采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。
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本文内容
摘要
摘要
活细胞成像可用于比较源自不同遗传工程小鼠乳腺癌模型的原代癌前乳腺上皮细胞在培养中的行为差异。例如，可对携带特定基因突变的细胞进行量化和比较，包括细胞分裂间隔时间（细胞寿命）、凋亡细胞数量、形态学变化的演变过程以及集落形成机制。原代乳腺上皮细胞培养物来源于未触及肿瘤的乳腺组织。手术时需仔细分离乳腺组织，避免邻近肌肉组织混入，去除淋巴结后，通过切碎乳腺组织并经酶解离和过滤，获得富集的乳腺上皮单细胞悬液。将单细胞悬液接种后，立即置于培养箱内的显微镜下进行活细胞成像。在6孔板的每个孔中，以4×4阵列选取16个650 μm × 700 μm的视野，每15分钟拍摄一次，持续5天。通过直接观察延时图像，可测量细胞行为，包括细胞接种后最初24小时内集落形成的机制与频率（细胞聚集或细胞增殖）、凋亡发生率以及形态学变化的时相特征。采用单细胞追踪技术生成细胞命运图谱，用于测定单个细胞的寿命并分析细胞分裂模式。定量数据通过统计学方法分析，以评估不同基因突变所导致的细胞行为差异是否具有显著性。
引言
转基因小鼠模型是用于研究和理解不同遗传损伤如何影响乳腺癌发病风险的工具。例如，转基因小鼠研究表明，三个因素的共同作用：乳腺癌1号基因全长缺失（Brca1）在乳腺上皮细胞中的缺失、肿瘤蛋白p53（Tp53）生殖系单倍体不足，以及乳腺上皮细胞靶向上调雌激素受体α（ERa）的表达，可导致100%的Brca1floxed (f)11/f11/小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)-Cre/p53+/-/四环素操纵子 (tet-op)-ER/小鼠乳腺肿瘤病毒-反向四环素转录激活因子 (rtTA小鼠在12月龄前发生乳腺癌，相比之下，Brca1f11/f11/MMTV-Cre/p53+/-小鼠未过表达ERa时的发病率较低（约50–60%），而Brca1f11/f11/MMTV-Cre小鼠在无Tp53单倍体不足的情况下发病率则更低（<5%）1。
对癌前体乳腺上皮细胞行为进行动态延时成像，可揭示在静态组织切片中较难察觉的细胞行为差异。在携带人类BRCA1基因突变的个体来源的原代乳腺细胞中，可观察到增殖与分化方面的改变。2 通过酶解法解离切除的乳腺组织，可从正常小鼠及基因工程小鼠中制备原代乳腺上皮细胞的单细胞悬液。3 借助延时图像分析，可评估细胞克隆出现的机制与时间....
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方案
1. 总体方案
- 从基因工程小鼠和对照野生型小鼠的乳腺组织中建立癌前乳腺上皮细胞的原代培养体系。
- 使用 Volocity 图像采集软件（版本 5.3.1，PerkinElmer，Waltham，MA）每 15 分钟采集一次活细胞图像，持续最长 5 天。
- 直接观察延时图像，评估上皮细胞克隆形成的时序与机制、凋亡发生率以及形态学变化的阶段特征。
- 使用 MetaMorph 显微镜自动化与图像分析软件（Molecular Devices, LLC，Sunnyvale，CA）将 Volocity 生成的 .TIFF 图像序列转换为 .JPG 文件，并使用 THE Rename 软件（版本 2.1.6，http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml）重命名数字图像文件，以适配 Timm's Tracking Tool 软件（TTT，http://www.helmho....
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结果
上皮细胞和成纤维细胞可通过细胞形态进行区分。上皮细胞呈立方状（图1A-B），并形成细胞集落（图1A）。成纤维细胞是一种间质细胞，具有细长的形态（图1C）。
成像开始时，细胞呈圆形并悬浮生长（图 2A-D）。贴壁后，细胞变扁平，呈现立方样形态（图 2E, H）。培养至第4天时，大多数上皮细胞伸长，呈现出类似上皮-间质转化（EMT）的形态（图 2I-L）。这种变化在所有研究的基因型中均以相同的时间进程发生。部分数字图像模糊，原因是科勒照明和相差环未正确调节（图 2D, H, L）。
接种后24小时，悬浮细胞形成了明确的单个上皮细胞克隆（图3A，B）。连续图像分析显示，这些克隆是通过细胞聚集而非细胞分裂形成的。单独破坏Brca1基因并不影响形成.......
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讨论
关键步骤
为控制年龄相关因素对乳腺上皮细胞行为的影响，必须确保从小鼠中采集乳腺组织时使用相同年龄的小鼠。在接种细胞时，每次实验的每个孔中应接种相同数量的细胞。接种时细胞密度应相对较低，以避免培养物过快达到汇合状态，从而能够通过连续成像追踪多个单个细胞。在成像前，必须将培养板在培养箱中充分平衡，因为培养板平衡后焦点会发生变化。一旦开始成像，应频繁检查并根据需要调整焦点，尤其是在前24小时内。培养箱的温度必须精确调控并预先预热。应尽可能减少进出房间的人员数量。我们建议在正式实验前预先练习实验设置的各个环节，以确保实验的可重复性和质量控制。与所有细胞培养实验一样，无菌操作至关重要，必须始终遵循标准的无菌细胞培养操作规范。
保存和处理大型图像文件需要大量的存储空间。可以使用共享网络驱动器或便携式硬盘。文件转换完成后，务必确保图像文件被正确且一致地命名，并存放在相应的文件夹中。在整个过程中，应频繁保存数字数据。
局限性
该方法采用二维培养.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢吴博凡和Christian Raithel提供的技术支持，以及Michael Rieger对活细胞成像技术的指导。本研究得到以下资助：美国国家癌症研究所（NCI）、美国国立卫生研究院（NIH）RO1CA112176（P.A.F.），美国国家癌症研究所（NCI）、美国国立卫生研究院（NIH）R01CA89041-10S1（P.A.F.），德国学术交流中心（Deutscher Akademischer Austaush Dienst e.V.）A/09/72227 号项目（编号316，R.E.N.），美国国防部资助项目W81XWH-11-1-0074（R.E.N.），韩国教育科技部通过国家研究基金会资助的世界一流大学（WCU）项目（R31-10069）（P.A.F.），美国国立卫生研究院（NIH）IG20 RR025828-01（啮齿类屏障设施设备），以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NIH NCI）5P30CA051008（显微成像与动物共享资源）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EpiCult-B 培养基 小鼠 | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B 增殖添加剂 小鼠 | StemCell Technologies | 05612 | |
| 重组人表皮生长因子（rhEGF） | StemCell Technologies | 02633 | |
| 胶原酶/透明质酸酶 | StemCell Technologies | 07912 | |
| 一次性解剖刀片 | Feather | 2975#10 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 | StemCell Technologies | 37150 | |
| 氯化铵 | StemCell Technologies | 07800 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| 中性蛋白酶 | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm 细胞滤器 | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140 |
参考文献
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al.
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重印与许可
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