线粒体相关内质网膜（MAMs）和糖鞘脂富集微区（GEMs）：从小鼠脑组织中分离

摘要

本实验步骤介绍了如何从成年小鼠脑组织中分离线粒体相关内质网膜（MAMs），以及从MAMs和线粒体组分中提取糖鞘脂富集的微结构域组分。

摘要

细胞内细胞器是高度动态的结构，其形态和组成各异，并受到细胞特异性的内在和外在信号调控。这些细胞器的膜常在特定的接触位点相互毗邻，形成信号分子和膜组分交换的枢纽。^1,2,3,4内质网（ER）与线粒体在IP3敏感性Ca通道开口处形成的细胞器间膜微区²⁺ 通道被称为线粒体相关内质网膜（MAMs）^4,5,6这些膜接触位点的蛋白质/脂质组成及其生物化学特性已被广泛研究，尤其是在其调控细胞内 Ca 的作用方面^{2+ 4,5,6}内质网是细胞内钙离子的主要储存场所²⁺，并以此调控钙信号下游的多种细胞过程²⁺ 信号转导，包括翻译后蛋白质折叠和蛋白质成熟7。另一方面，线粒体维持 Ca²⁺ 通过缓冲细胞质中的 Ca 维持稳态²⁺ 浓度，从而阻止钙离子下游凋亡通路的启动²⁺ 不平衡^4,8. MAMs 的动态特性使其成为解析包括 Ca 在内的基本细胞机制的理想位点²⁺ 线粒体钙信号传导与调控²⁺ 浓度、脂质生物合成与转运、能量代谢及细胞存活 ^4,9,10,11,12已有多种方案用于从肝组织和培养细胞中纯化这些微结构域^13,14.

在参考已有发表方法的基础上，我们改进了一种从成年小鼠脑组织中分离线粒体及线粒体相关内质网膜（MAM）的实验方案。在此基础上，我们增加了一个额外的纯化步骤，即Triton X100提取法，从而能够分离出MAM中富含糖鞘脂的微结构域（GEM）组分。这些GEM组分与来源于质膜或其他细胞内膜的小窝（caveolae）和脂筏（lipid rafts）具有多种相同的蛋白质成分，被认为在受体蛋白的聚集以及蛋白质-蛋白质相互作用过程中发挥聚集平台的功能^4,15。

方案

以下方案旨在从小鼠脑组织中分离和纯化MAMs与GEMs。

分离线粒体、线粒体相关内质网膜（MAM）和脂筏微结构域（GEM）所需的溶液。

差速离心法获得粗线粒体组分：

溶液 A： 0.32 M 蔗糖，1 mM NaHCO₃，1 mM MgCl₂，0.5 mM CaCl₂ + 蛋白酶抑制剂（根据需要新鲜添加）。

溶液B： 0.32 M 蔗糖，1 mM NaHCO₃ + 蛋白酶抑制剂（根据需要新鲜添加）。

线粒体相关内质网膜（MAMs）的分离：

分离培养基： 250 mM 甘露醇，5 mM HEPES（pH 7.4），0.5 mM EGTA，0.1% BSA。

梯度缓冲液： 225 mM 甘露醇，25 mM HEPES pH 7.5，1 mM EGTA，0.1% BSA（终浓度）。

GEMs 分....

结果

根据我们使用该方案的经验，我们可安全地推荐其用于从小鼠脑组织中分离和纯化线粒体相关内质网膜（MAMs）、糖脂微区（GEMs）以及线粒体组分。本方案所述操作步骤具有高度的可重复性和一致性。在图1中，我们展示了纯化线粒体和MAMs在Percoll梯度中分层的代表性图像（步骤3.4）。在超速离心管底部可见一条界限清晰、呈乳白色条带，其中含有纯化的线粒体（Mito-P）；而MAM组分则位于线粒体条带上方，表现为一条弥散且较宽的条带。在仔细回收各梯度条带后，将纯化的组分重悬于裂解缓冲液中，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转印至PVDF膜上。随后使用一系列针对特定蛋白标志物的抗体进行杂交，以确认各组分的纯度及其蛋白组成。图2A展示了细胞质、内质网（ER）和线粒体标志物在分离得到的MAMs和线粒体组分中的分布情况。纯化的线粒体制备物应不含内质网和细胞质标志物。由于MAM接触位点处内质网膜与线粒体膜紧密相邻，因此在这些纯化样品中可同时检测到钙连蛋白（calreticulin，ER标志物）和Tom-20（线粒体标志物）。此外，也可使用MAMs特异性标志物FACL4和PACS2，以及.......

讨论

细胞内膜之间或细胞器与细胞质膜之间的接触位点，构成了基本细胞过程的动态信号平台。准确表征这些位点在生理和病理条件下的功能与组成，需要可靠且可重复的纯化方案。本文详细描述的方法由本实验室专门优化，用于从小鼠成年脑组织中分离和纯化线粒体相关内质网膜（MAMs）及其相应的脂筏微区（GEMs）。该方案已成功应用于鉴定决定这些微区特性的分子效应因子，并揭示在儿童神经退行性代谢疾病中，由 Ca²⁺ 失衡引发的神经元细胞死亡的凋亡通路下游机制⁴。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
分级分离
蔗糖	Fisher Scientific	S5-500
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S-5761
氯化镁六水合物	Fisher Scientific	BP214-500
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C-5080
MAM
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-250G
牛血清白蛋白，第五组分，热激，冻干粉	Roche	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
GEM
吐温X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500 ml
氯化钠	Fisher Scientific	S271-3
Tris碱	Roche	03-118-142-001
HCl	Fisher Scientific	A144S-500
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
十二烷基硫酸钠（SDS）	Fisher Scientific	BP166-500
通用
蛋白酶抑制剂片剂，Complete，无EDTA	Roche	11-873-580-001
设备
2 ml 全玻璃杜氏组织研磨器	Kimble Chase	885300-0002
15 ml 聚丙烯圆底离心管，BD Falcon	BD	352097
30 ml 圆底玻璃离心管	Kimble Chase	45500-30
15 ml 圆底玻璃离心管	Kimble Chase	45500-15
超速离心管，Ultra-Clear，薄壁，14x89 mm	Beckman-Coulter	344059
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管，9"	Fisher Scientific	13-678-20C