4. 按照McManus et al8在第3.2–3.13节中描述的方案制备钩状电极，用于神经记录。当神经或肌肉未被切断时，此类电极尤为适用。

3. 钩状电极的安装

  1. 解剖动物，并按照 McManus 描述的方案取出口球部 等8 第4节
  2. 用于记录和刺激时，钩状电极可连接至多种不同的神经。
  3. 为了表征模式，如之前所进行的那样 体内 由 Cullins 和 Chiel9必须从 I2 神经和肌肉获取记录，以指示摄食的前伸相16，指示食物钳闭合的齿舌神经（RN）17，指示缩回时相的颊神经2（BN2）和颊神经3（BN3）17,18钩状电极的连接遵循与McManus所述相似的步骤 等8第5节
  4. 这些神经的位置参照示意图中的 Aplysia 摄食装置如图所示 图2 麦克马纳斯的 等8注意，BN2分为三个分支 a, b，以及 c 在侧沟处于第1指伸肌下方走行之前。分支 a 是主干上最先分出的分支，且与BN3相邻。
  5. 分支的命名法 a, b，以及 c 被Warman和Chiel所采用18. 分支 a, b，以及 c 分别对应 Nargeot 命名法中的分支 3、2 和 1 等19此外，RN、BN1、BN2 和 BN3 分别对应于 Kandel 命名法中的神经 1、6、5 和 420 和 Scott 等21
  6. 为了研究 I1/I3 肌肉的神经支配，实验过程中将切断除第2对口神经外的所有其他神经。因此，我们使用钩状电极记录 BN2 的电活动。
  7. 由于I2神经和RN未与口器肌肉相连，且使用钩状电极难以接触，因此更适合采用吸吮电极对其进行记录。我们将在第7节中描述吸吮电极的应用方法。
  8. 使用钩状电极或吸吮电极记录BN3的信号，因为这两种电极均易于接触BN3。我们选择使用钩状电极进行BN3记录，以尽量减少用于固定吸吮电极的操纵器数量，并为其他操纵器或设备节省空间。
  9. 将钩状电极连接至分支 a 将BN2（BN2-a）用于在实验期间诱发类似排斥的模式。在另一侧的BN2-a上附加一个钩状电极是有用的，因为某些神经元对同侧与对侧BN2-a刺激的反应不同。
  10. 为了帮助区分具有单侧与双侧投射的神经元，还可将钩状电极连接到口部神经节另一侧的BN2和BN3上。

4. 神经节与肌肉制备

  1. 将准备口神经节、脑神经节和口球，用于力传感器实验，其中脑神经节通过脑-口连接支（CBCs）与口神经节相连，口球则仅通过口神经2支（BN2s）与口神经节相连。
  2. 连接钩状电极后，从口球附着处双侧切断口神经1（BN1）和食管神经（EN）。
  3. 将脑神经节向前牵拉，使其避开I2肌。在齿舌囊上方的I2肌上做一切口，分别向两侧及前方延伸切口，向前掀开I2肌瓣以暴露齿舌神经。切断齿舌神经的两个分支，并确保分支长度足以连接吸电极。
  4. 以宽弧形切口继续沿口侧神经节周围切开I2，注意不要切断BN2或BN3，直至口侧神经节及其附着的I2肌肉部分能够完全与口器组织分离。在钩状电极附着点以外的位置，切断双侧BN3与口器组织相连的附着点。
  5. 在上述记录皿中连接后室与中间平台的凹槽处，用移液枪头取少量真空脂，均匀涂抹成一层薄层。
  6. 在中间平台Sylgard基底前方的前室玻璃底部涂抹一层薄薄的Quick-Gel瞬间胶，用于放置口球。
  7. 小心地将脑神经节、口神经节和口部肌肉组织转移至记录皿中（图1）如第2节所述，确保钩状电极未被过度拉紧，以免损伤神经。
  8. 将口器团块小心地放置在记录皿前室的胶上，确保其腹面粘附在皿底。注意避免神经节和电极接触胶体。添加 Aplysia 生理盐水8 （460 mM NaCl，10 mM KCl，22 mM MgCl₂）2，33 mM MgSO₄4，10 mM CaCl2，加入含10 mM葡萄糖、10 mM MOPS（pH 7.4–7.5）的溶液至培养皿中，以诱导胶体固化。
  9. 如果需要将培养皿转移至另一台显微镜以准备进行口神经节胞体的细胞外记录，请务必小心操作钩状电极。将位于口神经节一侧的所有电极集中在一起，再将另一侧的电极也分别集中。用手小心握住覆盖在连接针脚上的实验室胶带固定电极，注意确保任何电极均未被过度拉紧。
  10. 当培养皿置于显微镜下时，电极应轻轻搭在培养皿的边缘，并放置在培养皿旁的平台上。
  11. 在实验的间歇期及不同阶段之间，使用水族箱用气石对口质量室中的生理盐水进行通气。
  12. 用镊子夹住脑神经节的鞘膜，将其拉入后室，确保 CBCs 通过切口。使用除 CBCs 以外的其他神经固定脑神经节，以避免损伤完整的 CBCs。
  13. 在CBCs上涂抹更多的真空润滑脂，然后继续添加 Aplysia 向培养皿的两个腔室中加入生理盐水，使神经节完全浸没。确保真空脂的顶部略高于Sylgard壁，以防止腔室之间发生泄漏。
  14. 为稳定口神经节，首先将BN3的末端固定在中间平台Sylgard基底上，然后依次固定BN1和EN图2）。由于将使用钩状电极记录BN3，因此针电极的位置应比钩状电极的附着点更偏 distal（远端）。
  15. 使用两个呈90度弯曲的针作为钩子来拉伸并固定CBCs，以避免损伤CBCs（图2).
  16. 将连接后腔室与口部神经节的RN分支固定。此时I2肌将位于RN上方。为暴露I2神经，用镊子夹住I2肌并将其拉过口部神经节。将I2肌的两个角固定，以避免损伤I2神经。
  17. 在I2神经的两个分支汇合至I2肌之前的远端切断该神经。确保肌肉仍保留神经支配，以保证与对照组具有可比性。 体内 记录。切除其余的I2肌肉，并将I2神经翻转至后方，固定于两条RN分支之间（参见 图2（插图）。
  18. 调整固定针的位置，若神经过于松弛，则拉伸并增加张力；若神经过紧，则释放张力。为进一步稳定口部神经节，可在神经之间的鞘膜上增加更多固定针。
  19. 由于口侧神经节呈尾侧朝上的位置放置，如果目标神经元位于头侧，则需旋转口侧神经节。要旋转两个口侧神经节中的其中一个，可用精细镊子夹住靠近口侧神经节处的循环脑神经（CBC）上多余的鞘膜，并将其固定在神经束2（BN2）与神经束3（BN3）之间。在某些神经节中，将其固定在CBC与BN3之间可能更为方便。
  20. 在靠近前室一侧的口部神经节鞘上添加一根额外的固定针，以最大限度减少口部神经节的移动。
  21. 使用精细镊子夹住靠近后室一侧覆盖口神经节的鞘膜，然后用精细剪刀剪去多余的鞘膜，注意不要暴露细胞体。为尽量减少损伤，仅去除观察细胞体所必需的最少部分鞘膜即可。
  22. 在修剪掉口神经节的鞘膜后，将I2神经和RNs拉过口神经节上方，并固定在口神经节与前室之间，以进一步旋转口神经节。（参见 图2).
  23. 洗去残留的氯化镁8 用于在解剖前麻醉动物的，替换 Aplysia 培养皿中的盐水更换为新鲜的 Aplysia 生理盐水

5. 电连接钩状电极

  1. 神经节和肌肉制备完成后，小心将培养皿转移至隔振台上进行实验。
  2. 将所有电极针连接到与放大器（A-M Systems model 1700 放大器）相连的 BNC 电缆插座上。操作时再次确保电极未被过度拉紧。确认电极已正确连接至相应的电缆，并确保极性正确。

6. 为胞体记录设置细胞外玻璃电极

  1. 用填充电极 Aplysia 生理盐水，使用连接在长约15–20 cm聚乙烯导管上的注射器。将聚乙烯导管的游离端连接至玻璃电极末端。回拉注射器活塞，使电极内部充满 Aplysia 生理盐水
  2. 将装满细胞外液的玻璃电极放入操纵器电极夹的凹槽中。使用操纵器将电极尖端置入 Aplysia 含有口神经节的生理盐水
  3. 将一根焊接在公头金质连接针上的银/氯化银导线插入电极中，作为记录导线。将另一根焊接在公头金质连接针上的银/氯化银导线直接放入 Aplysia 在容纳口部神经节的记录培养皿区域中加入生理盐水，作为参考电极。将记录电极和参考电极均连接至连接放大器的BNC电缆。
  4. 如果有足够的空间容纳更多操作器，可添加额外的细胞外玻璃电极，以同时记录多个神经元。

7. 为神经记录设置吸引电极

  1. 修剪吸电极尖端的窄端，使其直径与神经的直径相匹配。电极尖端的内径应与神经直径相近或略小，以确保形成紧密的负压吸附。
  2. 由于I2神经与RN彼此非常接近，可使用同一操纵器固定其电极以节省空间。将两根电极分别置于同一支架的两个凹槽内，旋转电极并确保其尖端相互靠近。选择其中一根用于I2神经记录，另一根用于RN记录。
  3. 将电极尖端放入 Aplysia 记录皿中含有布氏神经节的生理盐水。将连接在注射器上的聚乙烯导管游离端接到吸吮电极上。使用注射器将电极内充满生理盐水 Aplysia 生理盐水。将电极尖端移至目标神经末端附近， 即 I2神经，并用注射器将神经吸入电极内。电极内神经的长度应约为0.5–1.0 mm，以确保形成紧密封接。
  4. 重复对将要连接到RN的电极进行抽吸。
  5. 按照第6.3节所述，将电极连接到相应的BNC电缆。

8. 设置力传感器以测量 I1/I3 肌肉收缩

  1. 使用丝线将力传感器连接到肌肉上。将每根缝合线的弯针部分弯曲，并将缝合线系在力传感器上。用镊子轻轻夹起并提起少量肌肉，同时用另一把镊子夹住针头，将针插入肌肉，直至针的弯曲处（图1）。
  2. 传感器可安装在I1/I3肌肉的背侧或侧方。背侧安装可测量由肌肉左侧或右侧激活所引发的收缩。侧方安装对大多数神经元可显示更强的力，但仅能测量传感器所安装一侧的收缩。
  3. 为帮助识别可能激活I1/I3肌肉前部、后部或两部分区域的神经元，可在肌肉后部（紧邻咽部组织前方）安装一个力传感器，并在肌肉前部（位于颚部）安装另一个力传感器（图1；注意钩状结构）。
  4. 将力传感器轻轻上提，直至缝合线拉直，但不可过度拉伸。为确认张力适当，可先观察缝合线松弛时力传感器的读数，然后上提传感器，使其读数略高于该基线水平。

9. 在运动神经元池中鉴定运动神经元

  1. 本方案描述了一种在运动神经元池内通过细胞外记录识别运动神经元的方法。我们使用 AxoGraph 软件监测单个神经元、多条神经以及肌肉的活动（肌电图信号或肌肉收缩力）。在本方案中，我们以肌肉的收缩力为例，说明识别运动神经元的过程；在其他实验中，我们也使用了肌电图（EMG），此类实验的装置设置与此非常相似（见讨论部分）。
  2. 为定位目标神经元，使用操纵器将细胞外玻璃电极的尖端轻柔下压至神经元胞体中心上方的鞘膜处5 (图3），这是刺激和记录选择性的最佳位置5由于激活神经元的阈值电流随电极与胞体距离的增加而线性增大5当电极从目标神经元的中心移向邻近神经元时，刺激的选择性会变差。
  3. 为鉴定运动神经元，首先使用细胞外玻璃电极直接刺激该神经元，以确保仅有此神经元产生放电，并检测其是否支配肌肉。随后，对该神经元进行细胞外记录，建立胞体外记录与神经记录之间的一一对应关系，这对于神经元鉴定同样至关重要。
  4. 由于大多数胞外放大器不允许在同一通道中同时进行刺激和记录，因此将用于刺激和记录胞体的通道（胞体通道）设置为刺激模式，并施加短暂的阳极电流（例如 6 毫秒用于 Aplysia 神经元5) 至胞体（图4A、5A；注意两图中的箭头1），从低电流开始（例如 200 μA），并逐渐增加电流直至神经元产生簇状放电。
  5. 一旦神经元被激活进入爆发状态，应立即把胞体通道从刺激模式切换到记录模式（图4A、5A；注意两幅图中的箭头2）。然而，由于人为反应延迟，胞体刺激与记录之间仍会存在时间延迟。
  6. 如果神经元持续放电一段合理的时间，则应能够从胞体记录以及该神经元投射所经的神经（或神经干）上观察到一一对应的动作电位图4B、图5B；注意虚线）以及神经元产生的力（图4A、5A；注意蓝色框）。如果神经元在胞体记录开始前停止放电，请增加电流以使其持续激活更长时间。
  7. 细胞外记录的信噪比取决于电极位置和胞体大小。随着胞体增大以及电极与胞体之间距离减小，细胞外记录信号会增强。由于噪声水平仅在较小范围内波动，因此当胞体增大且电极与胞体距离减小时，信噪比也会相应提高。信噪比最常见的范围为4:1至8:1。
  8. 运动神经元可根据其特征进行鉴定，例如胞体位置、神经投射和支配的肌肉4,6,7由于仅有两条BN2与口器团块相连，通过监测BN2上的电活动，可确保肌肉收缩力仅由细胞外刺激激活的神经元引起。
  9. 例如，B3 是 I1/I3 肌肉的一个大型运动神经元（在体重为 200 至 350 克的动物中，胞体直径为 300–400 μm），位于口部神经节的头侧图3）。它仅通过同侧的BN2投射，并支配I1/I3肌的前部和后部。大多数情况下，激活该神经会产生大于后部的前部收缩力（9次实验中有8次如此）。
  10. 在识别出神经元后，可通过细胞外玻璃电极记录其在不同类似摄食行为中的活动图4 和 5），可按以下所述方法引出。与包含多种不同神经元活动的神经记录相比，胞体上的细胞外记录将具有更高的特异性。
  11. 为诱导类似排遗的运动程序，使用持续1-2分钟的脉冲刺激BN2-a19 （2 Hz，每个脉冲持续1毫秒）。在此条件下，该刺激可稳定诱导产生排出性运动模式。当电流足够时（例如 300 μA）时，这些模式可能会持续整个刺激过程。有时在刺激结束后不久还会出现一个额外的模式。
  12. 为诱导类似摄食的运动程序，将少量固体卡巴胆碱晶体直接置于脑神经节的鞘膜上15. 如果需要控制卡巴胆碱的暴露浓度，可使用含有1至10 mM卡巴胆碱的溶液 Aplysia 生理盐水。较高浓度更易诱导反应。重复性模式通常在五分钟内开始，持续约十到十五分钟后逐渐减弱。
  13. 多次洗去卡巴胆碱并等待至少30分钟后，可再次向脑神经节施加卡巴胆碱，以诱导产生更多类似摄食的运动模式。
  14. 在特定运动池的多个运动神经元于运动程序期间被识别和表征后，可开发出一种极大简化的诊断方法，该方法仅需最少的信息即可在后续工作中快速鉴定这些神经元。图6), 例如 在悬浮的口器团制备物中或 体内标准可能包括胞体大小和位置、神经投射、神经上的单位放电大小，以及在运动模式中放电活动的时间特征。

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结果

图4 和 图5 展示了用于鉴定两个 I1/I3 运动神经元的典型结果。图4 显示了一个大型运动神经元 B3 在类似排出和类似摄取模式期间的胞体记录（图4C、4D）。胞体通道与同侧 BN2 通道上一一对应的尖峰放电（图4E）表明，在模式过程中，B3 胞体记录的特异性得以保持。B3 在模式的中期至晚期缩回阶段放电。根据 图4 及其他结果（未展示），我们发现 B3 的 BN2 单位始终是最大的 BN2 单位。因此，它也可以直接从 BN2 记录中检测到。

图5展示了小神经元B43在类似排出和类似摄取模式期间的胞体记录（图5C、5D）。胞体通道与同侧BN2通道上一一对应的峰电位（图5E）也表明，在模式过程中，B43胞体记录的特异性得以保持。神经元B43在模式的回缩相末期产生簇状放电。由于B4...

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讨论

在具有大型可识别神经元的动物中（例如软体动物，如Lymnaea、Helix和Aplysia），通常采用细胞内记录技术来分析运动神经元群1,2,3,4。在本实验方案中，我们描述了一种利用细胞外记录技术对运动神经元群中的运动神经元进行唯一性鉴定的方法。我们以力测量作为该方法的示例，也可使用肌电图（EMG）来检测肌肉的神经支配。简而言之，若采用EMG方法，需对本方案进行调整，将钩状电极连接至I1/I3肌肉的不同区域以进行肌电图记录。

细胞外记录技术相较于细胞内记录技术具有一些优势，其中部分优势前文已有所描述。首先，细胞外记录技术在准备神经节进行实验时所需的时间和精力更少，并且对神经元的损伤也更小。通常，为细胞外实验准备口部神经节需要20-30分钟，而为细胞内实验准备附着于口器肌肉组织上的口部神经节则大约需要1.5小时。由于肌肉的活性会随着时间推移而逐渐降低，因此细胞外与细胞内实验在神经节制备时间上的差异可能对实验的成功至关重要。图7展示了在张力研究中，使用细胞外或细胞内技术识别I...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS047073 和美国国家科学基金会（NSF）基金项目 DMS1010434 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠Fisher ScientificS671生物级，已认证
氯化钾Fisher ScientificP217符合ACS标准
六水合氯化镁Acros Organics1975399%
七水合硫酸镁Fisher ScientificM63符合ACS标准
二水合氯化钙Fisher ScientificC79符合ACS标准
葡萄糖（右旋糖）Sigma-AldrichG7528BioXtra
MOPS缓冲液Acros Organics1726399%
卡巴胆碱Acros Organics1082499%
氢氧化钠Fisher ScientificSS255已认证
盐酸Fisher ScientificSA49已认证
单通道毛细玻璃管A-M Systems6150
Flaming-Brown 微量移液器拉制仪 P-80/PC 型号Sutter Instruments使用灯丝：FT345B
漆包不锈钢丝California Fine Wire0.001D，涂层 h
家用 Silicone II 胶水GE
Duro Quick-Gel 超强胶Henkel corp.
A-M Systems 1700 型放大器A-M Systems滤波设置：I2 神经/肌肉为 10–500 Hz；其余所有神经为 300–500 Hz
Pulsemaster 多通道刺激器World Precision InstrumentsA300
刺激隔离器World Precision InstrumentsA360
AxoGraph XAxoGraph Scientific记录用软件
金质连接插针BulginSA3148/1
金质连接插座BulginSA3149/1
Sylgard 184 硅橡胶弹性体Dow Corning
100 × 15 mm 结晶皿Pyrex
高真空润滑脂Dow Corning
移液器吸头Fisher Scientific21-375D
显微固定针（Minutien Pins）Fine Science Tools26002-10
模型黏土Sargent Art22-4400
Whisper 气泵Tetra77849
水族馆用软管Eheim778312/16 mm
Elite 气石HagenA962
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15000-08
Dumont #5 精细镊子Fine Science Tools11254-20
Kimwipes 纸巾Kimberly-Clark34155

参考文献

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
  3. Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
  4. Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
  5. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
  6. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
  8. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).
  9. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791(2010).
  10. Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
  11. Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
  12. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
  13. Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
  14. Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  15. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
  16. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
  17. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
  18. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
  19. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
  20. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  21. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
  22. Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
  23. Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
  24. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
  25. Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
  26. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
  27. Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
  28. Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
  29. Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
  30. Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).

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在 Aplysia californica 中通过细胞外记录识别特定肌肉运动池的运动神经元
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