我们描述了利用活细胞视频显微镜观察巨噬细胞吞噬Candida albicans的方法。这些方法能够对巨噬细胞的迁移、识别、内吞及吞噬体成熟等不同阶段进行特异性分析，并揭示吞噬作用的新特征。
本文内容
摘要
摘要
真菌病原体以及更广泛的微生物的吞噬清除过程，可划分为四个不同的阶段：（i）吞噬细胞迁移至病原体所在部位；（ii）通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs）；（iii）吞噬细胞膜表面结合的微生物被内吞；（iv）在成熟中的吞噬体中处理被吞噬的细胞，并消化摄入的颗粒。全面评估吞噬作用的研究具有重要信息价值1, 2, 3, 4, 5，但其局限性在于通常未将该过程分解为迁移、内吞和吞噬体成熟等独立阶段，而这些阶段可能受到不同因素的影响。此外，此类研究将摄取视为单一事件，而非连续动态过程。我们近期开发了先进的活细胞成像技术，并将其与病原体和宿主细胞的遗传功能分析相结合，建立了一个跨学科平台，用于分析固有免疫细胞功能及真菌致病机制。这些研究揭示了吞噬作用的新特征，这些特征只有通过系统性的时间分辨分析人类吞噬细胞与真菌病原体以及其他感染性微生物之间的分子和细胞相互作用才能观察到。例如，我们已开始明确以下方面：（a）参与识别、内吞和杀伤真菌细胞过程各阶段所需的细胞表面组分1, 6, 7, 8；（b）细胞表面几何结构如何影响巨噬细胞对酵母细胞和菌丝细胞的摄取效率及杀伤能力7；以及（c）内吞作用如何导致巨噬细胞细胞周期和行为的改变9, 10。
与单时间点的静态图像相比，活细胞视频显微技术能够对多种宿主细胞和病原体在长时间内进行连续动态观察，从而获得有关细胞迁移、增殖以及囊泡运输等广泛动态过程的空间和时间信息。本文详细描述了宿主细胞与真菌细胞的制备方法，以及视频显微实验的操作步骤。这些方法可为今后利用其他吞噬细胞与微生物开展类似研究提供操作指南。
方案
1. C. albicans 的培养与培养条件
- 制备SC-Ura琼脂平板：称取6.9 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基，加入1 ml 1 M NaOH、10 ml 1% (w/v) 腺嘌呤半硫酸盐和20 g技术级琼脂（此前已有详细描述11）。用蒸馏H2O定容至900 ml。高压灭菌后，让琼脂冷却但尚未凝固，然后在无菌条件下加入50 ml无菌40% D-葡萄糖和50 ml无菌4% SC-Ura缺失培养基。混匀后倒入培养皿，静置使其冷却并凝固。将琼脂平板储存于5 °C备用。
- 从-80 °C保存的甘油菌种中挑取白色念珠菌（C. albicans）血清型A菌株CAI4+CIp10，划线接种至SC-Ura琼脂平板上。
- 于30 °C培养至菌落形成，并将平板储存在5 °C。
- 挑取单个白色念珠菌（C. albicans）菌落，接种于5 ml SC-Ura液体培养基（配方同步骤1.1，但不加技术级琼脂）中，在30 °C、200 rpm条件下过夜培养，以获得处于稳定期的白色念珠菌（C. albicans）。
2. 使用异硫氰酸荧光素（FITC）对C. albicans进行染色
- 取10 μl C. albicans 过夜培养物加入990 μl PBS（pH 7.4）中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 为便于在吞噬实验中观察 C. albicans，将1 × 108 个 C. albicans 细胞用1 mg/ml FITC溶于0.05 M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）中，在室温避光条件下染色10分钟。
- 为去除未结合的FITC，将 C. albicans 用1 ml 1 × PBS洗涤，以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml 1 × PBS中。重复此步骤3次。
- 将沉淀以1 × 106 个细胞/μl的浓度重悬于1 × PBS中。
3. J774.1 小鼠巨噬细胞系的制备
- 将 J774.1 巨噬细胞在含有 10% (v/v) 胎牛血清 (FCS)、200 U/ml 青霉素/链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺的 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养于 75 cm2 组织培养瓶中。原代巨噬细胞的制备方法已在其他文献中详细描述12, 13。
- 用刮取法将 J774.1 细胞从组织培养瓶中收集，并转移至 50 ml Falcon 管中。以 600 × g 离心 5 分钟，获得细胞沉淀。
- 吸除上清液，将沉淀重悬于 10 ml 预热的完全 DMEM 培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并将 1 × 106 个 J774.1 巨噬细胞接种于含 2 ml 完全 DMEM 培养基的 35 mm 玻璃底成像培养皿中。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 成像前，将完全 DMEM 培养基更换为 2 ml 预热的含 1 μM LysoTracker Red DND-99 的 CO2-非依赖性完全培养基（含 10% (v/v) 胎牛血清 (FCS)、200 U/ml 青霉素/链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺）。
4. 活细胞视频显微镜吞噬作用检测
- 显微镜的选择将取决于本地可用的设备，但显微镜配置必须包含倒置载物台、加热至37 °C的环境控制培养室，以及适用于所选染料（FITC和TRITC）的激发/发射滤光片。
- 实验前开启显微镜加热器，并预留足够时间使环境控制培养室升温至37 °C。不同显微镜系统的培养室温度稳定所需时间可能有所不同。
- 开启显微镜和计算机，加载成像软件。将成像培养皿安装到显微镜载物台上，调节焦距以找到J774.1巨噬细胞。通过调整透射光百分比和曝光时间，优化TRITC和DIC图像的显示效果。
- 取下成像培养皿，向其中加入3 × 106个FITC标记的C. albicans。记录加入C. albicans的时间。将培养皿放回载物台，必要时优化FITC图像的显示。如需，设置多个成像位点列表。
- 当所有位点均处于焦平面且各通道参数已优化后，开始成像。每分钟采集一次FITC、TRITC和DIC图像，持续6小时。
结果
此处我们展示具有代表性的实验结果 C. albicans 在6小时的活细胞视频显微实验中，由小鼠巨噬细胞系J774.1介导的摄取 图1 是一个代表性的活细胞视频显微镜录像，显示吞噬作用的 C. albicans 由小鼠J774.1巨噬细胞进行活细胞视频显微镜观察，可实现内吞作用的实时监测。 C. albicans 无需染色即可观察外部结构 假丝酵母 然而，在这些实验过程中， C. albicans 使用pH敏感性染料FITC（绿色）进行染色，该染料在巨噬细胞吞噬体酸化过程中会发生荧光淬灭，从而有助于确认 假丝酵母 已被内化（图1）。为进一步帮助观察摄入的 白色念珠菌， 使用红色荧光染料LysoTracker red DND-99对巨噬细胞进行染色，该染料可标记酸性区室，作为吞噬体成熟的一种非特异性标志物。 图2 是活细胞视频显微实验中的一帧静态图像，展示了细胞数量的变化情况 C. albicans 被单个 J774.1 巨噬细胞吞噬。在此实验中，82% 的 J774.1 巨噬细胞吞噬了至少一个 C. albicans 6小时吞噬实验结束时的细胞。在 图3，内化数量 C. albicans 每个巨噬细胞的细胞数被报告。平均细胞数为 C. albicans 每个巨噬细胞摄取的真菌细胞数量为3.4，但有趣的是，巨噬细胞最多可吞噬多达16个真菌细胞。 图4 是一段来自典型活细胞视频显微实验的静态图像序列，显示巨噬细胞吞噬过程 C. albicans 细胞，菌丝在巨噬细胞内生长并最终导致巨噬细胞裂解。 图4 视频显微技术能够实现对靶细胞被吞噬后事件的分析， 即 巨噬细胞被杀伤的数据可被生成 C. albicans 菌丝与被吞噬靶细胞的数量及形态发生之间的关系，以及巨噬细胞杀伤作用与吞噬体成熟之间的关联，后者可进行实时研究。
图1. 活细胞视频显微镜录像，显示小鼠J774.1巨噬细胞对C. albicans的吞噬作用。C. albicans用FITC（绿色）染色，巨噬细胞用红色荧光染料LysoTracker Red DND-99染色。巨噬细胞与C. albicans在完全不含CO2的培养基中于37 °C共培养6小时，每1分钟采集一次图像。可见巨噬细胞与C. albicans之间形成细胞间接触，随后C. albicans被摄入巨噬细胞的吞噬体中。箭头指示J774.1巨噬细胞吞噬前的C. albicans。该视频还显示，C. albicans被吞噬后，FITC荧光发生淬灭。比例尺：10 μm。 点击此处观看视频。
图2. 代表性活细胞视频显微镜静态图像，显示细胞数量的差异 C.albicans 被单个巨噬细胞吞噬。巨噬细胞（使用 LysoTracker Red DND-99 染色）与 FITC 染色的 C. albicans （绿色）。数量上存在差异 C. albicans 吞噬（箭头旁的数字表示数量） C. albicans 吞噬），以及在 C. albicans 形态学（即 酵母相与菌丝相。比例尺， 20 μm.
图 3. 显示在6小时吞噬实验结束时，每个J774.1小鼠巨噬细胞吞噬的C. albicans数量的图表。数据来自2次独立实验。每次实验从3个视野中计数100个巨噬细胞，共统计了600个单独的巨噬细胞。
图 4. 一系列来自典型活细胞视频显微镜实验的图像，显示巨噬细胞（M）与C. albicans（C）在识别前及识别过程中（A，B），以及吞噬过程中和吞噬后（C，D）的情况。C. albicans菌丝在巨噬细胞内持续生长（E，F），可能导致巨噬细胞裂解（G）。其他巨噬细胞被募集至破裂部位，并试图吞噬释放出的C. albicans（H）。巨噬细胞使用红色荧光染料LysoTracker Red DND-99染色，C. albicans则用FITC（绿色）染色。注意，J774.1巨噬细胞吞噬C. albicans后，FITC荧光信号被淬灭（C）。比例尺：10 μm。
讨论
本文描述了利用活细胞视频显微镜研究巨噬细胞吞噬作用的方法。视频显微镜为分析提供了多层面的附加信息。一个基本优势是，单次实验即可在整个6小时观察期内任意时间点获取吞噬数据。更重要的是，所描述的方法能够对吞噬作用的各个独立阶段进行差异分析。例如，我们已证明，巨噬细胞系和原代巨噬细胞对C. albicans糖基化和形态发生突变株的整体吞噬变化，可能是由于巨噬细胞向靶细胞迁移能力的改变，或是在细胞间接触建立后吞噬速率变化所致7。
进行这些实验时需避免若干常见问题。首先，确保整个实验过程中环境条件的稳定至关重要。最佳方法是在实验开始前数小时，将环境控制室预先设置至实验所需条件。视频质量高度依赖于先进的模块，这些模块利用红外激光自动维持样品的Z轴位置，无论机械或温度如何变化，均可消除手动调焦的需要。
由于实验时间较长，限制激光照射以及相关的光漂白和光转化效应非常重要，可通过使用高荧光标记物来最小化这些影响，从而实现较短的曝光时间。本文所述的FITC染色方案快速且可靠。由于FITC是一种非常明亮且稳定的染料，所需曝光时间短，因此非常适合长时间的延时成像。然而，我们常规使用多种不同的靶向染料，包括Calcofluor White、PKH染料以及标记的生物体。
我们的大部分已发表工作均使用宽场显微镜完成，但通过使用转盘共聚焦显微镜可进一步减少光暴露，在我们的实践中，这对延时三维视频显微镜成像是至关重要的。
在本研究中，吞噬实验持续6小时，图像以每1分钟一次的间隔进行采集。图像之间的间隔可根据所研究的过程进行调整。例如，在研究囊泡运输等快速过程时，可以缩短时间间隔。最短时间间隔将受限于显微镜和相机的性能参数。调整时间间隔时需考虑以下因素：首先，缩短图像采集间隔会导致可成像的时间点减少，并显著增加文件大小；相反，若图像间隔过长，则会使视频失去连续性。
原则上，该方法可应用于研究其他病原体以及宿主凋亡细胞的摄取过程。例如，我们最近发现，唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（sialoadhesin）缺陷小鼠骨髓来源的巨噬细胞对唾液酸化Campylobacter jejuni的结合和吞噬能力显著降低8。然而，靶标大小是决定可行性的重要因素，因为随着靶细胞尺寸减小，图像分析将变得愈发困难。快速进行活细胞显微视频分析必须依赖先进的图像分析软件，并应结合适当的生物信息学支持，以促进开发用于研究单个细胞及整个细胞群体迁移行为的算法7。活细胞视频显微技术结合先进的图像分析软件，可对巨噬细胞与C. albicans之间的迁移过程及个体相互作用进行分钟级动态分析，从而深入揭示巨噬细胞吞噬C. albicans过程的复杂性。这些方法具有巨大潜力，可进一步拓展用于研究其他病原体和吞噬细胞（如树突状细胞、中性粒细胞），并可发展三维视频显微技术，以更详细地观察细胞间相互作用，或在更接近生理状态的表面（如上皮细胞层和内皮细胞层）上进行成像。该技术属于研究宿主-病原体相互作用的下一代工具，将有助于获取关于多种动态生物学过程的精细时空信息。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。NG 获得吉利德科学公司（Gilead Sciences）提供的基础研究非限制性资助。LE 在早期药物开发方面担任葛兰素史克公司（GSK）的顾问。
致谢
LPE 是一位苏格兰高级临床研究员，感谢首席科学家办公室（SCD/03）提供的支持。本工作由惠康信托项目资助（LPE，089930）。NARG 获得惠康信托项目资助（080088）、设备资助（075470，用于 DeltaVision）以及欧盟第七框架计划（FP7-2007-2013）资助（HEALTH-F2-2010-260338-ALLFUN）。我们感谢阿伯丁大学影像平台，特别是 Kevin MacKenzie 提供的有益支持与建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含氨基酸的酵母氮源基础培养基 | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| 腺嘌呤半硫酸盐 | Sigma | A3159-25G | |
| 技术级琼脂（3号） | Oxoid | LP0013 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura 缺陷型培养基 | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| 碳酸钠 | BDH | 301215M | |
| 碳酸氢钠 | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| 青霉素/链霉素 | PAA | P11-010 | |
| L-谷氨酰胺 | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm 玻璃培养皿 | PAA | PAA12305160X |
参考文献
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