细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

摘要

总细胞RNA作为研究RNA合成与降解的短期变化以及RNA加工动力学的模板效果较差。本文介绍了一种利用4-硫代尿苷对新转录RNA进行代谢标记，随后通过巯基特异性生物素化并纯化新转录RNA的方法，从而克服上述局限性。

摘要

全基因组转录组微阵列与下一代测序技术的发展极大地革新了我们对细胞基因表达复杂性的理解。随着对相关分子机制的认识不断深入，精确测量其基础动力学参数的重要性也日益凸显。然而，这些强大方法在应用中因所研究模板样本的固有特性而面临重大局限性。 即 总细胞RNA。在许多情况下，总细胞RNA的变化发生得过慢或过快，难以以足够的分辨率反映潜在的分子事件及其动力学过程。此外，RNA合成、加工和降解变化的各自贡献也难以明确区分。

我们近期开发了高分辨率基因表达谱分析技术，以克服这些局限性。该方法基于利用4-硫代尿苷（4-thiouridine）对新转录的RNA进行代谢标记（因此也称为4sU标记），随后通过硫醇特异性生物素化及链霉亲和素包被的磁珠严格纯化新转录的RNA。该技术适用于多种生物体，包括脊椎动物、Drosophila和酵母。我们已成功应用4sU标记技术研究转录因子活性的实时动力学，精确测定RNA的半衰期，并深入揭示RNA加工过程的动力学特征。最后，还可结合计算建模，对潜在的分子机制进行系统性、综合性的分析。

引言

基因表达谱分析是研究细胞过程及其相关复杂相互作用网络的关键工具。对mRNA丰度的研究通常是获得潜在分子机制基本认识的首选方法。全转录组微阵列技术¹的发展，以及近期RNA高通量测序（RNA-seq）^2-4的应用，推动了这一研究策略的广泛应用。尽管这些技术极大地深化了我们对细胞基因表达复杂性的理解，但由于其模板样本——即总细胞RNA——固有的特性，这些方法仍存在重大局限性。例如，总RNA水平的短期变化并不能反映转录速率的变化，而是本质上依赖于相应转录本的RNA半衰期。一个短寿命转录本（例如编码转录因子的mRNA）即使被五倍诱导，也能在1小时内于总RNA中明显检测到；而相同倍数诱导的长寿命转录本（例如编码代谢酶的mRNA）则几乎无法察觉。此外，即使某个中等半衰期为5小时的基因其转录速率完全关闭（>1,000倍下调），其总RNA水平也需要5小时才能下降两倍。因此，总RNA分析更有利于检测短寿命转录本的上调，而许多这类转录本编码的是转录因子和具有调控功能的基因⁵。此外，真实的调控动力学级联过程被掩盖，无法区分初级信号事件与次级响应事件。这两点都可能导致下游生物信息学分析产生显著偏差。第二，总RNA水平的变化无法归因于RNA合成或降解的改变。对后者的测量需要侵入性细胞实验方法，例如使用放线菌素D阻断转录⁶，并长时间监测RNA持续降解的过程。由于哺乳动物细胞中mRNA的平均半衰期为5–1....

方案

1. 使用4-硫代尿苷进行代谢标记

制定详细的实验设置/时间安排计划，例如何时向细胞培养物中添加4sU，以及何时收集样品。每种处理条件之间至少预留5分钟。每次仅处理一种条件的细胞。每次操作最多处理3至5个培养皿。尽可能快速地操作细胞，以尽量减少温度和CO₂水平的变化。在加入4sU后，避免将细胞暴露于强光下，因为这可能导致4sU标记的RNA与细胞内蛋白质发生交联。

标记开始

1. 使用前将4-硫代尿苷（4sU）解冻，并将各实验条件下所需的4sU体积移取至无菌Falcon管中。
2. 从培养皿中取出所需体积的细胞培养基（每10 cm培养皿5 ml），加入含4sU的Falcon管中，充分混匀；随后移除并弃去培养皿中剩余的培养基。
3. 将含4sU的培养基重新加入培养皿中。

标记结束

4. 从细胞中移除细胞培养基。向每块培养板中加入 5 ml Trizol。对于包含多个时间点或条件的复杂实验，此步骤最好由两人协作完成：一人负责移除培养基，另一人负责添加 Trizol 并收集裂解液。
5. 室温孵育 5 分钟，以确保细胞完全裂解。
6. 使用 10 ml 移液管用已加入的 Trizol 轻柔冲洗培养板。此操作有助于实现完....

结果

1. 起始材料及预期产量

经过1小时（hr）4sU暴露后，新转录的RNA约占总细胞RNA的1%–4%。在生长停滞的细胞中，该比例会更低，因为这些细胞不再合成用于细胞生长/复制的RNA。当标记时长为1小时时，我们建议从60– 80 μg 总RNA。起始材料少于 30 μg 总RNA的提取会导致在生物素标记步骤后产生难以观察的小RNA沉淀，因此容易丢失。输入RNA的量可增加至最多 150 μg 对于极短时间的标记（例如 5 - 10 分钟）。当RNA标记时间从1小时缩短至5分钟时，新转录RNA中短寿命的内含子序列所占比例从约60%增加至约80% ⁹由于内含子的长度显著长于编码序列以及5'-和3'-非翻译区（UTR），在进行短时间甚至超短时间（4sU标记）标记后所纯化的新生转录RNA的量并不会线性下降。因此，我们获得了 >非黏附性人 B 细胞系中经 5 分钟 4sU 标记后总 RNA 的 0.5% ⁹需要注意的是，贴壁细胞中要达到相似的4sU掺入率，可能需要更高的4sU浓度和稍长的标记时间。尽管较低的4sU掺入率仍足以有效捕.......

讨论

对新转录的RNA进行代谢标记显著增强了微阵列和RNA测序等高通量技术的分析能力，通过提供更合适的模板来解答特定的生物学问题。本实验方案经过了 extensive 优化，可实现新转录RNA超过>1,000倍的富集，并获得高度可重复的结果。

4sU标记实验的实验设计至关重要，因为新转录的RNA仅在细胞暴露于4sU期间反映实时的转录活性。如果刺激后转录速率的实际变化已经消退，那么即使总RNA水平的变化仍可被检测到，在分析新转录的RNA时仍会遗漏这些变化。因此，充分理解潜在的生物学过程对于确定实验设置以及4sU处理的最佳时间窗口非常重要。以下，我们针对最关键的步骤提供一些建议和避免常见陷阱的方法。

储备液与塑料器皿的准备

所有储备液必须使用无核酸酶的水配制。如果自制纯化的去离子水中含有还原剂，则可能引发问题。曾有案例因此导致所有标记的RNA完全丢失。因此，我们强烈建议购买预制成的无核酸酶NaCl、Tris-Cl、EDTA、柠檬酸钠和水。务必始终维持无核酸酶的操作环境。二甲基甲酰胺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-硫代尿苷	Carbosynth	T4509	配制50 mM的无菌H2O，于 -20 储存 °C，分装为50-500份 μ弃去未使用的试剂，切勿重新冷冻。
Trizol	Invitrogen	15596026（100 ml），15596018（200 ml）	<强>警告——具有腐蚀性，危害健康！ 确保立即获取苯酚解毒剂（PEG-甲醇）；4 ℃保存 °C.
氯仿	Sigma	372978	<强>警告——对健康有害
异丙醇	Sigma	650447
柠檬酸钠，无核酸酶	Sigma	C8532	使用无核酸酶水配制1.6 M的储存液。
5 M 无核酸酶 NaCl	Sigma	71386	储备液
无核酸酶水2O	Sigma	W4502	在无核酸酶的离心管中分装成每份1 ml。
RNA 沉淀缓冲液			1.2 M NaCl，0.8 M 柠檬酸钠溶于无核酸酶水中。需在严格无核酸酶条件下提前配制。置于50 ml Falcon管中，室温保存。
乙醇	Sigma	459844	使用无核酸酶水配制80%乙醇，并于-20℃保存 °C.
1 M 无核酸酶 Tris Cl，pH 7.5	Lonza	51237	储备液
500 mM 无核酸酶 EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575-020	储备液
10倍生物素标记缓冲液（BB）			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA 溶于无核酸酶水中，分装为每份 1 ml。
二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma	D4551
EZ-Link 生物素-HPDP	皮尔斯	21341	配制1 mg/ml储备液：将50 mg生物素-HPDP溶解于50 ml DMF中。轻微加热可促进溶解。4 ℃保存 °C，分装为每份1 ml。
Phase Lock Gel Heavy 管（2.0 ml）	Eppendorf	0032 005.152	氯仿抽提步骤的可选操作。
Zeta 膜	BIORAD	162-0153
10x 点印迹结合缓冲液			100 mM NaOH，10 mM EDTA
生物素-寡核苷酸			5'-生物素，25个核苷酸，任意序列
十二烷基硫酸钠	Fisher	BPE9738	对于100 ml 20%的储存液，将20 g SDS加入80 ml pH 7–8的PBS中，并调节体积至100 ml。所有高浓度SDS溶液均需保存在20℃以上 °C. 若SDS析出沉淀，可将溶液略微加热。
EZ-Link 碘乙酰基-LC-生物素	皮尔斯	21333	将50 mg碘乙酰基生物素溶于50 ml DMF中，配制成1 mg/ml的储存液。轻微加热可促进溶解。4 ℃保存。 °C，分装为每份1 ml。可产生不可逆的、特异性针对巯基的生物素标记。
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010-015
点印迹封闭缓冲液			将20 ml 20% SDS与20 ml 1×PBS（pH 7–8）混合，并加入EDTA至终浓度为1 mM。
链霉亲和素-辣根过氧化物酶	Vector Laboratories	SA5004	-20℃保存 °C. 将10 ml 20% SDS与10 ml 1 x PBS混合。加入20 μ使用前将链霉亲和素-HRP稀释。
ECL 试剂	GE Healthcare	RNP2109	按照制造商的说明使用。
Super RX，X-RA 胶片，18×24 厘米	富士胶片	47410 19236
μMacs 链霉亲和素试剂盒	Miltenyi	130-074-101	将珠子在 4 ℃ 下保存 °C.
Tween 20	Sigma	P1379
洗涤缓冲液			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20，溶于无核酸酶的H₂O中2O.
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	43817	将DTT配制成100 mM的无核酸酶水溶液2O，使用前务必新鲜配制。
RNeasy MinElute 试剂盒	Qiagen	74204	4℃下保存层析柱 °C，将试剂盒的其余组分置于室温下。
1.5 ml 螺口聚丙烯管	Sarstedt	72.692.005	与二甲基甲酰胺兼容
2.0 ml 螺口聚丙烯管	Sarstedt	72.694.005	与二甲基甲酰胺兼容
15 ml 离心管	BD Falcon	352096	与二甲基甲酰胺兼容
50 ml 离心管	BD Falcon	352070	与二甲基甲酰胺兼容
所有溶液/试剂均应室温保存，除非另有说明。
<强>仪器设备
紫外/可见分光光度计	赛默飞世尔科技	NanoDrop 1000	或同等体积。使用低体积（1-2 μl) 用于低浓度 RNA 的测量，以避免样品过度损失。
聚丙烯15 ml离心管	VWR International	525-0153	与标准的15 ml离心管相比，这些可耐受高达15,000 × g
高速离心机	贝克曼库尔特	Avanti J-25	或可达到13,000的同等设备×g
高速转子	贝克曼库尔特	JLA-16250	或能够达到13,000的同等设备×g
15 ml 离心管适配器	Laborgeräte Beranek	356964	或可达到13,000的同等设备×g
冷藏台式离心机	Eppendorf	5430 R	或同等产品。
恒温混匀仪	Eppendorf	Thermomixer compact	或同等物。
磁力架	Miltenyi Biotec	130-042-109	一个支架可容纳8个 μMacs 柱
水浴锅	资助	SUB Aqua 5	或同等物。
超精细尺度	A&研发	GR-202	或同等产品。
E-Gel iBase 电源系统	Invitrogen	G6400UK	用于RNA凝胶；或同等用途。
E-Gel EX 1% 琼脂糖预制凝胶	Invitrogen	G4020-01	用于RNA凝胶；或同等用途。