患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

摘要

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133^-主体细胞中分选出CD133⁺的黑色素瘤干细胞样细胞。

摘要

尽管目前黑色素瘤的治疗选择已有所改善，但晚期恶性黑色素瘤患者的无进展生存期和总生存期预后仍然较差。因此，转化医学研究需要提供进一步的分子证据，以改进针对恶性黑色素瘤的靶向治疗。过去，与黑色素瘤相关的致癌机制主要在已建立的细胞系中进行了广泛研究。为了迈向基于个体基因谱的更个性化治疗方案，我们建议使用患者来源的细胞系，而非通用型细胞系。结合高质量的临床数据，尤其是患者的随访信息，这些细胞将有助于更深入地理解黑色素瘤进展背后的分子机制。

本文报道了从分离的新鲜肿瘤组织中建立黑色素瘤原代培养细胞的方法。该操作步骤包括将组织切碎并解离为单个细胞，去除红细胞和成纤维细胞的污染，以及进行原代培养，并可靠地验证细胞的黑色素瘤来源。

近期研究发现，黑色素瘤与大多数肿瘤类似，其内部存在一小群肿瘤干细胞（CSCs），这类细胞似乎是驱动肿瘤发生及其向转移状态进展的唯一来源。在黑色素瘤中，用于识别和分离肿瘤干细胞的关键标志物之一是CD133。为了从原代黑色素瘤培养物中分离CD133⁺肿瘤干细胞，我们对Miltenyi公司的磁性激活细胞分选（MACS）技术进行了改进和优化，从而实现了高纯度分选，并获得了高活性的CD133⁺肿瘤干细胞及CD133^-主体细胞群，这些细胞可进一步用于培养和功能分析。

引言

皮肤恶性黑色素瘤是皮肤癌中最少见但最致命的类型。由于发病率不断上升、恶性程度高且扩散迅速，黑色素瘤目前已占皮肤恶性肿瘤相关死亡病例的75%^1,2。除原发肿瘤的手术切除外，化疗、放疗、免疫治疗以及针对转移性黑色素瘤的联合化疗与免疫治疗，是当前黑色素瘤治疗的主流策略^3,4。然而，恶性黑色素瘤对化疗药物的应答率较低（5–12%）^5,6，仅有携带BRAF V600E基因突变的50–70%患者能从维莫非尼等新型靶向治疗中获益⁷。为了提高总体生存率，迫切需要更深入地理解黑色素瘤发生发展的机制。

过去研究这些机制时，通常使用已建立的商业化细胞系。近年来，研究癌症发生和进展分子事件的新方法则采用直接从肿瘤组织获取的原代培养细胞——这一策略具有多种优势：研究者可完全掌控患者和组织的选择；从经过专业筛选的肿瘤组织中获得的细胞能够真实再现肿瘤的全部异质性，同时患者的随访数据和详细的病理信息也可获取，从而可将培养细胞的特性与原始肿瘤的特性进行比较⁸。

相比之下，关于使用已建立的细胞系作为癌症研究中相关模型系统的有效性，学界仍存在争议。早在1987年，Osborne 及其同事就描述了来自不同实验室的 MCF-7 人乳腺癌细胞系之间存在显著的生物学差异⁹。Hiorns et al. 后续研究证实了这些....

方案

实验的整体方案包括从肿瘤组织中制备原代单细胞、原代细胞培养物的表征、成纤维细胞去除以及CD133⁺和CD133^-黑色素瘤细胞的磁性细胞分选，如图1所示。

1. 样品获取

1. 在考虑下一步操作前，需确认已获得伦理批准。
2. 准备一个50 ml离心管，加入含1%青霉素-链霉素终浓度的无菌PBS，并交予手术手术室团队。
3. 安排将肿瘤组织从手术室快速转运至细胞培养实验室，运输温度为4 °C。

2. 从肿瘤组织制备原代黑色素瘤单细胞

1. 所有步骤均需在无菌条件下进行。
2. 在切除肿瘤之前，需准备消化液。每 2-4 g 组织需要 10 ml 消化液。该混合液可立即使用，或分装为 10 ml 每份，于 -20 °C 保存以备后续使用。
   1. 配制含有 150 mM 氯化钠的溶液。使用涡旋振荡器混匀，直至溶液澄清。如有必要，使用 0.22 μm 滤器对氯化钠溶液进行无菌过滤。
   2. 称取 DNase I，用 150 mM 氯化钠溶液配制成 10 mg/ml 的 DNase I 溶液。通过反复倒置混匀，直至溶液澄清。
   3. 用 PBS 配制含有 100 mg/ml Collagenase IV 的溶液。通过反复....

结果

肿瘤组织单细胞制备

图2展示了晚期黑色素瘤患者切除的淋巴结转移灶在机械解离成2-4 mm组织块之前（A）和之后（B）的示例。组织经酶解消化后，通过70 μm尼龙滤网过滤，细胞被离心沉淀，上清液弃去。在此步骤中，我们观察到红细胞污染严重，如图2C中细胞沉淀呈现红色所示。随后，我们去除了红细胞，得到浅棕色的细胞沉淀（图2D）。将这些细胞重悬后，用Quantum 263培养基在37 °C和5% CO₂条件下进行培养。

原代细胞培养物的表征

为了验证细胞来源于肿瘤组织而非周围间质，我们对黑色素细胞/黑色素瘤、成纤维细胞、树突状细胞及干细胞标志基因进行了RT-PCR检测。成体黑色素细胞作为TYR的正常对照细胞，而胚胎癌细胞系NCCIT则作为干细胞标志物CD133的阳性对照。如图3所示的PCR结果表明，部.......

讨论

为了去除肿瘤细胞沉淀中的红细胞污染，我们强烈推荐使用 Miltenyi 公司的红细胞裂解液。与传统的 Ficoll 密度梯度离心法相比，裂解红细胞的方法具有更快、更简便的优点。此外，该方法可避免 Ficoll 或红细胞的残留污染，同时防止肿瘤细胞丢失。在原代细胞培养过程中，若观察到成纤维细胞生长，应立即清除，因为若等待时间过长，成纤维细胞通常会过度生长并抑制肿瘤细胞的增殖。

使用 Miltenyi 的 MACS 技术分选细胞时，我们建议通过酶解法收获细胞。虽然使用细胞刮刀对细胞及其表面表位可能更温和，但会产生细胞碎片，这些碎片会非特异性地结合到 MACS 柱上并导致柱子堵塞。与传统的胰蛋白酶/EDTA 处理相比，Accutase 的优势包括减少细胞应激，从而提高细胞活力，并最大限度降低将外源性因子引入细胞培养物的风险。Accutase 制剂不含任何哺乳动物或重组细菌蛋白²⁸。

为防止抗体在细胞表面发生封端以及非特异性细胞标记，操作时应迅速进行，保持细胞处于低温环境，并使用预冷的溶液。所有孵育步骤均应在 2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
两性霉素B溶液，250 μg/mL，溶于去离子水	Sigma-Aldrich, Inc.	A2942-50ml
抗成纤维细胞微珠	Miltenyi Biotec GmbH	130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
胶原酶IV	Sigma-Aldrich, Inc.	C5138
DNase I	Applichem GmbH	A3778.0050
不含Ca、Mg的D-PBS	PAA Laboratories GmbH	H15-002
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
FBS Superior	Biochrom	S0615
人源间接CD133微珠试剂盒	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	包含：CD133/1(AC133)-生物素、抗生物素微珠和FcR阻断试剂
青霉素-链霉素溶液（液体，100倍浓缩）	Invitrogen GmbH	15140-122
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
红细胞裂解液（10倍浓缩）	Miltenyi Biotec GmbH	130-094-183
设备
细胞筛（70 μm）	BD Biosciences	352350
gentleMACS C管	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-237
gentleMACS组织解离仪	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-235
MACS分选器多用支架	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS分选柱 25 LS柱	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
MACSmix管式旋转混合器	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753
氯化钠	Merck KGaA	567440-1KG
预分离滤器	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407
QuadroMACS分选器	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976
Rotilabo注射器滤器（0.22 μm，PES）	Carl Roth GmbH & Co. KG	P668.1
Steritop-GP 过滤装置 500 ml	Miltenyi Biotec GmbH	SCGPS05RE