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方法文章

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

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DOI：

10.3791/50200

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2013年3月13日

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

本文内容

摘要

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。

摘要

尽管目前黑色素瘤的治疗选择已有所改善，但晚期恶性黑色素瘤患者的无进展生存期和总生存期预后仍然较差。因此，转化医学研究需要提供进一步的分子证据，以改进针对恶性黑色素瘤的靶向治疗。过去，与黑色素瘤相关的致癌机制主要在已建立的细胞系中进行了广泛研究。为了迈向基于个体基因谱的更个性化治疗方案，我们建议使用患者来源的细胞系，而非通用型细胞系。结合高质量的临床数据，尤其是患者的随访信息，这些细胞将有助于更深入地理解黑色素瘤进展背后的分子机制。

本文报道了从分离的新鲜肿瘤组织中建立黑色素瘤原代培养细胞的方法。该操作步骤包括将组织切碎并解离为单个细胞，去除红细胞和成纤维细胞的污染，以及进行原代培养，并可靠地验证细胞的黑色素瘤来源。

近期研究发现，黑色素瘤与大多数肿瘤类似，其内部存在一小群肿瘤干细胞（CSCs），这类细胞似乎是驱动肿瘤发生及其向转移状态进展的唯一来源。在黑色素瘤中，用于识别和分离肿瘤干细胞的关键标志物之一是CD133。为了从原代黑色素瘤培养物中分离CD133+肿瘤干细胞，我们对Miltenyi公司的磁性激活细胞分选（MACS）技术进行了改进和优化，从而实现了高纯度分选，并获得了高活性的CD133+肿瘤干细胞及CD133-主体细胞群，这些细胞可进一步用于培养和功能分析。

引言

皮肤恶性黑色素瘤是皮肤癌中最少见但最致命的类型。由于发病率不断上升、恶性程度高且扩散迅速，黑色素瘤目前已占皮肤恶性肿瘤相关死亡病例的75%1,2。除原发肿瘤的手术切除外，化疗、放疗、免疫治疗以及针对转移性黑色素瘤的联合化疗与免疫治疗，是当前黑色素瘤治疗的主流策略3,4。然而，恶性黑色素瘤对化疗药物的应答率较低（5–12%）5,6，仅有携带BRAF V600E基因突变的50–70%患者能从维莫非尼等新型靶向治疗中获益7。为了提高总体生存率，迫切需要更深入地理解黑色素瘤发生发展的机制。

过去研究这些机制时，通常使用已建立的商业化细胞系。近年来，研究癌症发生和进展分子事件的新方法则采用直接从肿瘤组织获取的原代培养细胞——这一策略具有多种优势：研究者可完全掌控患者和组织的选择；从经过专业筛选的肿瘤组织中获得的细胞能够真实再现肿瘤的全部异质性，同时患者的随访数据和详细的病理信息也可获取，从而可将培养细胞的特性与原始肿瘤的特性进行比较8。

相比之下，关于使用已建立的细胞系作为癌症研究中相关模型系统的有效性，学界仍存在争议。早在1987年，Osborne 及其同事就描述了来自不同实验室的 MCF-7 人乳腺癌细胞系之间存在显著的生物学差异9。Hiorns et al. 后续研究证实了这些细胞系在传代过程中存在广泛的基因组不稳定性及RNA表达的变异，为“细胞系在培养过程中会发生演化”的观点提供了支持性证据，从而削弱了此类已建立的细胞培养体系作为人类癌症模型的直接相关性10。

另一个长期以来被忽视的重要问题是，细胞培养物可能被无关的“错误”细胞污染或过度生长，这一问题早在二十多年前就已提出，当时的研究表明，大量细胞系受到了HeLa细胞的污染8,11。近年来，文献中再次揭示了因使用“错误”细胞系而导致的数据误读问题。MacLeod 等通过结合DNA图谱分析和分子细胞遗传学方法发现，在德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ）保存的252株新建立的肿瘤来源人源细胞系中，近18%存在种内或种间交叉污染12,13。

为了避免上述问题并利用前述优势，我们决定从新切除的转移灶中建立低传代黑色素瘤细胞系。

稳健的细胞分离与分析技术需要在生成单细胞悬液的同时，最大限度地限制细胞死亡并保护特征性表面蛋白不被破坏。一种用于将组织自动解离为单细胞悬液的台式仪器是 Miltenyi 公司生产的 gentleMACS Dissociator。当该仪器与 gentleMACS C 管及优化的解离溶液联合使用时，可在封闭系统中实现对肿瘤组织的有效且温和的解离，同时保留抗原表位并减少细胞损失。该仪器为多种特定应用提供了优化的预设程序，可标准化地制备黑色素瘤组织来源的单细胞悬液14。

近期的研究报告表明，大多数肿瘤中都存在一小部分所谓的肿瘤干细胞（CSCs），这些细胞具有独特的肿瘤起始能力和自我更新能力。在皮肤真皮层中发现能够产生黑色素细胞的干细胞后，研究者提出假设：这些细胞可能是黑色素瘤中肿瘤干细胞（CSCs）的来源，因为暴露于UVA辐射可能促使这些细胞发生恶性转化15。此类基因损伤的结果是产生兼具肿瘤细胞和干细胞特性的细胞。

在黑色素瘤中，CD13316-20 被提出作为代表肿瘤干细胞（CSCs）亚群的关键标志物之一。CD133（亦称为Prominin 1）属于五次跨膜糖蛋白家族，表达于造血干细胞、内皮祖细胞、神经元及胶质干细胞中21-23。CD133的表达与细胞不对称分裂相关24，且其糖基化表位在细胞分化过程中被证实会下调25。近期研究表明，CD133+ 黑色素瘤细胞具有自我更新和肿瘤起始能力19,20。

为了研究CD133+黑色素瘤肿瘤干细胞（CSCs）的潜在功能，我们对美天旎生物技术公司（Miltenyi Biotech）的磁性激活细胞分选（MACS）系统进行了改进和优化，以获得高纯度且具有活力的CD133+和CD133-细胞群体。

磁珠法细胞分离可用于负向筛选，如 Matheu 所示 等26 或如本文所示的阳性选择。在阳性选择过程中，特定的目标细胞类型， 例如 表达CD133的细胞通过与高度特异性抗体偶联的50 nm超顺磁性微珠（MicroBeads）进行磁性标记。在分离过程中，磁性标记的细胞在分离器的磁场作用下被保留在色谱柱内，而未标记的细胞则流出色谱柱。经过洗涤步骤后，将色谱柱移出分离器的磁场，目标细胞即可从色谱柱中洗脱。在阳性选择过程中使用的LS或MS色谱柱可获得高纯度的标记细胞与未标记细胞组分。相比之下，用于阴性选择的LD色谱柱所获得的标记组分纯度略低。由于其基质填充更为致密，这类色谱柱的流速较低，导致未标记细胞更易被困在柱内。因此，LD色谱柱仅应适用于对不需要的细胞亚群进行严格去除。阳性选择可通过直接磁性标记（抗体直接偶联至MicroBeads）或间接磁性标记（先与一抗孵育，再与MicroBeads孵育）实现。目前已有针对多种原发性肿瘤细胞（如前列腺癌细胞或黑色素瘤细胞）阳性选择的特异性MACS MicroBeads产品27.

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方案

实验的整体方案包括从肿瘤组织中制备原代单细胞、原代细胞培养物的表征、成纤维细胞去除以及CD133+和CD133-黑色素瘤细胞的磁性细胞分选，如图1所示。

1. 样品获取

  1. 在考虑下一步操作前，需确认已获得伦理批准。
  2. 准备一个50 ml离心管，加入含1%青霉素-链霉素终浓度的无菌PBS，并交予手术手术室团队。
  3. 安排将肿瘤组织从手术室快速转运至细胞培养实验室，运输温度为4 °C。

2. 从肿瘤组织制备原代黑色素瘤单细胞

  1. 所有步骤均需在无菌条件下进行。
  2. 在切除肿瘤之前，需准备消化液。每 2-4 g 组织需要 10 ml 消化液。该混合液可立即使用，或分装为 10 ml 每份，于 -20 °C 保存以备后续使用。
    1. 配制含有 150 mM 氯化钠的溶液。使用涡旋振荡器混匀，直至溶液澄清。如有必要，使用 0.22 μm 滤器对氯化钠溶液进行无菌过滤。
    2. 称取 DNase I，用 150 mM 氯化钠溶液配制成 10 mg/ml 的 DNase I 溶液。通过反复倒置混匀，直至溶液澄清。
    3. 用 PBS 配制含有 100 mg/ml Collagenase IV 的溶液。通过反复倒置混匀，直至溶液澄清。胶原酶溶液可分装后于 -20 °C 保存数月。
    4. 用 Quantum 263 培养基配制消化液，终浓度为 1% 青霉素-链霉素、1 mg/ml Collagenase IV 和 0.1 mg/ml DNase I。使用涡旋振荡器混匀。可选：若使用来源于皮肤的黑色素瘤组织，可在消化液中加入两性霉素 B 溶液，使其终浓度为 1.5 μg/ml 两性霉素 B。
  3. 将所需量的消化液、PBS 和 Quantum 263 培养基预热至 37 °C。
  4. 将肿瘤组织置于无菌培养皿中。吸除组织表面多余液体，加入 500 μl 消化液。使用新的无菌手术刀将肿瘤切成 2-4 mm 的小块。
  5. 将 2-4 g 切碎的肿瘤组织转移至 gentleMACS C 管中，加入 5 ml 消化液。用额外的 4.5 ml 消化液冲洗培养皿，并将残留的组织碎片一并加入 gentleMACS C 管中。
  6. 盖紧 gentleMACS C 管，将其倒置固定在 gentleMACS 解离仪的套筒上，运行程序 "h_tumor_01"。
  7. 将 gentleMACS C 管从解离仪上取下，在 37 °C 下持续旋转孵育 30 分钟。可使用 MACSmix 管式旋转仪以最高速度（12 rpm）旋转，或每 5 分钟手动翻转一次试管，以重新悬浮沉降的组织碎片。
  8. 将 gentleMACS C 管倒置固定在 gentleMACS 解离仪的套筒上，运行程序 "h_tumor_02"。
  9. 将 gentleMACS C 管从解离仪上取下，在 37 °C 下持续旋转孵育 30 分钟。可使用 MACSmix 管式旋转仪以最高速度（12 rpm）旋转，或每 5 分钟手动翻转一次试管，以重新悬浮沉降的组织碎片。
  10. 将 gentleMACS C 管倒置固定在 gentleMACS 解离仪的套筒上，运行程序 "h_tumor_03"。
  11. 将 gentleMACS C 管从解离仪上取下，重悬样品，并将细胞悬液通过置于 50 ml 离心管上的 70 μm 细胞筛。若滤器发生堵塞，可用无菌滤头轻轻搅动细胞悬液，直至全部液体通过滤器。
  12. 用 5 ml Quantum 263 培养基冲洗细胞筛。
  13. 可选：若滤器中仍有残留的组织碎片，可将碎片重悬于 Quantum 263 培养基中，并接种至适当的细胞培养皿中。于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育组织碎片。
  14. 弃去细胞筛，将含有消化后细胞悬液的 50 ml 管盖紧。在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
  15. 可选：若细胞沉淀因含有大量红细胞而呈红色，可将 10x 红细胞裂解液用双蒸水按 1:10 稀释，配制成 1x 红细胞裂解液。将细胞沉淀重悬于 500 μl PBS 中，加入 5 ml 1x 红细胞裂解液。涡旋振荡 5 秒，在室温下孵育 10 分钟。在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
  16. 用 Quantum 263 培养基重悬肿瘤细胞，并将细胞接种至适当的细胞培养瓶中。于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养肿瘤细胞，当细胞融合度达到 80% 时进行常规传代。

3. 原代细胞培养的表征与成纤维细胞去除

  1. 使用显微镜对原代细胞培养物进行表型分析。
  2. 收集少量原代细胞培养物（0.5×106 个细胞），并使用针对肿瘤性、黑色素瘤、干细胞和基质细胞标志物基因的引物进行 RT-PCR。需分析的最重要基因包括 CD90（成纤维细胞标志物）、TYR（黑色素瘤/黑色素细胞标志物）、CD133（肿瘤干细胞标志物）、CD83（成熟树突状细胞标志物）以及一个看家基因（例如 HPRT 或 GAPDH）。
  3. 如果显微镜分析和 RT-PCR 中 CD90 的高表达表明原代黑色素瘤培养物中存在大量成纤维细胞污染，则需使用 Miltenyi 的抗成纤维细胞 MicroBeads 和 D Columns 去除成纤维细胞。

4. 使用 LS 柱对 CD133+ 和 CD133- 黑色素瘤细胞进行磁性细胞分选

  1. 配制含2 mM EDTA和5% FCS的PBS缓冲液。通过倒置混匀，并使用0.22 μm Steritop-GP滤器单元进行无菌过滤。将缓冲液冷却至4–8 °C，并在使用前脱气。
  2. 将Accutase、PBS和Quantum 263培养基预热至37 °C。
  3. 用PBS洗涤80%融合度的细胞。加入适量Accutase，孵育至细胞从培养表面脱落。使用Quantum 263培养基将细胞收集至50 ml离心管中。
  4. 计数细胞，并以300 × g离心5分钟（温度4–8 °C），收集所需数量的细胞（根据Miltenyi的操作说明，每根LS柱最多可上样2×109个细胞；不同细胞系的最佳上样量需另行确定，通常可能显著低于此值）。完全吸除上清液。
  5. 将最多1×108个细胞重悬于350 μl MACS缓冲液中（若细胞数量更高，则按比例增加后续所有试剂体积，包括MACS缓冲液、FcR阻断试剂、CD133/1-Biotin和抗生物素微珠）。
  6. 加入100 μl FcR阻断试剂。
  7. 加入50 μl CD133/1-Biotin。使用涡旋振荡器充分混匀，在4–8 °C下孵育10分钟。
  8. 加入10 ml MACS缓冲液洗涤细胞，以300 × g离心5分钟（温度4–8 °C）。完全吸除上清液。
  9. 重复步骤（4.8）的洗涤操作。
  10. 将细胞沉淀重悬于400 μl MACS缓冲液中。
  11. 加入100 μl 抗生物素微珠（anti-Biotin MicroBeads）。使用涡旋振荡器充分混匀，在4–8 °C下孵育15分钟。
  12. 同时准备用于磁性分离的MACS分选仪。将QuadroMACS装置安装至MACS分选仪多联支架上。将所需数量的LS柱插入QuadroMACS的磁场中，确保柱翼朝前。在每根LS柱中放置一个预分选滤器（含30 μm尼龙网），并在每根柱下方放置合适的收集管（15 ml或50 ml）。用3 ml MACS缓冲液冲洗滤器和柱子以进行预处理，弃去穿流液。
  13. 加入10 ml MACS缓冲液洗涤细胞，以300 × g离心5分钟（温度4–8 °C）。完全吸除上清液。
  14. 将细胞重悬于500 μl MACS缓冲液中，并将细胞悬液通过预分选滤器加载至LS柱上。
  15. 每根柱用3 ml MACS缓冲液洗涤三次。仅当柱储液腔排空后才可加入新的缓冲液。
  16. 收集的总穿流液含有未标记的CD133−细胞组分。
  17. 弃去预分选滤器，从分选仪上取下柱子，并将其置于合适的收集管上。
  18. 加入5 ml MACS缓冲液。立即用力将推杆插入柱中，快速洗脱出标记的CD133+细胞。
  19. 为提高阴性组分的纯度，可将细胞悬液加载至另一根已平衡的LS柱（插入QuadroMACS装置中）。此时穿流液即为CD133−细胞组分。
  20. 弃去所有柱子。

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结果

肿瘤组织单细胞制备

图2展示了晚期黑色素瘤患者切除的淋巴结转移灶在机械解离成2-4 mm组织块之前（A）和之后（B）的示例。组织经酶解消化后，通过70 μm尼龙滤网过滤，细胞被离心沉淀，上清液弃去。在此步骤中，我们观察到红细胞污染严重，如图2C中细胞沉淀呈现红色所示。随后，我们去除了红细胞，得到浅棕色的细胞沉淀（图2D）。将这些细胞重悬后，用Quantum 263培养基在37 °C和5% CO2条件下进行培养。

原代细胞培养物的表征

为了验证细胞来源于肿瘤组织而非周围间质，我们对黑色素细胞/黑色素瘤、成纤维细胞、树突状细胞及干细胞标志基因进行了RT-PCR检测。成体黑色素细胞作为TYR的正常对照细胞，而胚胎癌细胞系NCCIT则作为干细胞标志物CD133的阳性对照。如图3所示的PCR结果表明，部...

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讨论

为了去除肿瘤细胞沉淀中的红细胞污染，我们强烈推荐使用 Miltenyi 公司的红细胞裂解液。与传统的 Ficoll 密度梯度离心法相比，裂解红细胞的方法具有更快、更简便的优点。此外，该方法可避免 Ficoll 或红细胞的残留污染，同时防止肿瘤细胞丢失。在原代细胞培养过程中，若观察到成纤维细胞生长，应立即清除，因为若等待时间过长，成纤维细胞通常会过度生长并抑制肿瘤细胞的增殖。

使用 Miltenyi 的 MACS 技术分选细胞时，我们建议通过酶解法收获细胞。虽然使用细胞刮刀对细胞及其表面表位可能更温和，但会产生细胞碎片，这些碎片会非特异性地结合到 MACS 柱上并导致柱子堵塞。与传统的胰蛋白酶/EDTA 处理相比，Accutase 的优势包括减少细胞应激，从而提高细胞活力，并最大限度降低将外源性因子引入细胞培养物的风险。Accutase 制剂不含任何哺乳动物或重组细菌蛋白28。

为防止抗体在细胞表面发生封端以及非特异性细胞标记，操作时应迅速进行，保持细胞处于低温环境，并使用预冷的溶液。所有孵育步骤均应在 2...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 M. Dietel 教授和 Dirk Schumacher 对本工作的支持以及对稿件的审阅。

这些研究成果获得了创新药物计划联合企业（Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking）在第n号资助协议下的支持° 115234，其资源由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的财政资助以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）各公司的实物捐助共同构成。本工作还得到了柏林癌症协会（Berliner Krebsgesellschaft, BKG）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007
两性霉素B溶液，250 μg/mL，溶于去离子水Sigma-Aldrich, Inc.A2942-50ml
抗成纤维细胞微珠Miltenyi Biotec GmbH130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)Miltenyi Biotec GmbH130-092-395
胶原酶IVSigma-Aldrich, Inc.C5138
DNase IApplichem GmbHA3778.0050
不含Ca、Mg的D-PBSPAA Laboratories GmbHH15-002
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）Sigma-Aldrich, Inc.E-7889
FBS SuperiorBiochromS0615
人源间接CD133微珠试剂盒Miltenyi Biotec GmbH130-091-895包含：CD133/1(AC133)-生物素、抗生物素微珠和FcR阻断试剂
青霉素-链霉素溶液（液体，100倍浓缩）Invitrogen GmbH15140-122
Quantum 263PAA Laboratories GmbHU15-815
红细胞裂解液（10倍浓缩）Miltenyi Biotec GmbH130-094-183
设备
细胞筛（70 μm）BD Biosciences352350
gentleMACS C管Miltenyi Biotec GmbH130-093-237
gentleMACS组织解离仪Miltenyi Biotec GmbH130-093-235
MACS分选器多用支架Miltenyi Biotec GmbH130-042-303
MACS分选柱 25 LS柱Miltenyi Biotec GmbH130-042-401
MACSmix管式旋转混合器Miltenyi Biotec GmbH130-090-753
氯化钠Merck KGaA567440-1KG
预分离滤器Miltenyi Biotec GmbH130-041-407
QuadroMACS分选器Miltenyi Biotec GmbH130-090-976
Rotilabo注射器滤器（0.22 μm，PES）Carl Roth GmbH & Co. KGP668.1
Steritop-GP 过滤装置 500 mlMiltenyi Biotec GmbHSCGPS05RE

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