在 Aplysia californica 中通过细胞外记录识别特定肌肉运动池的运动神经元

摘要

在具有大型可识别神经元的动物中例如 软体动物）的运动池分析采用细胞内记录技术进行^1,2,3,4最近，我们开发了一种在细胞外刺激并记录单个神经元的技术 Aplysia californica⁵我们现描述一种利用该技术对运动池内运动神经元进行特异性鉴定与表征的实验方案。

摘要

在具有大型已鉴定神经元的动物中例如 软体动物），运动神经元池的分析采用细胞内记录技术进行^1,2,3,4最近，我们开发了一种在细胞外刺激并记录单个神经元的技术 Aplysia californica⁵我们现描述一种利用该技术对运动池内运动神经元进行特异性鉴定与表征的实验方案。

这种细胞外技术具有多项优势。首先，细胞外电极能够透过鞘膜刺激并记录神经元⁵，因此无需去除鞘膜。因此，在细胞外实验中神经元的状态比在细胞内实验中更为健康。其次，若通过适当固定鞘膜使神经节旋转，则细胞外电极可接触神经节两侧的神经元，从而在同一制备样本中更简便、高效地识别多个神经元。第三，细胞外电极无需穿入细胞，因此可在不同神经元之间轻松移动，对神经元造成的损伤更小。当需要在持续时间仅数分钟的重复运动模式期间记录多个神经元时，这一特点尤为有用。第四，细胞外电极在肌肉运动过程中比细胞内电极更具灵活性。细胞内电极可能在肌肉收缩时被拉出，从而损伤神经元；而细胞外电极仅轻柔地压在神经元上方的鞘膜上，通常能在肌肉收缩期间保持在同一个神经元上方，因此可用于结构更完整的制备样本。

为了使用细胞外电极唯一鉴定运动神经元池（特别是Aplysia中的I1/I3肌肉）中的运动神经元，可采用无需细胞内记录即可获取的特征作为鉴定标准：胞体大小和位置、轴突投射路径以及肌肉支配方式^4,6,7。针对本技术示例所用的特定运动神经元池，我们通过记录口神经2和3的信号来测定轴突投射，同时测量I1/I3肌肉的收缩力，以确定各个运动神经元对肌肉的支配模式。

我们展示了首先利用肌肉神经支配来鉴定运动神经元，然后表征其在运动模式中的放电时序，进而建立一种简化的快速鉴定方法的完整过程。这种简化且更快速的诊断方法更适用于结构更完整的标本，例如悬吊式口器团块标本⁸或在体⁹实验。该方法也可应用于Aplysia的其他运动神经元群^10,11,12，或其他动物系统中的运动神经元群^2,3,13,14。

方案

1. 记录皿的准备

1. 在力传感器实验过程中，将口部神经节、脑神经节和口球肌肉组织置于一种专为力学研究设计的圆形派热克斯（Pyrex）培养皿中。
2. 为了在实验中诱导出类似摄食的行为模式，需要将不可水解的胆碱能激动剂卡巴胆碱（carbachol）施加于脑神经节¹⁵。为避免卡巴胆碱直接接触口部神经节和口球肌肉组织，必须使用独立的隔室，将脑神经节与口部神经节及口球肌肉组织分离开来（图1）。
3. 由于口球肌肉组织比口部神经节厚得多，二者无法放置在同一水平面上。因此，该培养皿应设有后部隔室用于放置脑神经节（图1中的区域A）、中部平台用于放置口部神经节（图1中的区域C），以及更深的前部腔室用于容纳口球肌肉组织（图1中的区域D）。
4. 制作该培养皿时，首先准备一个圆形的100×15 mm派热克斯培养皿（高15 mm，直径100 mm）。培养皿的构建需分多次浇注Sylgard硅胶。请遵循Sylgard产品附带的使用说明，并确保每次浇注之间留有足够时间使Sylgard充分固化。
5. 第一次浇注用于在培养皿中形成最高处的Sylgard结构（图1中的区域B），即中部平台与后部隔室之间的隔墙。
6. 使用两块造型黏土作为模具，界定出Sylgard隔墙的浇注区域（

结果

图4 和 图5 展示了用于鉴定两个 I1/I3 运动神经元的典型结果。图4 显示了一个大型运动神经元 B3 在类似排出和类似摄取模式期间的胞体记录（图4C、4D）。胞体通道与同侧 BN2 通道上一一对应的尖峰放电（图4E）表明，在模式过程中，B3 胞体记录的特异性得以保持。B3 在模式的中期至晚期缩回阶段放电。根据 图4 及其他结果（未展示），我们发现 B3 的 BN2 单位始终是最大的 BN2 单位。因此，它也可以直接从 BN2 记录中检测到。

图5展示了小神经元B43在类似排出和类似摄取模式期间的胞体记录（图5C、5D）。胞体通道与同侧BN2通道上一一对应的峰电位（图5E）也表明，在模式过程中，B43胞体记录的特异性得以保持。神经元B43在模式的回缩相末期产生簇状放电。由于B4.......

讨论

在具有大型可识别神经元的动物中（例如软体动物，如Lymnaea、Helix和Aplysia），通常采用细胞内记录技术来分析运动神经元群^1,2,3,4。在本实验方案中，我们描述了一种利用细胞外记录技术对运动神经元群中的运动神经元进行唯一性鉴定的方法。我们以力测量作为该方法的示例，也可使用肌电图（EMG）来检测肌肉的神经支配。简而言之，若采用EMG方法，需对本方案进行调整，将钩状电极连接至I1/I3肌肉的不同区域以进行肌电图记录。

细胞外记录技术相较于细胞内记录技术具有一些优势，其中部分优势前文已有所描述。首先，细胞外记录技术在准备神经节进行实验时所需的时间和精力更少，并且对神经元的损伤也更小。通常，为细胞外实验准备口部神经节需要20-30分钟，而为细胞内实验准备附着于口器肌肉组织上的口部神经节则大约需要1.5小时。由于肌肉的活性会随着时间推移而逐渐降低，因此细胞外与细胞内实验在神经节制备时间上的差异可能对实验的成功至关重要。图7展示了在张力研究中，使用细胞外或细胞内技术识别I.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Fisher Scientific	S671	生物级，已认证
氯化钾	Fisher Scientific	P217	符合ACS标准
六水合氯化镁	Acros Organics	19753	99%
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	M63	符合ACS标准
二水合氯化钙	Fisher Scientific	C79	符合ACS标准
葡萄糖（右旋糖）	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
MOPS缓冲液	Acros Organics	17263	99%
卡巴胆碱	Acros Organics	10824	99%
氢氧化钠	Fisher Scientific	SS255	已认证
盐酸	Fisher Scientific	SA49	已认证
单通道毛细玻璃管	A-M Systems	6150
Flaming-Brown 微量移液器拉制仪 P-80/PC 型号	Sutter Instruments		使用灯丝：FT345B
漆包不锈钢丝	California Fine Wire		0.001D，涂层 h
家用 Silicone II 胶水	GE
Duro Quick-Gel 超强胶	Henkel corp.
A-M Systems 1700 型放大器	A-M Systems		滤波设置：I2 神经/肌肉为 10–500 Hz；其余所有神经为 300–500 Hz
Pulsemaster 多通道刺激器	World Precision Instruments	A300
刺激隔离器	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific		记录用软件
金质连接插针	Bulgin	SA3148/1
金质连接插座	Bulgin	SA3149/1
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	Dow Corning
100 × 15 mm 结晶皿	Pyrex
高真空润滑脂	Dow Corning
移液器吸头	Fisher Scientific	21-375D
显微固定针（Minutien Pins）	Fine Science Tools	26002-10
模型黏土	Sargent Art	22-4400
Whisper 气泵	Tetra	77849
水族馆用软管	Eheim	7783	12/16 mm
Elite 气石	Hagen	A962
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
Kimwipes 纸巾	Kimberly-Clark	34155