快速比色法定性区分生物分子样品中的RNA与DNA

摘要

本文描述了一系列比色分析方法，用于快速区分潜在异质性生物分子样品中的蛋白质、RNA、DNA和还原糖。

摘要

生物化学实验通常需要在早期阶段准确了解潜在异质样本中的核酸、蛋白质及其他生物分子组分。核酸的检测可采用 通过 多种已确立的方法，包括分光光度法等分析方法（例如，A₂₆₀），荧光测定法（例如，荧光染料结合）或比色法（核苷特异性显色化学反应）。¹ 尽管它不能轻易区分RNA与DNA，A₂₆₀/A₂₈₀ 比值常被采用，因为它提供了一种简单且快速的方法² 核酸相对含量（在260 nm附近有主要吸收峰）与蛋白质相对含量（在280 nm附近有主要吸收峰）的评估。比值 < 0.8 被视为“纯”蛋白样品的指示值，而纯核酸（NA）的特征比值为 > 1.5³.

然而，在某些情况下，仅通过简单的紫外-可见光分光光度法测量难以明确或可靠地推断蛋白质/核酸（NA）的含量。例如：(i) 样品可能含有一种或多种芳香族氨基酸（如Trp、Tyr、Phe）含量较低的蛋白质，因而其在≈280 nm处的吸光度较弱，某些小型RNA结合蛋白即属于此类情况；(ii) 样品的A₂₆₀/A₂₈₀比值可能处于中等范围（~0.8 < ~1.5），此时蛋白质与核酸的相对含量难以判断，甚至可能反映出蛋白质与核酸组分之间存在高亲和力的结合。针对此类情况，本文介绍了一组比色分析方法，可用于快速区分可能含有多种生物分子的混合样品中的RNA、DNA以及还原糖。这些方法基于戊糖及其他碳水化合物对班氏试剂（Benedict's）、比尔试剂（Bial's，即地衣酚）和迪斯彻试剂（Dische's，即二苯胺）的不同反应特性；优化后的实验流程可在数分钟内完成，无需额外分离各组分。这些检测可平行进行，以区分RNA与DNA，并可指示葡萄糖、果糖和核糖等游离还原糖的存在（图1）。

引言

细胞生物学的大部分过程发生在 通过 涉及DNA和RNA的分子相互作用。⁴ 这些天然存在的核酸（NAs）相互作用，⁵ 与蛋白质⁶ 以及一系列小分子化合物和配体 体内 (例如二价阳离子⁷）。这些相互作用在动力学上可能为短暂或持久，在热力学强度上可表现为高、中至低亲和力，并且在化学性质和特异性方面也可能存在显著差异——某些结合关系具有较高的特异性（例如，DNA···转录因子，RNA···剪接因子），而其他相互作用则必然具有更广泛的通用性（例如DNA···细菌组蛋白样HU蛋白⁸）。与核酸的非特异性相互作用可能对实际应用产生影响 体外 涉及生物分子混合物的实验，因为在某些核酸（NAs）至少在部分实验条件（如离子强度、溶液pH值）下，有可能甚至很可能与目标生物分子发生关联。 等等).

以目的蛋白（POI）的生产为例 通过 重组蛋白在异源系统中的过表达 大肠杆菌 细胞培养；该操作几乎在所有结构生物学实验室中常规进行。⁹ 在准备进一步实验时，例如生化/生物物理表征、结晶， 等等，初始工作通常集中在获得足量的目标蛋白（POI），并尽可能使其纯度最高，理想情况下应为化学均一且生物物理上单分散的样品。在宿主细胞破碎后，典型的纯化流程的早期阶段旨在将目标蛋白（POI）从其他细胞组分中分离出来 E. coli 蛋白质、核酸、细胞壁碎片以及细胞裂解物的其他组分。然而，由于多种物理化学原因，宿主核酸（NAs）可能与目标蛋白（POI）共同纯化——高碱性的POI可能非特异性地沉淀宿主DNA/RNA；POI可能具有通用的核酸结合活性（例如，上述人脐静脉内皮细胞（HU）；目的蛋白（POI）可能是一种相对特异的核酸结合蛋白，但会与宿主RNA或DNA发生交叉反应；宿主核酸可能与层析介质相互作用，从而与目的蛋白非特异性共洗脱；等等。宿主核酸对目的蛋白的非选择性、高亲和力结合可能带来棘手的问题，因为这些核酸杂质很可能干扰后续实验例如POI•RNA 结合的荧光各向异性检测¹⁰）。或者，偶然观察到的POI···NA相互作用也可能具有重要意义，因为这类相互作用能够揭示POI结合核酸的能力。无论核酸（NAs）是关键组分还是污染物，在开展下游实验前，都必须首先对共纯化的核酸进行定量，并鉴定其类型（DNA或RNA）。

存在多种分析方法可用于检测和定量样品中的核酸（NA）。目前可用的大多数方法在原理上基本分为分光光度法（例如，A₂₆₀ 吸光度值及 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值）、荧光法（例如，噻唑橙或其他荧光染料与核酸的结合）或比色法（核苷酸对可生成在电磁波谱紫外-可见光区有吸收的发色团的化学反应的敏感性），如 De Mey et al.¹ 近期所述。然而，许多此类定量方法无法实现对多核苷酸类型（RNA 或 DNA）进行关键鉴定。本文提供了一套比色测定方法，可快速鉴定蛋白质样品中核酸组分的类型。

此处所述方案可无需额外步骤分离潜在的核酸杂质，并依赖于还原糖的本尼迪克特检测法¹¹戊糖的间苯二酚比色法测定^12,13，以及二苯胺反应^14,15 2'-脱氧戊糖（图1 和 2）。本尼迪克特试验（图 2a) 利用醛糖的线性开链（醛）形式还原 Cu 的能力²⁺，同时将糖的羰基氧化为羧酸根，并生成 Cu₂生成不溶性的红色沉淀。该反应对游离还原糖呈阳性，例如醛糖和酮糖（后者可转化为相应的醛糖） 通过 烯二醇中间体），但不会与那些因共价连接在DNA或RNA多核苷酸骨架中而被锁定为环状结构的戊糖发生反应。由于该检测仅需游离的半缩醛官能团即可发生反应，其他可能在本实验中产生阳性结果、因而成为潜在干扰物的化合物包括α-羟基酮和短链低聚糖（例如 二糖麦芽糖）。Bial氏苯丙酮（图2b）和迪斯彻的二苯胺（图2c）反应基于多核苷酸骨架的初始破坏， 通过 核苷的脱嘌呤作用以及母体核苷酸在酸或碱催化下的进一步水解，生成2-呋喃甲醛（糠醛）衍生物；这些衍生物随后与多羟基苯酚类物质反应，例如与间苯二酚（Bial法）或二苯胺（Dische法）试剂反应，生成化学结构大多未知的有色缩合产物。Dische法对DNA与RNA的特异性源于以下事实：只有戊糖的2'-位脱氧时，才能被氧化为ω-羟基-γ-酮基丁酸醛，后者在酸性条件下进一步与二苯胺反应，生成亮蓝色缩合物。图 2c). 采用此处所述的简化方案，我们发现这些特异性针对糖类的比色反应能够区分RNA与DNA，还可指示生物分子样品中是否存在游离的还原糖，如葡萄糖、果糖或核糖。

方案

1. 还原糖的本尼迪克特检测法

1. 配制适量的本尼迪克特试剂——940 mM 无水碳酸钠、588 mM 柠檬酸钠二水合物、68 mM 五水合硫酸铜(II)。该试剂可在室温（RT）下保存至少六个月，反应活性无明显变化。
2. 上述试剂为6倍浓缩液。因此，对于600 μl的反应体系，取100 μl本尼迪克特试剂加入一支洁净的1.5 ml微量离心管中例如，每份待检测样品使用 Eppendorf 品牌产品。
3. 向该试管中加入 10 μl 至 500 μl 的样品；最佳体积可根据初始试验中显色强度来确定。若样品量充足，则应在初步试验中从最大可能的样品体积开始即，总体反应体积的五分之六，本例中为500 μl样品），然后在后续检测中进行稀释。
4. 加入ddH₂O₂将溶液加至管中，使终体积达到 600 μl；通过涡旋振荡或移液混匀溶液。
5. 将样品在沸水浴中孵育20分钟。
6. 将加热后的样品从水浴中取出，在室温下冷却10分钟。
7. 将样品管离心 > 9,300 × g（Eppendorf FA45-24-11 固定角转子约 10,000 rpm）离心 5 分钟，以沉淀任何不溶性颗粒物质；此步骤对定量研究较重要，对定性研究相对次要。
8. 将该试管中的上清液分装至一支干净的比色皿中。
9. 用水作为空白样校准紫外-可见分光光度计。
10. 在475 nm处测定该样品的吸光度。

2. 戊糖的Bial氏地衣酚测定法

1. 配制适量的新鲜Bial试剂——24.2 mM 间苯三酚一水合物（该化合物的结构见图2b）、6 M 盐酸、0.025% w/v 氯化铁六水合物。注意：若需长期保存，可将Bial试剂配制成两种独立的储备液：(i) 试剂A [0.05% w/v FeCl3•6H₂O溶于浓盐酸中] 和 (ii) 试剂B [422 mM 间苯三酚一水合物溶于95%乙醇中]。试剂A可在室温下保存六个月；试剂B需用铝箔包裹避光，于4 °C保存一个月。使用前按15 (A) : 1 (B) 的体积比混合两种储备液。
2. 上述试剂为2倍浓度。因此，对于1.0 ml的反应体系，每个待测样品应向洁净的1.5 ml微量离心管中加入500 μl Bial试剂。
3. 向该管中加入10 μl至500 μl的样品。根据上述注释1.3，若样品量充足，建议从最大可能的样品体积开始进行预实验（即，总体反应体积的一半，本例中为500 μl样品），然后逐步稀释。
4. 加入ddH₂O至终体积为1.0 ml，通过涡旋振荡或移液器吹打混匀溶液。
5. 将样品在沸水浴中孵育20分钟。
6. 从水浴中取出加热后的样品，在室温下冷却10分钟。
7. 将样品管在> 9,300 x g（Eppendorf FA45-24-11固定角转子约10,000 rpm）条件下离心5分钟，以沉淀任何不溶性颗粒物质；此步骤对定量研究比定性研究更为重要。
8. 将该管中的上清液分装至洁净的比色皿中，用于目视观察。
9. 进行半定量分析时，用水作为空白对照校正紫外-可见分光光度计，并测定比色皿样品在660 nm处的吸光度。

3. 用于2'-脱氧戊糖的Dische二苯胺检测法

1. 配制适量的Dische 二苯胺试剂——60 mM 二苯胺、11 M 冰醋酸、179 mM 硫酸、0.62% v/v 乙醇。该试剂可预先配制，并在室温下避光保存于暗色容器中，或用铝箔包裹以减少光照。由于该试剂对光敏感，不宜长期储存；但在实际操作中，每两到三个月重新配制一次，反应活性无明显变化。
2. 上述试剂为2倍浓缩液。因此，对于1.0 ml的反应体系，每个待测样品向一支洁净的1.5 ml微量离心管中加入500 μl Dische试剂。
3. 向该管中加入10 μl至500 μl的样品。根据上述注释1.3，若样品量充足，建议从最大可能的样品体积开始进行预实验（即，总体反应体积的一半，本例中为500 μl样品），然后逐步稀释。
4. 加入ddH₂O至终体积为1.0 ml，通过涡旋振荡或移液混匀溶液。
5. 将样品在沸水浴中孵育20分钟。
6. 从水浴中取出加热后的样品，在室温下冷却10分钟。
7. 将样品管在>9,300 x g（在Eppendorf FA45-24-11固定角转子中约10,000 rpm）条件下离心5分钟，以沉淀任何不溶性颗粒物质；此步骤对定量研究比定性研究更为重要。
8. 将该管中的上清液分装至洁净的比色皿中，用于目视检查。
9. 进行半定量分析时，用水作为空白对照校正紫外-可见分光光度计，并测定比色皿样品在600 nm处的吸光度。

4. 进一步使用说明

1. 以下类别的分子可作为各检测中阳性与阴性对照反应的合适参照化合物：
   • 班氏试剂 - 阳性 = 游离核糖、果糖、葡萄糖；阴性 = RNA、DNA、ATP 等等（任何缺乏游离还原糖官能团的糖类）
   • Bial氏试验阳性 = RNA例如 酵母提取物）、核糖、ATP、UMP；阴性对照＝牛血清白蛋白（BSA）或其他任何蛋白质
   • 迪斯彻试验阳性 = DNA例如 小牛胸腺）；阴性 = RNA，ATP， 等等（任何非2'-脱氧核苷酸）
2. 这些检测方法对蛋白质纯化过程中常用的化合物具有较强的耐受性；例如，常见的盐类如 NaCl、(NH₄)₂SO₄，以及还原剂如 DTT 和 β-巯基乙醇，通常不会显著干扰检测结果。₄)₂SO₄，以及 K₂SO₄ 未产生干扰，且反应通常不受稀释液成分的影响。若pH值过高呈强碱性，洗涤剂或变性剂（如尿素）可能会影响检测反应的活性；由于反应化学机制的原因（参见正文及其中的质子参与情况），Bial's和Dische's检测通常在中性至酸性pH范围内效果最佳。 图2b，c）。可能不理想的反应条件、疑似干扰物质， 等等应使用参比化合物进行阳性和阴性对照实验，逐案进行测试。

结果

结果如图所示 图3 将这些比色测定法应用于已知参考化合物。图中展示了本氏（a）、比尔氏地衣酚（b）和迪斯彻氏二苯胺（c）测定法的代表性定性数据，以及这三种测定法的标准曲线。 图4在图3(a-c)中，左侧图示展示了使用相应反应性/非反应性分析物进行的阳性/阴性对照实验；这些可视化结果已展示 原位，置于比色皿中，具体操作如上文方案1-3所述。右侧子图展示了每种分析物的滴定系列结果。在本尼迪克特试验（a）中，阳性对照为核糖（0.42 mg/ml），阴性对照包括水、一种通用蛋白（0.75 mg/ml BSA）以及两种非还原糖（0.75 mg/ml DNA 和 12.5 mg/ml RNA）。在间苯二酚试验（b）中，阳性对照为核糖（0.15 mg/ml）、RNA（7.5 mg/ml）和DNA（0.45 mg/ml），阴性对照为水和BSA蛋白（0.45 mg/ml）。在二苯胺试验（c）中，小牛胸腺DNA（0.45 mg/ml）作为阳性对照，水、酵母提取RNA（7.5 mg/ml）、核糖（0.15 mg/ml）和BSA（0.45 mg/ml）作为阴性对照。最后，图（...

讨论

本文介绍的比色分析方法提供了一种简单途径，可快速评估生物分子混合物的化学性质，这类混合物常见于从全细胞裂解液中纯化蛋白质、RNA 或复合物并为后续研究做准备的过程中。随着结构生物学日益追求更接近天然状态的组装体，样品异质性等挑战将愈发显著，这源于复杂且多组分的复合物本身带来的困难。超分子组装体通常仅具有边缘稳定性，其成功分离可能需要采用更温和的纯化条件（例如，剪接体 snRNP 复合物即如此^17,18）。在这些较温和的条件下，真实存在的和虚假的靶蛋白与核酸（POI···NA）相互作用均更有可能得以保留，从而干扰后续针对目标蛋白质或核酸的分析实验。必要的第一步是鉴定这些样品中所含化学组分的类型。

检测 RNA、DNA 和蛋白质的方法因分析物的含量与浓度、可用资源和时间限制而异，而 perhaps 最重要的是取决于研究者对分析物可能化学成分的先验知识。蛋白质类物质可通过多种成熟的方法进行检测，包括光谱学方法（A₂₈₀）、流体动力学（凝胶电泳）、化学/比色法¹⁹ (例如，肽键的双缩脲试...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水碳酸钠	Fisher Scientific	S263
柠檬酸钠二水合物	Sigma	S-4641
五水合硫酸铜(II)	VWR	VW3312-2
二水合地衣酚	Sigma-Aldrich	O1875
浓 HCl	VWR	BDH3030
六水合氯化铁	Sigma	F-2877
二苯胺	Aldrich	112763
冰醋酸	Fisher Scientific	A28
硫酸	Sigma-Aldrich	258105
乙醇	Koptec	V1101
核糖	Sigma	R-7500	H 中按 1% w/v 配制2O
来自面包酵母的核糖核酸（S. cerevisiae)	Sigma	R6750	以 H 为溶剂配制 10 mg/ml 的溶液2O；于 -20 保存 °C
脱氧核糖核酸（钠盐），来自小牛胸腺	Sigma	D1501	以10 mg/ml浓度溶于H中制备2O；于 4 ℃ 保存 °C
<强>试剂、仪器 &与安全 材料按其在实验方案部分出现的顺序列于下表中。除非另有说明（上文），所有试剂均可在常温常湿及正常光照条件下保存。对于下表未列出的任何物品（例如，微量离心管），标准生物化学实验室中常见的型号/规格均可使用（例如，Eppendorf品牌的1.5 ml微量离心管）。涉及离心步骤时应使用标准塑料微量离心管（例如，以在每个实验方案结束时沉淀颗粒物）。只要试管能够密封，对具体材质没有特殊要求；生化实验室中常见的聚丙烯试管即可良好使用。在安全与废物处理方面，配制、使用及处置含浓乙酸、盐酸或硫酸的溶液时，应遵循标准实验室安全措施（如佩戴护目镜、在通风橱中操作）。对于地衣酚（orcinol）或二苯胺（diphenylamine）等有机试剂，建议使用腈类手套而非常见的乳胶（天然橡胶）手套。