快速比色法定性区分生物分子样品中的RNA与DNA

摘要

本文描述了一系列比色分析方法，用于快速区分潜在异质性生物分子样品中的蛋白质、RNA、DNA和还原糖。

摘要

生物化学实验通常需要在早期阶段准确了解潜在异质样本中的核酸、蛋白质及其他生物分子组分。核酸的检测可采用 通过 多种已确立的方法，包括分光光度法等分析方法（例如，A₂₆₀），荧光测定法（例如，荧光染料结合）或比色法（核苷特异性显色化学反应）。¹ 尽管它不能轻易区分RNA与DNA，A₂₆₀/A₂₈₀ 比值常被采用，因为它提供了一种简单且快速的方法² 核酸相对含量（在260 nm附近有主要吸收峰）与蛋白质相对含量（在280 nm附近有主要吸收峰）的评估。比值 < 0.8 被视为“纯”蛋白样品的指示值，而纯核酸（NA）的特征比值为 > 1.5³.

然而，在某些情况下，仅通过简单的紫外-可见光分光光度法测量难以明确或可靠地推断蛋白质/核酸（NA）的含量。例如：(i) 样品可能含有一种或多种芳香族氨基酸（如Trp、Tyr、Phe）含量较低的蛋白质，因而其在≈280 nm处的吸光度较弱，某些小型RNA结合蛋白即属于此类情况；(ii) 样品的A₂₆₀/A₂₈₀比值可能处于中等范围（~0.8 < ~1.5），此时蛋白质与核酸的相对含量难以判断，甚至可能反映出蛋白质与核酸组分之间存在高亲和力的结合。针对此类情况，本文介绍了一组比色分析方法，可用于快速区分可能含有多种生物分子的混合样品中的RNA、DNA以及还原糖。这些方法基于戊糖及其他碳水化合物对班氏试剂（Benedict's）、比尔试剂（Bial's，即地衣酚）和迪斯彻试剂（Dische's，即二苯胺）的不同反应特性；优化后的实验流程可在数分钟内完成，无需额外分离各组分。这些检测可平行进行，以区分RNA与DNA，并可指示葡萄糖、果糖和核糖等游离还原糖的存在（图1）。

引言

细胞生物学的大部分过程发生在 通过 涉及DNA和RNA的分子相互作用。⁴ 这些天然存在的核酸（NAs）相互作用，⁵ 与蛋白质⁶ 以及一系列小分子化合物和配体 体内 (例如二价阳离子⁷）。这些相互作用在动力学上可能为短暂或持久，在热力学强度上可表现为高、中至低亲和力，并且在化学性质和特异性方面也可能存在显著差异——某些结合关系具有较高的特异性（例如，DNA···转录因子，RNA···剪接因子），而其他相互作用则必然具有更广泛的通用性（例如DNA···细菌组蛋白样HU蛋白⁸）。与核酸的非特异性相互作用可能对实际应用产生影响 体外 涉及生物分子混合物的实验，因为在某些核酸（NAs）至少在部分实验条件（如离子强度、溶液pH值）下，有可能甚至很可能与目标生物分子发生关联。 等等).

以目的蛋白（POI）的生产为例 通过 重组蛋白在异源系统中的过表达 大肠杆菌 细胞培养；该操作几乎在所有结构生物学实验室中常规进行。⁹ 在准备进一步实验时，例如生化/生物物理表征、结晶， 等等，初始工作通常集中在获得足量的目标蛋白（POI），并尽可能使其纯度最高，理想情况下应为化学均一且生物物理上单分....

方案

1. 还原糖的本尼迪克特检测法

1. 配制适量的本尼迪克特试剂——940 mM 无水碳酸钠、588 mM 柠檬酸钠二水合物、68 mM 五水合硫酸铜(II)。该试剂可在室温（RT）下保存至少六个月，反应活性无明显变化。
2. 上述试剂为6倍浓缩液。因此，对于600 μl的反应体系，取100 μl本尼迪克特试剂加入一支洁净的1.5 ml微量离心管中例如，每份待检测样品使用 Eppendorf 品牌产品。
3. 向该试管中加入 10 μl 至 500 μl 的样品；最佳体积可根据初始试验中显色强度来确定。若样品量充足，则应在初步试验中从最大可能的样品体积开始即，总体反应体积的五分之六，本例中为500 μl样品），然后在后续检测中进行稀释。
4. 加入ddH₂O₂将溶液加至管中，使终体积达到 600 μl；通过涡旋振荡或移液混匀溶液。
5. 将样品在沸水浴中孵育20分钟。
6. 将加热后的样品从水浴中取出，在室温下冷却10分钟。
7. 将样品管离心 > 9,300 × g（Eppendorf FA45-24-11 固定角转子约 10,000 rpm）离心 5 分钟，以沉淀任何不溶性颗粒物质；此步骤对定量研究较重要，对定性研究相对次要。
8. 将该试管中的上清液分装至一支干净的比色皿中。
9. 用水作为空白样校准紫外-可见分光光度计。

结果

结果如图所示 图3 将这些比色测定法应用于已知参考化合物。图中展示了本氏（a）、比尔氏地衣酚（b）和迪斯彻氏二苯胺（c）测定法的代表性定性数据，以及这三种测定法的标准曲线。 图4在图3(a-c)中，左侧图示展示了使用相应反应性/非反应性分析物进行的阳性/阴性对照实验；这些可视化结果已展示 原位，置于比色皿中，具体操作如上文方案1-3所述。右侧子图展示了每种分析物的滴定系列结果。在本尼迪克特试验（a）中，阳性对照为核糖（0.42 mg/ml），阴性对照包括水、一种通用蛋白（0.75 mg/ml BSA）以及两种非还原糖（0.75 mg/ml DNA 和 12.5 mg/ml RNA）。在间苯二酚试验（b）中，阳性对照为核糖（0.15 mg/ml）、RNA（7.5 mg/ml）和DNA（0.45 mg/ml），阴性对照为水和BSA蛋白（0.45 mg/ml）。在二苯胺试验（c）中，小牛胸腺DNA（0.45 mg/ml）作为阳性对照，水、酵母提取RNA（7.5 mg/ml）、核糖（0.15 mg/ml）和BSA（0.45 mg/ml）作为阴性对照。最后，图（.......

讨论

本文介绍的比色分析方法提供了一种简单途径，可快速评估生物分子混合物的化学性质，这类混合物常见于从全细胞裂解液中纯化蛋白质、RNA 或复合物并为后续研究做准备的过程中。随着结构生物学日益追求更接近天然状态的组装体，样品异质性等挑战将愈发显著，这源于复杂且多组分的复合物本身带来的困难。超分子组装体通常仅具有边缘稳定性，其成功分离可能需要采用更温和的纯化条件（例如，剪接体 snRNP 复合物即如此^17,18）。在这些较温和的条件下，真实存在的和虚假的靶蛋白与核酸（POI···NA）相互作用均更有可能得以保留，从而干扰后续针对目标蛋白质或核酸的分析实验。必要的第一步是鉴定这些样品中所含化学组分的类型。

检测 RNA、DNA 和蛋白质的方法因分析物的含量与浓度、可用资源和时间限制而异，而 perhaps 最重要的是取决于研究者对分析物可能化学成分的先验知识。蛋白质类物质可通过多种成熟的方法进行检测，包括光谱学方法（A₂₈₀）、流体动力学（凝胶电泳）、化学/比色法¹⁹ (例如，肽键的双缩脲试.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水碳酸钠	Fisher Scientific	S263
柠檬酸钠二水合物	Sigma	S-4641
五水合硫酸铜(II)	VWR	VW3312-2
二水合地衣酚	Sigma-Aldrich	O1875
浓 HCl	VWR	BDH3030
六水合氯化铁	Sigma	F-2877
二苯胺	Aldrich	112763
冰醋酸	Fisher Scientific	A28
硫酸	Sigma-Aldrich	258105
乙醇	Koptec	V1101
核糖	Sigma	R-7500	H 中按 1% w/v 配制2O
来自面包酵母的核糖核酸（S. cerevisiae)	Sigma	R6750	以 H 为溶剂配制 10 mg/ml 的溶液2O；于 -20 保存 °C
脱氧核糖核酸（钠盐），来自小牛胸腺	Sigma	D1501	以10 mg/ml浓度溶于H中制备2O；于 4 ℃ 保存 °C
<强>试剂、仪器 &与安全 材料按其在实验方案部分出现的顺序列于下表中。除非另有说明（上文），所有试剂均可在常温常湿及正常光照条件下保存。对于下表未列出的任何物品（例如，微量离心管），标准生物化学实验室中常见的型号/规格均可使用（例如，Eppendorf品牌的1.5 ml微量离心管）。涉及离心步骤时应使用标准塑料微量离心管（例如，以在每个实验方案结束时沉淀颗粒物）。只要试管能够密封，对具体材质没有特殊要求；生化实验室中常见的聚丙烯试管即可良好使用。在安全与废物处理方面，配制、使用及处置含浓乙酸、盐酸或硫酸的溶液时，应遵循标准实验室安全措施（如佩戴护目镜、在通风橱中操作）。对于地衣酚（orcinol）或二苯胺（diphenylamine）等有机试剂，建议使用腈类手套而非常见的乳胶（天然橡胶）手套。