可遗传编码的光遗传学工具能够非侵入性地操控特定神经元 果蝇 大脑。此类工具能够识别出其激活足以引发或抑制特定行为的神经元。本文介绍了一种方法，用于激活在自由行走的果蝇中特定神经元表达的通道视紫红质2（Channelrhodopsin2）。
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摘要
摘要
越来越多的基因编码工具正在被开发出来，可用于非侵入性地操控Drosophila melanogaster1中特定神经元的神经活动。其中最重要的是光遗传学工具，这类工具能够利用强光激活或抑制完整且自由活动动物体内特定神经元的活动。通道视紫红质（Channelrhodopsin, ChR2）是一种光激活的阳离子通道，当被蓝光激活时，会引起表达该通道的神经元发生去极化。ChR2已被成功用于鉴定在特定行为中起关键作用的神经元，例如对CO2的回避反应、喙伸展行为以及由巨大纤维介导的惊吓反应2-4。然而，由于刺激ChR2所用的高强度光源同时也会激活感光细胞，因此这些光遗传学技术此前并未应用于视觉系统。本文中，我们将光遗传学方法与一种破坏光转导功能的突变相结合，证明了激活果蝇视叶中一群对逼近刺激敏感的神经元（即Foma-1神经元），足以引发用于躲避碰撞的逃逸行为。我们使用了norpA基因所编码的光转导级联关键组分——磷脂酶C-β（phospholipase C-β）的一个无效等位基因，使果蝇丧失视觉功能；同时利用Gal4-UAS转录激活系统驱动ChR2在Foma-1神经元中的特异性表达。将单只果蝇置于被蓝色LED环绕的小平台之上。当LED点亮时，果蝇会迅速起飞进入飞行状态，其行为模式类似于由视觉触发的逼近逃逸反应。我们认为，该技术可轻松拓展应用于研究自由活动果蝇的其他行为。
引言
目前已开发出一系列日益丰富的可遗传编码工具，用于操控Drosophila melanogaster1中特定细胞的神经活动。这些工具能够在完整且自由活动的动物体内，非侵入性地激活或沉默特定神经元。其中，通道视紫红质2（Channelrhodopsin2，ChR2）是一种光激活的阳离子通道，具有显著优势，因其可实现时间上的精确控制并快速诱导效应。当表达ChR2的神经元暴露于强蓝光（470 nm）时，会迅速发生去极化并表现出升高的放电频率3-5。在自由活动的动物中对特定神经元进行靶向激活，已证明某些神经元足以介导诸如CO2回避3、喙伸展2,4以及巨纤维介导的惊跳反应4等行为。然而，由于刺激ChR2所需的强光光源同时会激活感光细胞，光遗传学技术在视觉系统中的应用受到限制。通过将光遗传学方法与一种破坏光转导功能的突变相结合，我们已证明激活果蝇视叶中某一特定神经元簇可驱动用于避免碰撞的逃逸行为6。
大多数（如果不是全部）具有视觉的动物都会表现出逃避行为，以避免与迎面而来的物体发生碰撞。当行走或静止的果蝇面临逼近的碰撞威胁时，会迅速起飞并逃离碰撞方向7-9。这类起飞行为的特征是在起飞前翅膀抬起，并伴随不稳定的飞行轨迹10,11。这种反应不同于由巨纤维介导的惊吓反应——后者表现为跳跃，起飞前无翅膀抬起动作，通常导致自由落体式的翻滚4,9。我们已鉴定出视叶中一类特异性的对逼近刺激敏感的神经元簇——Foma-1神经元，这类神经元专门编码接近中的物体。在此基础上，我们旨在探究Foma-1神经元在果蝇对逼近刺激产生逃逸行为中的作用。本文展示了如何利用光遗传学技术选择性激活这些神经元，从而诱发果蝇的逃逸行为。
我们利用Gal4-UAS转录激活系统驱动ChR2在Foma-1神经元中的表达。ChR2需要辅因子全反式视黄醛，而该物质在黑腹果蝇（Drosophila）中枢神经系统中的含量较低，因此必须通过饮食补充3,4。由于激活ChR2需使用强光，而果蝇本身具有强烈的趋光行为12，因此我们希望排除视觉系统对刺激产生反应的可能性。为此，我们采用了norpA基因无义等位基因的纯合突变体果蝇，该基因编码光传导级联反应中的关键组分——磷脂酶C-β。这类突变体果蝇的感光细胞无法对光刺激产生响应13。为了检测逃逸反应的光遗传学刺激效果，我们需要将单只果蝇隔离并暴露于强蓝光下。为此，我们将单只果蝇放入移液器吸头中。将一个吸头置于特制的支架上，使果蝇因向地性沿吸头向上爬行并进入一个矩形平台。果蝇可在该平台顶部自由活动。平台四周设有四组蓝色LED阵列，每组包含3个LED，均聚焦于平台顶部。当果蝇进入平台后，开启LED光源，并使用高速相机记录果蝇的行为反应6。
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方案
1. 生成通道视紫红质果蝇
- 将 UAS-ChR2 果蝇与选定的 Gal4 驱动系杂交，我们使用 G105-Gal4，其在视叶的 Foma-1 神经元中表达。
- 为了排除对蓝光刺激产生视觉反应的可能性，两个果蝇品系均处于 w+norpA 背景中。
- 最终结果：w+norpA;G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- 成虫羽化后，将选中的雌蝇置于添加了 10 μM 全反式视黄醛（ChR2 所需的辅因子）的新鲜培养基中，并避光饲养 3 天，然后进行行为学检测。
2. 制备10 μM 全反式视黄醛增强食物
- 将 100 mg 全反式视黄醛溶于 17.6 ml 95% 乙醇中，配制成 20 mM 视黄醛溶液。全反式视黄醛需始终避光保存。
- 将标准玉米粉果蝇培养基在微波炉中融化，冷却至触摸温热。
- 取 50 μl 20 mM 全反式视黄醛加入含 10 ml 果蝇培养基的试剂瓶中，充分混匀。
- 让试剂瓶冷却，并避光保存。
3. 仪器设备
- 移液器吸头：将标准的1,000 μl移液器吸头在尖端附近剪断，形成直径约为2.25 mm的孔径。
- 平台（见图1）。
- 采用Delrin材料制作一个17 cm × 25 cm的底座，底座每个角落设有螺纹孔，用于安装¼" NPT冷却管接头。
- 一个由Delrin材料制成的垂直支架固定在底座中央，整体尺寸为25 mm × 40 mm × 65 mm（宽×深×高）。支架沿长度方向设有一条宽10 mm的凹槽，底部配有拇指螺丝。支架顶部连接一个平台，尺寸为25 mm × 40 mm × 10 mm，其上有一个直径为3.5 mm的孔，与支架上的凹槽对齐。
- LED阵列（见图1）。
- 使用冷却管接头将四段长约18 cm的冷却管固定在平台底座上。冷却管仅作为结构支撑，不用于冷却目的。
- 在每个支臂末端的冷却管部分切割出适当间距的凹槽，用于将散热片固定在各支臂末端。
- 使用预切好的导热胶带将蓝色LED Rebel Tri-Stars安装在每个散热片上。每个Tri-Star上安装一个Carclo 18°三透镜。
- LED Tri-Stars按要求连接至BuckPuck直流驱动器和电源。我们的装置中，每个BuckPuck以串联方式驱动两个Tri-Stars。
- 四个LED Tri-Stars在700 mA电流下同时照明时，平台上的辐照度达到713 W/m2。
- 相机：将相机安装在一个小型三脚架上，并对准平台顶部进行聚焦。
4. 行为学实验
- 将果蝇短暂置于冰上进行麻醉。
- 将单只果蝇放入移液器吸头中，并用胶带封闭吸头两端。
- 待果蝇苏醒并开始在吸头内活跃探索后，移除胶带，将吸头放入垂直支架的凹槽中。使用拇指螺丝固定吸头，并封闭吸头底部。
- 当果蝇在吸头内探索时（通常为 30 - 60 秒），在果蝇即将从吸头爬出至平台前，启动摄像机开始记录。
- 果蝇爬上平台后，等待 1-2 秒，打开蓝色 LED 灯。使用计时器手动记录从开灯至果蝇启动飞行之间的时间。
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结果
仅表达ChR2或仅表达G105驱动子的盲果蝇在受到强蓝光照射后起飞率较低。无论是否接受光照，盲果蝇的起飞率均无差异（图2），表明这些起飞行为是自发产生的，而非由蓝光照射引起。然而，当ChR2在Foma1神经元中表达时，蓝光照射会引发逃避反应。超过50%的测试果蝇在光照后1秒内起飞，75%在5秒内起飞（图2）。相比之下，对照组果蝇中仅有10%在1秒内起飞，20%在5秒内起飞。由于G105驱动子不仅在Foma-1神经元中表达，也在蘑菇体的γ叶中表达，因此我们使用了一个特异性在蘑菇体该区域表达的驱动子（201Y-Gal4）作为额外对照。这些果蝇的起飞率与其他对照组相似（图2），表明逃避反应特异性地由Foma-1神经元的光遗传学激活所引发。
以每秒200帧的速度进行高速成像，记录光遗传学诱导的反应，结果显示这些反应与由逼近刺激引发的逃逸行为相似（图3）。具体而言，在被拍摄的果蝇中，有90%在起飞前抬起了翅膀（n = 30）6。此外，随...
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讨论
我们通过将自由行走的果蝇暴露于明亮的蓝光中，实现了对逃逸行为的光遗传学刺激。该方法可轻松适用于研究自由行走果蝇的其他行为，并可通过简单地将所用LED阵列在更大区域上进行拼接，从而扩展至更大的平台。用户可使用本文所述的低成本相机或其他可用的相机系统，根据目标行为的需求，灵活调整所采集图像的帧率和空间分辨率。此外，我们的成像仅限于LED点亮之后的时间段，因为蓝光LED既用于激活ChR2，同时也为相机提供照明。这对我们的行为研究已足够，但如果需要记录LED点亮前果蝇的位置或运动，则可引入提供红外光信号的额外光源，并结合相机的适当滤光装置来实现。
光遗传学被广泛誉为一种非侵入性调控神经活动的方法。然而，由于激活ChR2所用的光也会同时激活视觉通路，该技术在视觉系统中的应用受到很大限制。此外，果蝇对强光的趋光反应也可能干扰利用光遗传学研究非视觉行为。使用视觉失明的norpA果蝇，可使我们能够在视觉系统中应用光遗传学工具，同时避免趋光行为对其他行为的干扰。
本实验方案要求在目标神经元中表达 ChR2，果蝇需饲喂全反式视黄醛，并暴露于强...
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致谢
本工作由斯坦福大学院长奖学金（SEJdV）、美国国立卫生研究院院长先锋奖（TRC DP0035350）、麦克奈特基金会学者奖（TRC）和 R01 EY022638（TRC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 全反式视黄醛 | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| 设备 | |||
| 9.2 C/W 散热片 | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm 方形 × 30 mm 高 |
| Carclo 18 ° 三透镜 | Luxeonstar | 10507 | |
| Tri-Star 基座上的 Blue Rebel LED | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm，700 mA 时为 174 lm |
| 700 mA 降压恒流驱动器（BuckPuck DC Driver） | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| BuckPuck 驱动器线束 | Luxeonstar | 3021-HE | |
| 预裁切导热胶带 | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm 六角基座 |
| Snap-Loc 冷却液软管，¼" 内径 | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc 冷却液软管接头 | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT 外螺纹 |
| 实验室级开关模式可编程直流电源 | BK Precision | 1698 | |
| Exilim 相机 | Casio | EX-FH20 |
参考文献
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重印与许可
